Name: Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Erfahren Sie die FLIPS-Methode zur Amplifikation nahezu vollständiger HIV-1-Proviren aus einzelnen infizierten Zellen für Next-Generation-Sequencing. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung replikationskompetenter Proviren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt die Delaney AIDS Research Enterprise (DARE) zur Heilung (1U19AI096109 und 1UM1AI126611-01); ein AmfAR Forschungskonsortium auf HIV Beseitigung (ARCHE) Collaborative Research Grant von der Foundation for AIDS Research (AmfAR 108074-50-RGRL); Australian Centre for HIV und Hepatitis-Virologie-Forschung (ACH2); UCSF-GIVI-Zentrum für AIDS-Forschung (P30 AI027763); und der australischen National Health and Medical Research Council (AAP1061681). Wir möchten danken Dr. Joey Lai, Genomik Facility Manager am Westmead Institut für medizinische Forschung für seine Ausbildung in Bibliothek Vorbereitung und Verwendung von seiner Anlage und Ramaciotti Centre for Genomics (University of New South.Wales, Sydney, Australien) für die Durchführung der Sequenzierung. Wir erkennen mit Dankbarkeit an die Teilnehmer, die Proben für diese Studie gespendet.

<ol><li>Bruner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+proviruses+rapidly+accumulate+during+acute+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).</li>
<li>Hiener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genetically+Intact+HIV-1+Proviruses+in+Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+from+Effectively+Treated+Participants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants.</a> Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).</li>
<li>Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+position%2C+and+frequency+of+mutations+made+in+a+single+cycle+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).</li>
<li>Ho, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+noninduced+proviruses+in+the+latent+reservoir+increase+barrier+to+HIV-1+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure.</a> Cell. 155 (3), 540-551 (2013).</li>
<li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li>
<li>Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermutation+of+HIV-1+DNA+in+the+absence+of+the+Vif+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein.</a> Science. 300 (5622), 1112(2003).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebound+of+plasma+viremia+following+cessation+of+antiretroviral+therapy+despite+profoundly+low+levels+of+HIV+reservoir%3A+implications+for+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication.</a> AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).</li>
<li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).</li>
<li>Soriano-Sarabia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+replication-competent+HIV-1+in+populations+of+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).</li>
<li>Josefsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reservoir+in+eight+patients+on+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy+is+stable+with+few+genetic+changes+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).</li>
<li>Evering, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+HIV-1+evolution+in+the+gut-associated+lymphoid+tissue+from+patients+on+combination+antiviral+therapy+initiated+during+primary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection.</a> Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506(2012).</li>
<li>von Stockenstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Genetic+Characterization+Reveals+That+Cell+Proliferation+Maintains+a+Persistent+HIV+Type+1+DNA+Pool+During+Effective+HIV+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).</li>
<li>Palmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).</li>
<li>Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench ">https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench </a> (2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPAdes%3A+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA7%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+Version+7.0+for+Bigger+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.</a> Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).</li>
<li>Katoh, K., Standley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFFT+multiple+sequence+alignment+software+version+7%3A+improvements+in+performance+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html ">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html </a> (2018).</li>
<li>Foster, J. L., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Nef+in+HIV-1+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis.</a> Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html</a> (2018).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html</a> (2018).</li>
<li>Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/2041-210X.12628">ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data.</a> Methods in Ecology and Evolution. , (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die FLIPS-Assay ist eine effiziente und Hochdurchsatz-Methode zur Verstärkung und Sequenzierung Single, in der Nähe von Full-Length HIV-1-Proviruses. Mehrere Faktoren und wichtige Schritte im Protokoll, die Einfluss auf die Anzahl und Qualität der erhaltenen Sequenzen, wurden identifiziert. Erstens beeinflussen die Anzahl der Zellen und die HIV-1 Infektion Häufigkeit der Zellpopulation die Anzahl der Proviruses verstärkt. Zum Beispiel in einer früheren Publikation, etwa halb so viele Sequenzen stammen aus der gleichen Anzahl von naiven CD4+ T im Vergleich zum Effektor Speicher CD4 Zellen+ T Zellen. Und zwar deshalb, weil naiv Zellen in der Regel eine geringere Häufigkeit der Infektion als Effektor Memory Zellen2 haben. Zweitens ist die Zelle Lysis spaltenbasierten Extraktionsverfahren zur Gewinnung genomischen DNS, da gibt es kein Risiko des Verlustes von DNA in die Extraktion vorzuziehen. Zu guter Letzt ist wie bei jedem PCR-basierter Test verhindert Verunreinigung entscheidend. Getrennte sauber Bereiche sollten ausgewiesen werden, für die Zubereitung von Meister Mixe, Umgang mit genomischer DNA, Positivkontrollen, DNA-Reinigung und Quantifizierung und Vorbereitung der Bibliothek hinzufügen. Dies ist besonders wichtig für Single Copy Assays wie die hier vorgestellten.
Umsetzung des FLIPS Assays gehören zunächst eine Positivkontrolle wie pNL4-3 Plasmide anstatt Teilnehmer Proben laufen. Dies erlaubt Fehlerbehebung vor die Verwendung von HIV-1-positiven Zellen, wie die Sequenzen erhalten mit verfügbaren Referenz-Sequenzen für diese Plasmide verglichen werden können. Bei der Verwendung von HIV-1-positiven Zellen ist es wichtig, die HIV-1 Subtyp (Primer entwickelt für FLIPS spezifisch für Subtyp B sind) und die Häufigkeit der Infektion der Zellpopulation zu berücksichtigen, wenn wenig bis keine Proviruses verstärkt werden. Primer-Sequenzen können andere Subtypen entsprechend geändert/überarbeitet werden. Darüber hinaus sollte ein gut mit einer positiven Kontrolle in jeder PCR durchgeführt aufgenommen werden.
FLIPS hat die Grenzen der früheren Sequenzierung Assays, einschließlich SPS überwunden. Durch Verstärkung und Sequenzierung in der Nähe von Full-Length HIV-1-Proviruses können FLIPS die potenzielle Replikation-Kompetenz von HIV-1-Proviruses bestimmen. Dies war nicht möglich mit SPS, die nur Sub-genomische Regionen sequenziert und daher für Sequenzen mit intakten Grundierung Bindungsstellen ausgewählt. Darüber hinaus FLIPS überwindet die Grenzen verbunden mit mehreren Amplifikation und Sequenzierung Primer, Nutzung, wie bei früheren abendfüllenden Sequenzierung Assays1,4beschäftigt war. Durch zwei Runden der PCR gezielt die HIV-1 LTR-Regionen kombiniert mit NGS FLIPS verringert sich die Anzahl und Komplexität der Primer erforderlich. FLIPS ist daher weniger anfällig für die Folgen der Grundierung Fehlanpassungen, nämlich die falsche Identifikation des defekten Proviruses und die Unfähigkeit, einige Proviruses innerhalb einer Population zu verstärken. Die FLIPS-Protokoll ist auch effizienter und ermöglicht einen höheren Durchsatz der Sequenzierung als bisherige Methoden.
Offenbar, FLIPS bietet Vorteile gegenüber bestehenden Methoden, die Bestimmung der genetischen Zusammensetzung von HIV-1 Proviruses. Es ist jedoch wichtig, Grenzen der FLIPS anzuerkennen. Erstens wurde die FLIPS Assay nicht als Instrument zur Messung der Größe der latente HIV-1-Stausee entwickelt Analysen zu bestimmen, ob FLIPS verstärkt jede HIV-1-Provirus in einer Zellpopulation vorhanden nicht abgeschlossen sind. FLIPS eignet sich stattdessen für relative Vergleiche der Zusammensetzung des Stausees zwischen verschiedenen Zelle Bevölkerungen2. Zweitens kann nicht die Replikation-Kompetenz der intakten HIV-1-Proviruses mit Sicherheit ohne in Vivo -Analysen, wie diejenigen von Ho Et Al. durchgeführt bestimmt werden 4. Drittens FLIPS dient nicht zum Integrationsort von HIV-1-Proviruses zu bestimmen.
Geringfügige Abweichungen der FLIPS-Protokolls können ihre Anwendung erhöhen. Zum Beispiel Änderungen der Grundierung, die Sequenzen verschiedene können und mehrere HIV-1 Subtypen verstärkt und sequenziert werden. Sequenzierung von Plasma HIV-1 Virionen ist möglich durch die Zugabe von cDNA Synthese vor verschachtelten PCR. Künftige Nutzung des einzelnen Moleküls sequenziermethoden beseitigt die Notwendigkeit für die de Novo Assemblierung.
Genetische Sequenzierung des integrierten HIV-1-Proviruses hat unser Verständnis von der latente HIV-1-Reservoir erhöht. FLIPS ist ein wichtiges Instrument für zukünftige Studien, die Aufklärung, die Zusammensetzung und die Verteilung des latenten Reservoirs. Jedoch kann die Anwendung von FLIPS über das Reservoir hinausgehen. Zukünftige Studien FLIPS um bestimmte Ziele für CRISPR-Cas-Technologie zu bestimmen, oder helfen bei der Identifizierung von Codierung nutzen können und nicht-kodierenden Regionen, in denen das Virus stärker auf die Latenz Umkehrung Agenten machen. Virale Rekombination kann besser verstanden werden, indem man an den Standorten der Kreuzung der großen internen Löschungen.

Genetische Charakterisierung der latente HIV-1-Stausee bei Personen auf langfristige antiretrovirale Therapie (ART) bestehen bleibt, ist entscheidend zum Verständnis gewesen, dass die Mehrheit der integrierten Proviruses defekt und Replikation-inkompetent1 sind , 2. während des Prozesses der reversen Transkription, Fehler in der integrierten proviralen Sequenz eingebracht werden. Einige Mechanismen, die defekte proviralen Sequenzen generieren gehören die fehleranfällige HIV-1 Reverse Transkriptase Enzym3, Vorlage wechseln4und/oder APOBEC-induzierte Hypermutation5,6. Zwei aktuelle Studien haben herausgefunden, dass etwa 5 % der HIV-1-Proviruses isoliert von Einzelpersonen auf langfristiger ART genetisch intakt und potenziell Replikation-kompetent sind und dazu, die rasche Erholung der HIV-1-Plasmaspiegel nach Beendigung der Kunst beitragen kann 1 , 2 , 7. frühere Studien haben festgestellt, dass die Replikation-kompetente HIV-1-Proviruses auf naiv und ruhen Speicher CD4 beharren+ T Zelle Teilmengen (einschließlich Mittel-, Übergangs- und Effektor Gedächtnis T Zellen), was die Bedeutung von Ausrichtung auf diese Zellen in Zukunft Beseitigung Strategien2,8,9.
Frühe Einblicke in die Verteilung, Dynamik und Wartung des latente HIV-1-Stausees wurden durch Nutzung des Single-proviralen sequenziermethoden (SPS) erreicht, die genetisch Sub-genomische Regionen des HIV-1-Genom10 charakterisieren ,11,12,13. SPS ist ein vielseitiges Werkzeug, das in der Lage, einen einzigen HIV-1 Provirus aus innerhalb einer einzigen infizierten Zelle zu sequenzieren. SPS ist jedoch nicht in der Lage, die Replikation-Kompetenz des Proviruses, zu bestimmen, da es nur Sub-genomische Regionen und Fräulein Proviruses Sequenzen, die große Deletionen innerhalb Grundierung Bindungsstellen enthalten. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die SPS die Größe der die Replikation zuständigen Reservoir von überschätzt 13 - bis 17 - fache durch Sequenzierung selektiv intakt Sub-genomische Regionen2.
An die Grenzen der SPS, Ho Et al. 4 und Bruner Et al. 1 entwickelt Assays zur Sequenz in der Nähe von Full-Length HIV-1-Proviruses. Dies ermöglichte die Häufigkeit der genetisch intakt und potenziell Replikation-kompetent, HIV-1-Proviruses in den Einzelpersonen auf langfristige ART bestimmt werden. Diese Assays amplifiziert und sequenziert (über Sanger Sequenzierung) Sub-genomischen Regionen, in denen dann versammelt waren, um eine Abfolge von (intakt oder defekt) HIV-1-Provirus zu erhalten. Drei Grenzen dieses Ansatzes sind: (1) die Verwendung von mehreren Sequenzierung Primer erhöht das Risiko der Einschleppung unabsichtlich Mängel in der proviralen Sequenz, 2) Grundierung Diskrepanzen können verhindern, dass Verstärkung von bestimmten Proviruses und (3) häufig die gesamte proviralen Sequenz kann nicht durch die Technizität der folgenden Methoden gelöst werden.
Um die Grenzen der bestehenden Full-Length HIV-1 proviralen Sequenzierung Assays zu überwinden, haben wir die FUll -LSeillänge ichgerne PRoviral SEquencing (FLIPS) Assay entwickelt. FLIPS ist ein Next Generation Sequencing (NGS)-je Probe, die verstärkt und hohem Durchsatz und effiziente Weise in der Nähe von Full-Length (intakt oder defekt) HIV-1-Proviruses-Sequenzen. FLIPS bietet Vorteile gegenüber früheren Tests, wie begrenzt die Anzahl der Primer verwendet; Daher verringert sich die Chance des Primers Fehlanpassungen, die wodurch die Bevölkerung der Proviruses eingeschränkt werden kann erfasst oder unabsichtlich Mängel in einer viralen Sequenz einführen. FLIPS ist auch technisch weniger anspruchsvoll als bisherige Tests und besteht aus 6 wichtigsten Schritten: (1) die Lyse von HIV-1-infizierten Zellen, (2) Verstärkung des einzigen HIV-1-Proviruses über nested PCR durchgeführt zur Begrenzung Verdünnung mit Primer speziell für die hoch konservierte HIV-1 5' und 3' U5 LTR Region (Abbildung 1A), 3) Reinigung und Quantifizierung der amplifizierten Produkte, 4) Bibliothek und Vorbereitung des verstärkten Proviruses NGS, 5) NGS, und 6) de Novo Assemblierung der sequenzierten Proviruses Contigs aller zu erhalten individuelle Provirus.
Sequenzen von FLIPS generiert können durchlaufen einen strengen Prozess der Beseitigung, diejenigen zu identifizieren, die genetisch intakt und potenziell Replikation zuständigen (Abbildung 1)2sind. Genetisch intakte Proviruses fehlen alle bekannten Mängel, die Generierung von einer Replikation-inkompetent Provirus. Diese Mängel sind: Inversion Sequenzen, große interne Löschungen, Hypermutation/schädliche Stop-Codons, Frameshifts oder Mutationen in der 5'-Signal oder großen Verpackung splice Entnahmestelle (MSD).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig1.jpg"> Abbildung 1: wichtige Schritte im Test in voller Länge individuelle proviralen Sequenzierung (FLIPS). (A) HIV-1 DNA-Genom mit Grundierung Bindungsstellen in 5' und 3' U5 LTR-Regionen von FLIPS verwendet, um in der Nähe von Full-Length (Defekte und intakt) HIV-1-Proviruses über nested PCR zu verstärken. (B) Layout einer 96-Well-PCR-Platte mit 80 Probe Wells (20 Brunnen für jede Verdünnung), 4 negativen Kontroll-Vertiefungen und 1 Positivkontrolle gut. (C) Prozess der Beseitigung zur Identifizierung von genetisch intakt und potenziell Replikation-kompetent, HIV-1-Proviruses. Diese Zahl wurde von Hiener Et Al. modifiziert 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Verdünnung auf 5 mM für Nested PCR</td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Ersatzlösung</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Lösung (20 mg/ml)</td><td>Promega</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Thermocycler</td><td></td><td></td><td>Jeder 96-Well-Thermocycler kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Platin-Taq-DNA-Polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10x High Fidelity Puffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8,9), 180 mM (NH4)2SO4]</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgSO4</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Nukleotid-Mix, 10 mM</td><td>Promega</td><td>C1141</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareine H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>PCR1 und PCR2 Primer,</td><td></td><td></td><td>entsalzt. Verdünnen auf (100 & Mikro; M) mit H2O PCR-Platte</td></tr><tr><td>96 Well, halber Rock, einfache Kerbeecke, durchsichtig</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Klebedichtungen</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>Erforderlich zum Versiegeln von 96-Well-PCR-Platten</td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3 Infektiöser molekularer Klon (pNL4-3)</td><td>Das folgende Reagenz wurde durch das NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH erhalten: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) von Dr. Malcolm Martin (Cat# 114).</td><td></td><td>Verdünnt auf 105 Kopien/ml und zur Verwendung als Positivkontroll-PCR-Platten-Spinner</td></tr><tr><td>oder Tischzentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E-GEL 48 1 %</td><td>Agarose-Invitrogen</td><td>G800801</td><td>vorgegossene 1 %ige Agarose-Gele (zwei Gele pro 96-Well-Platte). Jedes 1%ige Agarose-Gel kann ersetzt werden. Enthält Ethidiumbromid.</td></tr><tr><td>DirectLoad Wide Range DNA</td><td>Marker Sigma</td><td>D7058</td><td>Jede Leiter mit einer Reichweite von bis zu 10 kb kann ersetzt werden</td></tr><tr><td>Mother E-Base-Gerät</td><td>Invitrogen</td><td>EBM03</td><td>Erforderlich für die Verarbeitung von vorgefertigten 48-Well-1%-Agarose-Gelen</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Dokumentationssystem</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>Jedes Visualisierungssystem für Ethidiumbromid-haltige Agarose-Gele kann verwendet werden</td></tr><tr><td>PlateMax Peelable Heat Sealing</td><td>Axygen</td><td>HS-200</td><td>Heißsiegelfolie für die Langzeitlagerung</td></tr><tr><td>96 Well 0,8 mL Speicherplatte</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0765</td><td>0,8 mL 96 Well-Platte erforderlich für die PCR-Aufreinigung auf Basis von magnetischen Beads</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP (PCR-Aufreinigungskit)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>PCR-Aufreinigungskit auf Basis von magnetischen Beads. Andere PCR-Aufreinigungskits können hier substituiert werden (z.B. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)</td></tr><tr><td>Ethylalkohol, rein. 200 proof, für die Molekularbiologie</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand-96</td><td>Invitrogen</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplattenschüttler</td><td></td><td></td><td>Optionaler</td></tr><tr><td>Puffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Elutionspuffer</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>Ein fluoreszenzbasierter Farbstoff zur Messung der dsDNA-Konzentration</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Hartschalen-96-Well-PCR-Platten</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td>Erforderlich für Nextera XT DNA-Bibliotheksvorbereitungskit</td></tr><tr><td>Bibliotheksquantifizierungskit - Illumina/Universal</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>Andere Bibliotheksquantifizierungskits können substituiert werden (z. B. JetSeq DNA-Bibliotheksquantifizierung Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)</td></tr><tr><td>2100 Bioanalysator</td><td>Agilent Technology</td><td></td><td>Automatisiertes Elektrophoresesystem. Zur Verwendung in Verbindung mit einem DNA-Kit mit</td></tr><tr><td>hoher Empfindlichkeit DNA-Kit mit hoher Empfindlichkeit</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Illumina MiSeq-Plattform</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verstärkung des in der nähe von full-length hiv-1 proviruses für next generation sequencing

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Die voller individueller Proviralen Sequenzierung (FLIPS)-Assay ist eine effiziente und Hochdurchsatz-Methode entwickelt, um zu verstärken und einzelne, in der Nähe von Full-Length (intakt und defekt), HIV-1-Proviruses-Sequenz. FLIPS ermöglicht die Bestimmung der genetischen Zusammensetzung des integrierten HIV-1 innerhalb einer Zellpopulation. Durch Identifizierung von Mängeln innerhalb von HIV-1 proviralen Sequenzen, die während der reversen Transkription, wie große interne Deletionen entstehen erforderlich, schädliche Stop Codons/Hypermutation, Frameshift-Mutationen und Mutationen/Löschungen in GUS-Staaten, die Elemente bei Virion Reifung können FLIPS integrierte Proviruses nicht in der Lage der Replikation erkennen. Die FLIPS-Assay kann genutzt werden, um HIV-1 Proviruses zu identifizieren, die fehlt diese Mängel und sind daher potenziell Replikation zuständig. Die FLIPS-Protokoll beinhaltet: Lyse von HIV-1-infizierten Zellen, verschachtelten PCR von in der Nähe von Full-Length HIV-1-Proviruses (mit Zündkapseln gezielt auf die HIV-1-5' und 3' LTR), DNA-Reinigung und Quantifizierung, Bibliothek Vorbereitung für Next Generation Sequencing (NGS), NGS, de Novo Assemblierung der proviralen Contigs und einen einfachen Prozess der Beseitigung zur Identifizierung von Replikation zuständigen Proviruses. FLIPS bietet Vorteile gegenüber traditionellen Methoden entwickelt, um die Sequenz HIV-1-Proviruses, wie Single-proviralen Sequenzierung integriert. FLIPS verstärkt und Sequenzen in der Nähe von in voller Länge Proviruses ermöglicht Replikation Kompetenz ermittelt werden und nutzt auch weniger Verstärkung Zündkapseln, die Folgen der Grundierung Fehlanpassungen zu verhindern. FLIPS ist ein nützliches Werkzeug für das Verständnis der genetischen Landschaft des integrierten HIV-1-Proviruses, vor allem innerhalb der latenten Reservoirs, aber dessen Nutzung kann für jede Anwendung, in der die genetische Zusammensetzung der integrierte HIV-1 erforderlich ist.

Die FLIPS Assay verstärkt und einzelne, in der Nähe von Full-Length HIV-1-Proviruses-Sequenzen. Das Protokoll besteht aus 6 Schritten, in der Nähe von Full-Length proviralen Sequenzen zu erhalten. Diese Schritte umfassen: Lyse der infizierten Zellen, verschachtelten PCR in voller Länge (intakt und Defekte) HIV-1-Proviruses, DNA-Reinigung und Quantifizierung, Bibliothek Vorbereitung, NGS, Sequenzierung und de Novo Assemblierung der sequenzierten Proviruses. Am Ende jedes Schrittes kann einen Prüfpunkt betrachtet werden, in dem die Qualität des Produktes (z.B. verstärkt DNA, gereinigte DNA, Sequenzierung Bibliothek oder Sequenz) vor dem nächsten Schritt beurteilt werden kann. Ein Überblick über die Bewertung am Ende der einzelnen Schritte durchgeführt und die erwarteten Ergebnisse sind unten zusammengefasst.
Nach nested PCR laufen verstärkt Produkte auf einem 1 % Agarose-Gel (Abbildung 3). Die ursprüngliche Qualität des PCR kann durch Inspektion der negativ-und Positivkontrollen ermittelt werden. Negativkontrolle Brunnen mit verstärkten Produkt kennzeichnen Kontamination und Positivkontrolle Brunnen fehlt der verstärkten Produkt kennzeichnen unzureichende Verstärkung. Als nächstes werden Brunnen, verstärkte Produkt enthält für die Sequenzierung ausgewählt. Zur Vermeidung von Brunnen mit Mischungen aus mehreren verstärkten Proviruses gelten nur Brunnen mit verstärkten Produkt am Endpunkt Verdünnung für die Sequenzierung. Nach Poisson-Verteilung wird die Endpunkt-Verdünnung gefunden, wenn 30 % der Brunnen für verstärkte Produkt positiv sind. Bei dieser Verdünnung ist ein 80 % chance diese Vertiefungen enthalten einen einzelnen verstärkten Provirus. Darüber hinaus können Brunnen, enthält mehrere verstärkte Proviruses in verschiedenen Längen in diesem Stadium visualisiert werden, wie mehrere Bänder auf dem Gel angezeigt werden. Diese Brunnen sollte nicht gewählt werden, für die Sequenzierung (Abbildung 3).
Nach Reinigung der verstärkten Proviruses, ausgewählt für die Sequenzierung Quantifizierung gewährleistet, dass keine proviralen DNA während der Reinigung Bühne verloren geht. Wenn die DNA-Konzentration von einem verstärkten Provirus &lt; 0,2 ng/µL, die restlichen Probe in die PCR2 Platte gereinigt werden kann. Ein ähnlicher Prüfpunkt tritt nach Bibliothek Vorbereitung, in dem jede einzelne Bibliothek quantifiziert ist. Dadurch werden einzelne Proviruses wurden entsprechend fragmentiert, markiert und vor der Sequenzierung verstärkt. Einzelne proviralen Bibliotheken sind gebündelt in äquimolaren Mengen zu einer endgültigen Bibliothek-Konzentration von 4 nM (oder wie angegeben durch den Anbieter der Sequenzierung). Wenn die Konzentration einer einzelnen proviralen Bibliothek zu niedrig ist, es kann aus der Sequenzierung Bibliothek Pool ausgeschlossen werden oder die einzelne Bibliothek noch einmal aufbereitet. Eine endgültige Überprüfung der Konzentration der gepoolten Bibliothek erfolgt vor der Sequenzierung zusammen mit bestätigt die durchschnittliche Fragment-Längen.
Qualitätskontrolle-Schritte, bevor die de Novo Montageschritt sichert die Qualität des lautet der endgültige proviralen Contig montiert. Diese Schritte umfassen: Entfernung des Adapter-Sequenzen, Beschneiden von 5' und 3' Nukleotide, einer strengen Qualitätskontrolle-Grenze, und abgesehen von kurzen mal gelesen. CLC Genomics Werkbank bieten Qualitätskontrolle Berichte, die vor verwendet werden kann, um die ursprüngliche Qualität des Lese- und Guide-Trimmen-Einstellungen, und dann nach zu beurteilen, um festzustellen, ob der Besatz ausreichte, um minderwertige Regionen zu entfernen. Darüber hinaus für die de Novo Assemblierung, die Qualität der montierten Contigs für unzureichend beurteilt werden kann (&gt; 1000 X) und Gleichmäßigkeit der Abdeckung (Abb. 4A). Gemischte Bevölkerung können auch in diesem Stadium identifiziert werden. Mischungen aus mehreren Proviruses in voller Länge (~ 9 kb) werden durch das Vorhandensein von mehreren SNPs mit einer Frequenz von mehr als 40 % identifiziert, während Mischungen aus kurzen (mit einer großen internen Löschung) und in voller Länge Proviruses durch ungleichmäßige identifiziert werden können Lesen Sie die Abdeckung nach Zuordnung zu einer Full-Length Referenz aus der gleichen Teilnehmer (Abbildung 4 b).
Je nach Anwendung kann die endgültige Ausrichtung mit Tools wie Ggtree zur Verfügung als Paket in "R: A Sprache und Umgebung für statistische Berechnungen"27visualisiert werden. In einer aktuellen Studie FLIPS wurde genutzt, um HIV-1 Sequenz Proviruses naiv, Mittel-, Übergang und Effektor auswendig CD4+ T Zellen isoliert von Einzelpersonen über langfristige Kunst, mit dem Ziel zu ermitteln, ob bestimmte Zelle Teilmengen höhere zeigte Proportionen des genetisch intakt und potenziell Replikation zuständigen HIV-1-2. Hier ist die visuelle Darstellung der Sequenzen, die von einem Teilnehmer dieser Studie (Teilnehmer 2026) isoliert (Abbildung 5) vorgestellt. In dieser Teilnehmer die Mehrheit (97 %) der Sequenzen waren defekt, mit intakten Sequenzen gefunden in Effektor und Übergangszeit Memory CD4+ T Zellen. Diese Visualisierungs-Tool ist nützlich für zeigt die Anzahl der Sequenzen mit großen internen Löschungen und ihre Position im Genom. Es kann weitere beschriftet werden, um Sequenzen mit schädlichen Stop-Codons, Frameshift-Mutationen und Deletionen/Mutationen in den MSD-Website und/oder Verpackung Signal anzuzeigen.
Eine Anwendung des Assays FLIPS ist die Identifizierung von genetisch intakt und potenziell Replikation zuständigen HIV-1-Proviruses. In einer aktuellen Studie von 531 Sequenzen von CD4 isoliert+ T-Zellen von 6 Teilnehmern auf langfristige Kunst 26 (5 %) genetisch intakt HIV-1 Proviruses waren identifizierten2. Der verbleibende defekt Proviruses enthalten mit Inversion Sequenzen (6 %), große interne Löschungen (68 %), schädliche Stop Codons/Hypermutation (9 %), Frameshift-Mutationen (1 %) und Mängel in der Verpackung Signal bzw. Mutationen in der MSD-Website (11 %) .
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig2.jpg"> Abbildung 2: Übersicht des Workflows für de Novo Assemblierung von HIV-1 Proviruses. Die wichtigsten Schritte im Workflow enthalten: 1) Reihenfolge lesen Qualitätskontrolle, 2) Zusammenführen von überlappenden Paare, 3) de Novo Assemblierung und (4) Neuzuordnung und Konsensbildung wurden rot, blau, grün und Orange, beziehungsweise. Diese Zahl wurde von Hiener Et Al. modifiziert 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig3.jpg"> Abbildung 3: Beispiel Agarose-Gel von PCR verstärkt HIV-1-Proviruses. Brunnen 1, 2, 3, 6, 9 und 10 enthalten amplifizierten HIV-1-Proviruses. Gut 10 enthält eine Provirus mit einem großen internen löschen, gut 2 enthält Co Verstärkung von zwei HIV-1-Proviruses in verschiedenen Längen (Mischung) und gut 12 enthält Positivkontrolle. Hinweis die Prozent der Brunnen mit verstärkten Produkt ist 60 %, also oberhalb der Prozentsatz einzelne Vorlagen zu isolieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig4.jpg"> Abbildung 4: Beispiel-Ausgabe lesen Sie Mapping. (A) Beispiel demonstriert, gleichmäßige Abdeckung durch die Verstärkung von einer einzigen Full-Length HIV-1-Provirus. Nach de Novo Assemblierung werden alle Lesevorgänge der montierten Contig Herstellen einer Konsensussequenz zugeordnet. Die Software-Plattform ermöglicht die zugeordneten liest für ausreichend und sogar Abdeckung inspiziert werden. (B) Beispiel demonstriert Co Verstärkung von zwei HIV-1-Proviruses in verschiedenen Längen (Mischung). Um Mischungen zu bestimmen, sind liest eine referenzsequenz in voller Länge (~ 9 kb) aus der gleichen Teilnehmer zugeordnet und lesen Zuordnung überprüft. Das Vorhandensein der ungleichmäßige Deckung zeigt eine Mischung. Diese Zahl wird mit freundlicher Genehmigung von Qiagen14wiedergegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig5.jpg"> Abbildung 5: Beispiel-Visualisierung von HIV-1 proviralen Sequenzen von CD4 isoliert+ T Zelle Teilmengen von einem Individuum auf langfristige Kunst. Individuelle HIV-1 proviralen Sequenzen werden durch horizontale Linien dargestellt. Diese Zahl wurde von Hiener Et Al. modifiziert 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

In voller Länge individuelle proviralen Sequenzierung (FLIPS) bietet eine effiziente und Hochdurchsatz-Methode für die Verstärkung und die Abfolge der einzelnen, in der Nähe von Full-Length (intakt und Defekte) HIV-1-Proviruses und ermöglicht die Bestimmung ihres Potenzials Replikation-Kompetenz. FLIPS überwindet Grenzen der früheren Assays entwickelt, um die latente HIV-1-Reservoir-Sequenz.

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im HIV-Bereich zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung der genetischen Zusammensetzung von HIV-Proviren und verschiedenen Zelltypen. Insbesondere die Identifizierung von genetisch intakten und potenziell replikationskompetenten Personen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es uns ermöglicht, fast in voller Länge HIV-Proviren aus einzelnen HIV-infizierten Zellen zu verstärken und diese dann durch Sequenzierung der nächsten Generation zu sequenzieren.Bereiten Sie zunächst alle Puffer wie im Textprotokoll beschrieben vor. Besorgen Sie sich ein Zellpellet und fügen Sie hundert Mikroliter Lysepuffer pro Million Zellen hinzu. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten.Lyse die Zellen durch Inkubation in einem thermischen Cycler bei 55 Grad Celsius für eine Stunde und fügen Sie dann 85 Grad Celsius für 15 Minuten. Um mit der Verstärkung einzelner HIV-1-DNA-Proviren zu beginnen, mischen Sie die Reagenzien für die erste Runde der PCR, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls aufgeführt. Fügen Sie 38 Mikroliter zu 85 Brunnen in eine 96 well PCR-Platte und beschriften Sie diese Platte als PCR 1.Danach verschieben Sie die PCR 1-Platte in einen klaren Bereich, der für die Zugabe von genomischer DNA vorgesehen ist. Mit Trishydrochlorid verdünnen Sie die genomische DNA seriell aus einem Verhältnis von eins zu drei zu einem Verhältnis von eins zu 81 und stellen sie sicher, dass 45 Mikroliter jeder Verdünnung vorbereitet werden. Fügen Sie zwei Mikroliter verdünnter genomischer DNA zu jeder Probe gut und zwei Mikroliter Trishydrochlorid zu jedem negativen Kontrollbrunnen hinzu.Versiegeln Sie die gesamte Platte bis auf die Positivkontrolle gut. Wechseln Sie als Nächstes zu einem Bereich, der für das Hinzufügen der Positivsteuerung vorgesehen ist. Fügen Sie zwei Mikroliter der Positivkontrolle in den entsprechenden Brunnen und versiegeln Sie dann die Platte vollständig.Verwenden Sie einen PCR-Plattenspinner, um die PRC 1-Platte kurz zu drehen und restliche Inhalte von den Seiten der Brunnen herunterzuziehen. Führen Sie die PCR 1-Platte im Thermocycler wie im Textprotokoll beschrieben aus. Als nächstes mischen Sie die Reagenzien für die zweite Runde der PCR, wie in Tabelle 1 aufgeführt.Fügen Sie 28 Mikroliter dieser PCR 2 Mischung zu 85 Brunnen einer neuen 96 well PCR Platte hinzu. Beschriften Sie diese Platte als PCR 2. Drehen Sie mit einem Plattenspinner die PCR 1-Platte kurz, um Restinhalte von den Seiten der Brunnen herunterzuziehen.Fügen Sie 80 Mikroliter Trishydrochlorid zu jedem Brunnen dieser Platte hinzu. Danach verwenden Sie eine Mutli-Kanal-Pipette, um zwei Mikroliter von jedem Brunnen der PCR 1-Platte auf die entsprechenden Brunnen in der PCR 2-Platte zu übertragen. Versiegeln Sie die PCR 2 Platte mit einer klaren Klebefolie.Drehen Sie die PCR 2-Platte im Plattenspinner kurz. Unterdessen die PCR 1-Platte mit einer Wärmedichtungsfolie für die Langzeitlagerung bei minus 20 Grad Celsius abdichten. Führen Sie die PCR 2-Platte in einem thermischen Cycler aus, wie im Textprotokoll beschrieben.Drehen Sie dann kurz die PCR 2 Platte, um restliche Inhalte von den Seiten der Brunnen herunterzuziehen. Mit einer Mehrkanalpipette 60 Mikroliter Trishydrochlorid zu jedem Brunnen hinzufügen. Als nächstes führen Sie 15 Mikroliter von jedem Brunnen auf zwei 48 gut vorgefertigten ein Prozent Agarose-Gelen, die Ethidiumbromid enthalten.Identifizieren Sie die Brunnen, die das verstärkte Produkt und ihre ungefähren Größen enthalten, und speichern Sie das Gelbild. Danach bestimmen Sie die Verdünnung, bei der nicht mehr als 30 Prozent der Brunnen für verstärkteprodukte Produkte positiv sind. Verwenden Sie zunächst einen Plattenspinner, um die PCR 2-Platte kurz zu drehen und alle Restinhalte von den Seiten der Brunnen herunterzuziehen.40 Mikroliter aus den Brunnen mit verstärktem Produkt auf die entsprechenden Brunnen einer neuen 96 Well Midi Platte übertragen. Als nächstes legen Sie ein magnetisches Futter-basierte Reinigungskit, um sicherzustellen, dass die magnetischen Perlen auf Raumtemperatur zu bringen und eine frische Lösung von 80 Prozent Ethanol vorzubereiten. Sobald die Perlen Raumtemperatur wirbeln sie zu erreichen, um sicherzustellen, dass sie gründlich resuspended.Mit einer Mehrkanalpipette 40 Mikroliter Perlen zu den 40 Mikrolitern des verstärkten Produkts in jedem Brunnen der Midi-Platte hinzufügen. Mischen Sie durch sanftes Pipettieren nach oben und unten 10 mal. Bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren.Dann übertragen Sie die Platte auf einen magnetischen Ständer und lassen Sie sie für zwei Minuten ruhen. Entfernen und entsorgen Sie danach den Überstand. Mit der Platte noch auf dem Ständer, waschen Sie die Perlen, indem Sie zweihundert Mikroliter der 80 Prozent Ethanol-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen.Bei Raumtemperatur 30 Sekunden inkubieren und dann den Überstand entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang einmal vom Hinzufügen des Ethanols bis zum Wegwerfen des Überstandes. Mit einer Mehrkanalpipette entfernen Sie überschüssiges Ethanol.Lassen Sie die Perlen 15 Minuten trocknen. Entfernen Sie danach die Platte vom Ständer. Fügen Sie 30 Mikroliter Elutionspuffer zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie, indem Sie sanft 10 Mal nach oben und unten pfeifen.Bei Raumtemperatur zwei Minuten inkubieren. Legen Sie die Platte wieder auf den Magnetischen Ständer und lassen Sie sie für zwei Minuten ruhen. Mit einer Mehrkanalpipette 25 Mikroliter des Überstandes auf die entsprechenden Brunnen einer neuen 96-Well-PCR-Platte übertragen.Verwenden Sie als Nächstes ein Spektrenphotometer, um die ungefähre Konzentration jedes verstärkten DNA-Produkts zu bestimmen und aufzuzeichnen. Legen Sie ein doppelsträngiges DNA-Quantifizierungskit fest und verdünnen Sie den Puffer in sterilem DNAs-freiem Wasser auf ein Mal. Fügen Sie 99 Mikroliter des Puffers zu einer entsprechenden Anzahl leerer Brunnen in einer flachen Bodengewebekulturplatte hinzu.Fügen Sie dann hundert Mikroliter Puffer zu drei leeren Brunnen hinzu. Für jedes zu messende verstärkte Produkt fügen Sie jedem bohrspeicherhaltigen Puffer einen Mikroliter gereinigter DNA in Dreifache hinzu. Verdünnung lambda Doppelstränge DNA 10-fach von zwei Nanogramm pro Mikroliter auf Null Null Nanogramm pro Mikroliter, um die Standards vorzubereiten.Fügen Sie hundert Mikroliter jedes doppelsträngigen DNA-Standards zu drei Brunnen hinzu. Den Blütenstichein- bis Zweihunderter mit Puffer verdünnen. Fügen Sie schnell hundert Mikroliter zu jedem Brunnen hinzu, der eine Probe, leer oder Standard enthält, und mischen Sie sie durch Pipettieren nach oben und unten.Danach die Platte mit Folie bedecken, um den Kontakt mit Licht zu vermeiden. Zeichnen Sie mit einem Mikroplattenleser die Blütenstandemission auf. Verwenden Sie die aufgezeichneten Messungen, um die Konzentration der doppelsträngigen DNA in jeder Probe zu bestimmen.Dann verdünnen Sie jedes gereinigte Produkt mit Wasser auf eine Konzentration von null Punkt zwei Nanogramm pro Mikroliter. Nach verschachtelter PCR werden die verstärkten Produkte auf einem einprozentigen Agarose-Gel ausgeführt. Die Ausgangsqualität der PCR kann durch Inspektion der Steuerungen bestimmt werden.Da Negativkontrollen, die verstärktes Produkt enthalten, auf eine Kontamination hinweisen und die Positivkontrollen ohne verstärktes Produkt auf eine unzureichende Amplifikation hindeuten. Nur Bohrungen laufen am Endpunkt verdünnt, die einzelne verstärkte Proviren enthalten, werden für die Sequenzierung berücksichtigt. Während Brunnen, die mehrere verstärkte Proviren unterschiedlicher Länge enthalten, in diesem Stadium visualisiert werden können, sollten sie nicht für die Sequenzierung ausgewählt werden.Für die de novo Montage kann die Qualität der montierten Contigs auf ausreichende Tiefe und Gleichmäßigkeit der Abdeckung beurteilt werden. Gemischte Populationen können in diesem Stadium auch durch eine ungleichmäßige Abdeckung identifiziert werden. Die visuelle Darstellung der von einem Teilnehmer isolierten Sequenzen zeigt, dass 97 Prozent ihrer Sequenzen defekt sind.Mit intakten Sequenzen in Effektor- und Übergangsspeicher CD4-positiven T-Zellen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass nur verstärkte Produkte, die bei der begrenzenden Verdünnung erhalten werden, d. h. wo nicht mehr als 30 Prozent der Brunnen positiv sind, ein einziges Provirus enthalten. Nach diesem Verfahren können verstärkte Produkte sequenziert werden, um die genetische Zusammensetzung von HIV-Proviren zu bestimmen.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet von HIV, um die Verbreitung von genetisch intakten HIV-Proviren und verschiedenen Zelltypen bei Patienten in Therapie zu erforschen, um festzustellen, wo sich genetisch intakte und potenziell replikationskompetente Proviren verstecken. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit HIV-infizierten Zellen gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und die Arbeit eines zertifizierten Labors sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

amplification-near-full-length-hiv-1-proviruses-for-next-generation

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

HIV Tropismus kann aus der V3-Region der Virushülle abgeleitet werden. V3 ist die PCR in dreifacher Ausfertigung mit nested RT-PCR, Sequenzierung verstärkt und interpretiert mit Bioinformatik-Software. Proben mit mit 1 oder mehreren Sequenz (en) mit niedrigen G2P Partituren sind als nicht-R5-Virus klassifiziert.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Die Quantifizierung der HIV-1 RNA im Plasma und Sequenzierung einzelner HIV-1 Genome von Individuen mit einer Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze (50-75 Kopien / ml) ist schwierig. Hier beschreiben wir, wie zu extrahieren und zu quantifizieren, Plasma-Virus-RNA mit Hilfe eines Echtzeit-PCR-Assay, der zuverlässig misst HIV-1 RNA bis zu 0,3 Kopien / ml und wie man virale Genome von einzelnen Genomsequenzierung verstärken, von Proben mit sehr niedrigen Viruslast.

Verstärkung und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-infizierten Personen mit Viruslast unter der Nachweisgrenze von Standard Clinical Assays

Einzel-Virus Genomics (SVG) ist eine Methode zur Isolierung und verstärken die Genome einzelner virons. Virussuspensionen einer gemischten Anordnung sortiert werden mittels Durchflusszytometrie auf einen Objektträger mit diskreten Vertiefungen, Agarose, wodurch die Erfassung des Virions und Verringerung Genom Scherung während der Weiterverarbeitung. Amplifikation des gesamten Genoms erfolgt über mehrere Displacement Amplification (MDA), was genomische Material, das für die Sequenzierung...

Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit &#39;Single Virus Genomics&#39;

Arzneimittelresistenz Tests für HIV-1-infizierten Personen in Ermangelung einer antiretroviralen Therapie (ART) können zukünftige Therapien führen und die Behandlungsergebnisse zu verbessern. Optimierung der individuellen und der Gesundheit der Bevölkerung Ergebnisse in hoher HIV-Prävalenz, aber mit beschränkten Ressourcen wird letztlich erfordern erschwinglich und zugänglich Resistenzen Genotypisierung und Interpretationsmethoden.

Eine erschwingliche HIV-1 Drug Resistance Überwachungsmethode für Ressourcen Begrenzte Einstellungen

Wachstumskonkurrenz zwischen nahezu isogenen Viren bietet ein sensitives Maß für die Bestimmung der relativen Replikationsfitness. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen die Konstruktion rekombinanter HIV-1-Klone, die Virusvermehrung und Wachstumskonkurrenz sowie Analysemethoden, die optimiert sind, um empfindliche und konsistente Ergebnisse zu erzielen.

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

Wir beschreiben ein Protokoll zur Amplifikation retroviraler Integrationsstellen aus der genomischen DNA infizierter Zellen, zur Sequenzierung der amplifizierten Virus-Wirt-Verbindungen und zur anschließenden Kartierung dieser Sequenzen auf ein Referenzgenom. Wir beschreiben auch Techniken zur Quantifizierung der Verteilung von Integrationsstellen relativ zu verschiedenen genomischen Annotationen mit Hilfe von BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur genomweiten Kartierung der Integrationsorte von Moloney murinen Leukämie-Virus-basierten retroviralen Vektoren in menschlichen Zellen.

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Hier präsentieren wir einen Tiefe Sequenzierung Ansatz, der eine objektive Bestimmung der im Entstehen begriffenen 3'-Termini sowie mutagenen Profile der einzelsträngigen DNA-Moleküle enthält. Die Hauptanwendung ist die Charakterisierung der im Entstehen begriffenen retrovirale ergänzende DNAs (cDNAs), die Zwischenprodukte, die während des Prozesses der retroviralen reversen Transkription generiert.

Bestimmende 3'-Termini und Sequenzen der im Entstehen begriffenen einsträngige virale DNA-Moleküle während HIV-1 Reverse Transkription in infizierten Zellen

Zuvor haben wir ein Protokoll für die Sequenzierung des Amplikon-basierten Ganzgenoms Usutu Virus (USUV) auf einer Nanoporensequenzierungsplattform validiert. Hier beschreiben wir die verwendeten Methoden genauer und bestimmen die Fehlerrate der Nanoporen-R10-Durchflusszelle.

Validierung der Nanoporensequenzierung des gesamten Genoms anhand des Usutu-Virus als Beispiel

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Einführung einer kontrollierbaren genetischen Vielfalt in das Genom des Hepatitis-C-Virus durch die Kombination von mutierter RNA-Synthese in voller Länge mit fehleranfälliger PCR und umgekehrter Genetik. Die Methode stellt ein Modell für die Phänotypauswahl dar und kann für 10 kb lange RNA-Virusgenome verwendet werden.

Reverse Genetik zur Entwicklung von RNA-Virusvarianten mit positivem Sinn

Erfahren Sie die FLIPS-Methode zur Amplifikation nahezu vollständiger HIV-1-Proviren aus einzelnen infizierten Zellen für Next-Generation-Sequencing. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung replikationskompetenter Proviren.

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

Weitere Videos entdecken