Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im HIV-Bereich zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung der genetischen Zusammensetzung von HIV-Proviren und verschiedenen Zelltypen. Insbesondere die Identifizierung von genetisch intakten und potenziell replikationskompetenten Personen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es uns ermöglicht, fast in voller Länge HIV-Proviren aus einzelnen HIV-infizierten Zellen zu verstärken und diese dann durch Sequenzierung der nächsten Generation zu sequenzieren.

Bereiten Sie zunächst alle Puffer wie im Textprotokoll beschrieben vor. Besorgen Sie sich ein Zellpellet und fügen Sie hundert Mikroliter Lysepuffer pro Million Zellen hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.

Lyse die Zellen durch Inkubation in einem thermischen Cycler bei 55 Grad Celsius für eine Stunde und fügen Sie dann 85 Grad Celsius für 15 Minuten. Um mit der Verstärkung einzelner HIV-1-DNA-Proviren zu beginnen, mischen Sie die Reagenzien für die erste Runde der PCR, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls aufgeführt. Fügen Sie 38 Mikroliter zu 85 Brunnen in eine 96 well PCR-Platte und beschriften Sie diese Platte als PCR 1.

Danach verschieben Sie die PCR 1-Platte in einen klaren Bereich, der für die Zugabe von genomischer DNA vorgesehen ist. Mit Trishydrochlorid verdünnen Sie die genomische DNA seriell aus einem Verhältnis von eins zu drei zu einem Verhältnis von eins zu 81 und stellen sie sicher, dass 45 Mikroliter jeder Verdünnung vorbereitet werden. Fügen Sie zwei Mikroliter verdünnter genomischer DNA zu jeder Probe gut und zwei Mikroliter Trishydrochlorid zu jedem negativen Kontrollbrunnen hinzu.

Versiegeln Sie die gesamte Platte bis auf die Positivkontrolle gut. Wechseln Sie als Nächstes zu einem Bereich, der für das Hinzufügen der Positivsteuerung vorgesehen ist. Fügen Sie zwei Mikroliter der Positivkontrolle in den entsprechenden Brunnen und versiegeln Sie dann die Platte vollständig.

Verwenden Sie einen PCR-Plattenspinner, um die PRC 1-Platte kurz zu drehen und restliche Inhalte von den Seiten der Brunnen herunterzuziehen. Führen Sie die PCR 1-Platte im Thermocycler wie im Textprotokoll beschrieben aus. Als nächstes mischen Sie die Reagenzien für die zweite Runde der PCR, wie in Tabelle 1 aufgeführt.

Fügen Sie 28 Mikroliter dieser PCR 2 Mischung zu 85 Brunnen einer neuen 96 well PCR Platte hinzu. Beschriften Sie diese Platte als PCR 2. Drehen Sie mit einem Plattenspinner die PCR 1-Platte kurz, um Restinhalte von den Seiten der Brunnen herunterzuziehen.

Fügen Sie 80 Mikroliter Trishydrochlorid zu jedem Brunnen dieser Platte hinzu. Danach verwenden Sie eine Mutli-Kanal-Pipette, um zwei Mikroliter von jedem Brunnen der PCR 1-Platte auf die entsprechenden Brunnen in der PCR 2-Platte zu übertragen. Versiegeln Sie die PCR 2 Platte mit einer klaren Klebefolie.

Drehen Sie die PCR 2-Platte im Plattenspinner kurz. Unterdessen die PCR 1-Platte mit einer Wärmedichtungsfolie für die Langzeitlagerung bei minus 20 Grad Celsius abdichten. Führen Sie die PCR 2-Platte in einem thermischen Cycler aus, wie im Textprotokoll beschrieben.

Drehen Sie dann kurz die PCR 2 Platte, um restliche Inhalte von den Seiten der Brunnen herunterzuziehen. Mit einer Mehrkanalpipette 60 Mikroliter Trishydrochlorid zu jedem Brunnen hinzufügen. Als nächstes führen Sie 15 Mikroliter von jedem Brunnen auf zwei 48 gut vorgefertigten ein Prozent Agarose-Gelen, die Ethidiumbromid enthalten.

Identifizieren Sie die Brunnen, die das verstärkte Produkt und ihre ungefähren Größen enthalten, und speichern Sie das Gelbild. Danach bestimmen Sie die Verdünnung, bei der nicht mehr als 30 Prozent der Brunnen für verstärkteprodukte Produkte positiv sind. Verwenden Sie zunächst einen Plattenspinner, um die PCR 2-Platte kurz zu drehen und alle Restinhalte von den Seiten der Brunnen herunterzuziehen.

40 Mikroliter aus den Brunnen mit verstärktem Produkt auf die entsprechenden Brunnen einer neuen 96 Well Midi Platte übertragen. Als nächstes legen Sie ein magnetisches Futter-basierte Reinigungskit, um sicherzustellen, dass die magnetischen Perlen auf Raumtemperatur zu bringen und eine frische Lösung von 80 Prozent Ethanol vorzubereiten. Sobald die Perlen Raumtemperatur wirbeln sie zu erreichen, um sicherzustellen, dass sie gründlich resuspended.

Mit einer Mehrkanalpipette 40 Mikroliter Perlen zu den 40 Mikrolitern des verstärkten Produkts in jedem Brunnen der Midi-Platte hinzufügen. Mischen Sie durch sanftes Pipettieren nach oben und unten 10 mal. Bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren.

Dann übertragen Sie die Platte auf einen magnetischen Ständer und lassen Sie sie für zwei Minuten ruhen. Entfernen und entsorgen Sie danach den Überstand. Mit der Platte noch auf dem Ständer, waschen Sie die Perlen, indem Sie zweihundert Mikroliter der 80 Prozent Ethanol-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen.

Bei Raumtemperatur 30 Sekunden inkubieren und dann den Überstand entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang einmal vom Hinzufügen des Ethanols bis zum Wegwerfen des Überstandes. Mit einer Mehrkanalpipette entfernen Sie überschüssiges Ethanol.

Lassen Sie die Perlen 15 Minuten trocknen. Entfernen Sie danach die Platte vom Ständer. Fügen Sie 30 Mikroliter Elutionspuffer zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie, indem Sie sanft 10 Mal nach oben und unten pfeifen.

Bei Raumtemperatur zwei Minuten inkubieren. Legen Sie die Platte wieder auf den Magnetischen Ständer und lassen Sie sie für zwei Minuten ruhen. Mit einer Mehrkanalpipette 25 Mikroliter des Überstandes auf die entsprechenden Brunnen einer neuen 96-Well-PCR-Platte übertragen.

Verwenden Sie als Nächstes ein Spektrenphotometer, um die ungefähre Konzentration jedes verstärkten DNA-Produkts zu bestimmen und aufzuzeichnen. Legen Sie ein doppelsträngiges DNA-Quantifizierungskit fest und verdünnen Sie den Puffer in sterilem DNAs-freiem Wasser auf ein Mal. Fügen Sie 99 Mikroliter des Puffers zu einer entsprechenden Anzahl leerer Brunnen in einer flachen Bodengewebekulturplatte hinzu.

Fügen Sie dann hundert Mikroliter Puffer zu drei leeren Brunnen hinzu. Für jedes zu messende verstärkte Produkt fügen Sie jedem bohrspeicherhaltigen Puffer einen Mikroliter gereinigter DNA in Dreifache hinzu. Verdünnung lambda Doppelstränge DNA 10-fach von zwei Nanogramm pro Mikroliter auf Null Null Nanogramm pro Mikroliter, um die Standards vorzubereiten.

Fügen Sie hundert Mikroliter jedes doppelsträngigen DNA-Standards zu drei Brunnen hinzu. Den Blütenstichein- bis Zweihunderter mit Puffer verdünnen. Fügen Sie schnell hundert Mikroliter zu jedem Brunnen hinzu, der eine Probe, leer oder Standard enthält, und mischen Sie sie durch Pipettieren nach oben und unten.

Danach die Platte mit Folie bedecken, um den Kontakt mit Licht zu vermeiden. Zeichnen Sie mit einem Mikroplattenleser die Blütenstandemission auf. Verwenden Sie die aufgezeichneten Messungen, um die Konzentration der doppelsträngigen DNA in jeder Probe zu bestimmen.

Dann verdünnen Sie jedes gereinigte Produkt mit Wasser auf eine Konzentration von null Punkt zwei Nanogramm pro Mikroliter. Nach verschachtelter PCR werden die verstärkten Produkte auf einem einprozentigen Agarose-Gel ausgeführt. Die Ausgangsqualität der PCR kann durch Inspektion der Steuerungen bestimmt werden.

Da Negativkontrollen, die verstärktes Produkt enthalten, auf eine Kontamination hinweisen und die Positivkontrollen ohne verstärktes Produkt auf eine unzureichende Amplifikation hindeuten. Nur Bohrungen laufen am Endpunkt verdünnt, die einzelne verstärkte Proviren enthalten, werden für die Sequenzierung berücksichtigt. Während Brunnen, die mehrere verstärkte Proviren unterschiedlicher Länge enthalten, in diesem Stadium visualisiert werden können, sollten sie nicht für die Sequenzierung ausgewählt werden.

Für die de novo Montage kann die Qualität der montierten Contigs auf ausreichende Tiefe und Gleichmäßigkeit der Abdeckung beurteilt werden. Gemischte Populationen können in diesem Stadium auch durch eine ungleichmäßige Abdeckung identifiziert werden. Die visuelle Darstellung der von einem Teilnehmer isolierten Sequenzen zeigt, dass 97 Prozent ihrer Sequenzen defekt sind.

Mit intakten Sequenzen in Effektor- und Übergangsspeicher CD4-positiven T-Zellen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass nur verstärkte Produkte, die bei der begrenzenden Verdünnung erhalten werden, d. h. wo nicht mehr als 30 Prozent der Brunnen positiv sind, ein einziges Provirus enthalten. Nach diesem Verfahren können verstärkte Produkte sequenziert werden, um die genetische Zusammensetzung von HIV-Proviren zu bestimmen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet von HIV, um die Verbreitung von genetisch intakten HIV-Proviren und verschiedenen Zelltypen bei Patienten in Therapie zu erforschen, um festzustellen, wo sich genetisch intakte und potenziell replikationskompetente Proviren verstecken. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit HIV-infizierten Zellen gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und die Arbeit eines zertifizierten Labors sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.