Studium Ribonukleotidreduktase Aufnahme: Strang-spezifischen Nachweis von Purine Hefegenoms und Messen Ribonukleotidreduktase induzierter Mutagenese

Diese Methode kann helfen, Fragen zu beantworten, z. B. wie viele Ribonukleotide in die entstehende, führende und nachlaufende Strang-DNA im Genom eingebaut sind. Obwohl diese Methode quantitative und qualitative Informationen über die Ribonukleaotiddichte im Hefegenom liefern kann, kann sie auch auf andere Systeme, wie z. B. Säugetiergenome, angewendet werden. Die alkalische Gelelektrophorese bietet einen semiquantitativen Überblick über den Ribonukleotideinbau in das gesamte Genom und das strangspezifische Southern-Blotting ermöglicht eine höhere Sensitivität und Quantifizierung an einem spezifischen genomischen Ort.

Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie jeder Probe frisch zubereiteter genomischer Hefe-DNA sechs Mikroliter eines molaren Kaliumhydroxids hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 55 Grad Celsius. Nach zwei Stunden inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang auf Eis. Geben Sie dann zu jeder Probe vier Mikroliter 6-6 alkalischen DNA-Ladepuffer

Gießen Sie ein alkalisches Gel, das aus einem Prozent Agarose, 50 Millimolar Natriumhydroxid und einem Millimolaren EDTA pH Acht besteht, mit einem Kamm, mit dem 24 Mikroliter DNA-Probe pro Bahn geladen werden können. Drehen Sie die Röhrchen mit den Proben kurz herunter. Laden Sie die gesamten 24 Mikroliter jeder Probe in das alkalische Agarosegel.

Fügen Sie einen geeigneten DNA-Größenmarker hinzu. Elektrophorese bei 30 Volt für 30 Minuten. Senken Sie dann die Spannung auf 10 Volt und Elektrophorese für 18 bis 20 Stunden.

Am nächsten Tag neutralisieren Sie das Gel. Tauchen Sie das Gel in den Neutralisationspuffer eins und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren für 45 Minuten. Ersetzen Sie die Neutralisationspuffermischung durch frischen Puffer.

Und weitere 45 Minuten inkubieren. Um die DNA zu färben, weichen Sie das neutralisierte Gel in 200 Millilitern Wasser ein, das eine Verdünnung von 1 bis 10000 Sybr-Goldfleck bei Raumtemperatur enthält, und schütteln Sie es zwei Stunden lang leicht. Visualisieren Sie die DNA mit einem UV-Transilluminator.

Die DNA aus dem alkalischen Gel wird durch Kapillarwirkung auf eine positiv geladene Nylonmembran übertragen. Weichen Sie das alkalische Gel zunächst 15 Minuten bei Raumtemperatur in alkalischem Transferpuffer ein. Befeuchten Sie anschließend die Nylonmembran kurz mit Wasser und weichen Sie sie fünf Minuten lang in alkalischem Transferpuffer ein.

Richten Sie die Transferplattform ein, indem Sie drei 100-Milliliter-Glasbecher in einer Glasauflaufform umdrehen, die etwas größer ist als die Größe des Agarosegels. Stellen Sie eine Glasplatte auf die Glasbecher. Drapieren Sie zwei große Stücke von drei MMCHR Chromatographiepapier über die Glasplatte.

Gießen Sie alkalischen Transferpuffer über das Chromatographiepapier und füllen Sie die Glasschale zur Hälfte. Glätten Sie die Blasen mit einer Fünf-Milliliter-Glaspipette. Lege das Agarose-Gel darauf.

Wieder die Blasen glätten. Umgeben Sie alle Ränder des Gels mit Parafilm. Gießen Sie eine kleine Menge alkalischen Transferpuffer auf das Gel.

Legen Sie die vorgetränkte Nylonmembran auf das Gel und glätten Sie die Blasen. Legen Sie zwei Stücke Chromatographiepapier auf die Größe des Agarosegels zugeschnitten. Legen Sie sie auf die Membran und glätten Sie alle Blasen.

Lege einen großen Stapel Papiertücher auf das Transfersandwich und lege vorsichtig eine Glasplatte auf die Papiertücher. Legen Sie einen beschwerten Gegenstand auf die Oberseite und lassen Sie die Übertragung über Nacht bei Raumtemperatur durchführen. Nehmen Sie am nächsten Tag den Transferstapel vorsichtig auseinander.

Die Membran bei Raumtemperatur in Neutralisationspuffer zwei 15 Minuten einweichen. Vernetzen Sie die DNA mit der geladenen Nylonmembran mit einem UV-Vernetzer. Verwenden Sie die Einstellung für automatische Querverknüpfung.

Vor Beginn des Hybridisierungsverfahrens ist die radioaktiv markierte Sonde wie im Textprotokoll beschrieben vorzubereiten. Rollen Sie die benetzte Membran in ein Hybridisierungsröhrchen und fügen Sie 25 Milliliter frisch zubereiteten Hybridisierungspuffer hinzu. Inkubieren Sie eine Temperatur von 65 Grad Celsius mit Rotation in einem Hybridisierungsofen für ein bis zwei Stunden.

Gießen Sie die Lösung vorsichtig ab und fügen Sie 25 Milliliter Hybridisierungspuffer plus die Sonde hinzu. Inkubieren Sie bei 65 Grad Celsius für 16 bis 18 Stunden mit Rotation. Gießen Sie dann die Lösung in einen Behälter für radioaktive Abfälle.

Geben Sie die Phosphat-STS-Waschlösung eins in das Hybridisierungsröhrchen und drehen Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Führen Sie auf diese Weise fünf Waschgänge von jeweils fünf Minuten mit Phosphat-STS-Waschlösung eins durch. Nach der fünften Wäsche mit Phosphat-STS-Waschlösung einmal die Membran zweimal mit Phosphat-STS-Waschlösung waschen, zwei Mal für 15 Minuten bei 65 Grad Celsius mit Rotation.

Entfernen Sie die Membran mit einer Pinzette aus dem Hybridisierungsröhrchen und legen Sie die Membran in einen geöffneten Kunststoffhüllenschutz. Abdecken und auf eine Speicherfolie belichten. Falls erforderlich, entfernen Sie den Blot und sondieren Sie ihn erneut mit einer anderen Sonde.

Zum Abstreifen bedecken Sie die Membran mit 25 Millilitern einer 50-prozentigen Formamid-2XSSPE-Lösung und inkubieren zwei Stunden lang bei 65 Grad Celsius. Gießen Sie die Lösung in einen Behälter für radioaktive Abfälle. Geben Sie die zweite Phosphat-STS-Waschlösung in das Hybridisierungsröhrchen und drehen Sie sie 15 Minuten lang bei 65 Grad Celsius.

Überprüfen Sie die Membran mit einem Geigerzähler, um das Fehlen eines Signals zu bestätigen, bevor Sie die Prähybridisierung und Hybridisierung durchführen, wie zuvor gezeigt. Diese Gelbilder mit genomischer Hefe-DNA, die mit oder ohne Kaliumhydroxid behandelt wurde, zeigen, dass die Zellen, denen RNH2 fehlt, mehr Ribonukleotide im Genom behalten. Die M644L-Variante der Polymerase zwei reduziert die Fähigkeit, Ribonukleotide einzubauen, während die M644G-Mutante mehr Ribonukleotide enthält als die Wildtyp-Polymerase.

Ein alkalisches Agarose-Gel kann durch eine strangspezifische Southern-Blot-Analyse weiter untersucht werden. In diesem Beispiel glühen die Sonden an den entstehenden führenden DNA-Strang innerhalb des URA3-Reportergens, der in der Nähe von ARS306 in zwei entgegengesetzten Orientierungen eingefügt wurde. Repräsentative Ergebnisse des Southern-Blottings unter Verwendung der naszierenden führenden strangspezifischen Sonden zeigen ein DNA-Fragmentierungsmuster, das durch die Alkalispaltung an Ribonukleotiden und naszierenden führenden Strängen der DNA in einem Wildtypstamm und in Stämmen verursacht wird, die die Varianten der Polymerasen alpha, delta und epsilon exprimieren, die promiskuitiv für den Ribonukleotideinbau sind.

Diese Grafik zeigt die Quantifizierung des radioaktiven Signals nach einem Bruchteil der Gesamtmenge in jeder Spur ab dem Southern Blot. Beim Versuch des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, immer frisch isolierte DNA aus Lockface-Zellen zu verwenden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der DNA-Reparatur, um die Dichte und den Strang zu quantifizieren, in den Ribonukleotide durch die replikativen DNA-Polymerasen eingebaut wurden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die hydrolierte Endsequenzierung oder HydEn-seq durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Position der Ribonukleotide im Genom zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Materialien äußerst gefährlich sein kann und dass immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, um eine Kontamination der Werkbank und der Ausrüstung während dieses Verfahrens zu vermeiden.