Name: Studium Ribonukleotidreduktase Aufnahme: Strang-spezifischen Nachweis von Purine Hefegenoms und Messen Ribonukleotidreduktase induzierter Mutagenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Quantifizierung von Ribonukleotid-Inkorporation in Hefe-DNA mittels alkalischer Gelelektrophorese und strangspezifischem Southern Blotting. Diese Techniken ermöglichen die Analyse genomischer Stabilität.

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Wir bedanken uns bei allen aktuelle und ehemalige Kunkel Lab Mitgliedern für ihre Arbeit und Diskussionen im Zusammenhang mit Protokoll und die hier vorgestellte Daten wiederverwendet. Diese Arbeit wurde von Projekt-Z01-ES065070, T.A.K. aus der Division des intramuralen Forschung von den National Institutes of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) unterstützt.

1. alkalische Hydrolyse und Strang-spezifische Südlicher Fleck (Abbildung 1)
<ol><li>Zellwachstum und genomische DNA-Isolierung<ol>
<li>Isolieren Sie Hefe genomischer DNA mit einer Hefe DNA-Reinigung-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie die Kulturen, die in der exponentiellen Wachstumsphase (eine optische Dichte von 0,5) bis 1 sind. Aufschwemmen der letzten DNA-Pellet in 35 mL 1 x TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)).</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL von 5 mg/mL RNase A an die DNA und 30 min bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Überstürzen sich die DNA mit 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol für 20 min auf Eis.</li>
		<li>Zentrifuge bei 16.000 x g für 20 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.</li>
		<li>Waschen Sie das Pellet zweimal mit 500 mL 70 % igem Ethanol. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.</li>
		<li>Trocknen Sie das Pellet auf Bank und Aufschwemmen in 35 ml 1 x TE-Puffer.</li>
		<li>Die DNA mit einem Fluorimeter (Table of Materials) mit DsDNA BR Assay Kit quantitate.</li>
		<li>Niederschlag von 5 mg von DNA von jeder Probe mit 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 2,5 Bände von 100 % EtOH für ein Gesamtvolumen von 200 mL (H2O hinzufügen, wenn nötig, zusätzliche 5 mg von DNA benötigt wird, wenn die neutralen Gel-Kontrolle notwendig ist). Inkubieren Sie für 20 min auf Eis.</li>
		<li>Zentrifuge bei 16.000 x g für 20 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.</li>
		<li>Trocknen Sie das Pellet auf Bank. Aufschwemmen der DNS in 14 mL H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Alkalische Hydrolyse und Gel-Elektrophorese<ol>
<li>6 mL 1 M KOH hinzugeben und bei 55 ° C für 2 h inkubieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Proben auf Eis für 5 min.</li>
		<li>Fügen Sie 4 mL 6 x Alkali DNA laden Puffer: 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8.0, 18 % Polysucrose (Table of Materials), 0,15 % Bromocresol grün und 0,25 % Xylol Cyanol FF.</li>
		<li>Werfen Sie eine alkalische Gel, die 1 % Agarose, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA pH 8.0 besteht. Verwenden Sie einen Kamm, der für 24 mL DNA-Probe erlaubt, pro Bahn geladen werden.</li>
		<li>Führen Sie das Gel bei Raumtemperatur in 1 x Alkali Elektrophorese Puffer: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Enthalten Sie einen entsprechende DNA-Größe Marker.</li>
		<li>Spin-down die Rohre kurz und laden die gesamte 24 mL Probe in der alkalischen Agarosegel. Electrophorese für 30 min bei 30 V, gefolgt von 18-20 h bei 10 V.</li>
		<li>Das Gel für 2 Inkubationen von 45 min bei Raumtemperatur mit sanften Agitation in Neutralisation Puffer I: 1 M Tris-HCl, 1,5 M NaCl zu neutralisieren.</li>
		<li>Färben Sie die DNA durch Einweichen der neutralisierten Gels in 200 mL Wasser mit einer Verdünnung von 1/10.000 SYBR Gold Fleck für 2 h bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.</li>
		<li>Visualisieren Sie die DNA mit Hilfe einer UV-Transilluminator. Erhöhter Alkali-Empfindlichkeit bewirkt, dass die Darstellung von kleineren DNA-Fragmenten, zeigt eine höhere Dichte von unrepariert Purine DNA-5.</li>
	</ol></li>
	<li>Südlichen transfer<ol>
<li>Übertragen Sie die DNA aus dem basischen Gel auf die positiv geladenen Nylon-Membran durch Kapillarwirkung10. In Sambrook und Russell es manuelle10kostenfrei ein Beispiel dafür, wie diese Übertragung einrichten kann.</li>
		<li>Einweichen der alkalische Gel für 15 min bei Raumtemperatur in alkalischen Puffer übertragen: 0,4 M NaOH, 1 M NaCl.</li>
		<li>Die Nylon-Membran (Schneiden auf die Größe des Gels) kurz mit Wasser nass, und dann einweichen für 5 min in alkalischen Puffer übertragen.</li>
		<li>Richten Sie die Transfer-Plattform durch invertieren 3 Glas Becher (100 mL) in ein Glas Auflaufform. Dieses Gericht sollte etwas größer als die Größe der Agarosegel. Legen Sie eine Glasplatte über Oberseite von ihnen.</li>
		<li>Drapieren Sie 2 große Stücke von 3 MM CHR Chromatographiepapier (Schneiden auf die Größe der Breite des Gel plus längeren Seiten, die über die Kanten in den Puffer Vorratsbehälter drapieren können) über die Glasplatte.</li>
		<li>Das Chromatographiepapier alkalischen Puffer übertragen übergießen und die Hälfte der Glasschale füllen. Glätten Sie die Bläschen mit einer 5-mL-Glas-Pipette.</li>
		<li>Legen Sie das Agarosegel auf, die Bläschen wieder glätten. Umgeben Sie alle Kanten des Gels mit Parafilm. Gießen Sie eine kleine Menge von alkalischen Puffer übertragen auf das Gel.</li>
		<li>Legen Sie die eingeweichter Nylon-Membran auf das Gel. Glätten Sie die Luftblasen.</li>
		<li>Nassen 2 Stück Papier schneiden auf die Größe der Agarose-Gel. Legen sie auf der Membran, und glätten Sie Bläschen.</li>
		<li>Legen Sie einen großen Stapel Papier Handtücher (Schnitt, etwas größer als das Agarosegel) auf den Transfer-Sandwich. Legen Sie vorsichtig eine Glasplatte auf das Küchenpapier. Fügen Sie eine gewichtete Objekt nach oben (ein Buch mit einer Masse von 400 g funktioniert gut).</li>
		<li>Lassen Sie die Übertragung über Nacht bei Raumtemperatur gehen.</li>
		<li>Sorgfältig die Transfer-Stack auseinander nehmen und genießen die Membran für 15 min bei Raumtemperatur in Neutralisation Puffer II: 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 1 M NaCl.</li>
		<li>Crosslink die DNA der geladenen Nylon-Membran mit einer UV-Vernetzer. Legen Sie die Membran in der Vernetzer und verwenden Sie die Autocrosslink-Einstellung.</li>
	</ol></li>
	<li>Südlichen Sonde Vorbereitung Hinweis: Zur Erkennung alkaliempfindlichen Websites in der im Entstehen begriffenen führenden-im Vergleich zu Verzögerungsstrang des DNA-Strangs basiert auf einem Protokoll der hier beschriebene Ansatz vorher11veröffentlicht. Für unser Experiment sondieren das URA3 Reportergen erfolgt auf die in einem der beiden Ausrichtungen (OR1 oder OR2) angrenzend an die ARS306 Replikation Herkunft auf Chromosom III (Abbildung 3A) eingefügt wurde. Die Anwesenheit von Alkali-empfindlichen Standorten in Hefe genomischer DNA ist ein Indikator für Ribonukleotidreduktase Gesellschaftsgründung, erlaubt die Verwendung von Purine als Biomarker der DNA-Polymerase-Aktivität12,13,14. Dieser Ansatz, mit einem Ziel DNA-Sequenz angrenzend an den effizienten ARS306 Ursprung der Replikation, sollte zu anderen genomischen Orten und Zielgene sowie zugänglich sein.<ol>
<li>PCR-verstärken-520-Base paar Segment des reportergens URA3 unter Verwendung der folgenden Primerpaar: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) und URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).</li>
		<li>Durchführung die PCR-Reaktion mit 10-20 ng Hefe genomic DNA als Vorlage, 4 μL jeder Grundierung (10 μM Lager), 10 μl 10 x Ex Taq Puffer (Mg2 + plus), 8 μl dNTP-Gemisch (2,5 mM), 0,5 μL des Ex-Taq DNA-Polymerase (5 U/μl) , und passen Sie das Endvolumen zu 100 μL mit H2O.</li>
		<li>Führen Sie das folgende PCR-Programm: 95 ° C für 5 min; 30 Zyklen von 95 ° C für 1 min, 55 ° C für 1 min, 72 ° C für 2 min; 72 ° C für 10 min und Halt bei 4 ° C.</li>
		<li>Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem PCR-Reinigung-Kit und eluieren der DNS mit 50 mL H2O. Hiermit kann jetzt als Vorlage in die radiolabeling Reaktion.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgenden Primer für Strang-spezifische enzymatische: Verwendung URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) zur Visualisierung von DNA, die Sonde A. glüht Dies entspricht der im Entstehen begriffenen führenden Strang DNA Wenn URA3 in OR2 und der rückständigen Strang DNA, wenn URA3 in OR1 ist Tnascent. Verwenden Sie URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) zur Visualisierung von entstehenden DNA, die Sonde B. glüht Dies entspricht der im Entstehen begriffenen führenden Strang DNA Wenn URA3 in OR1 und im Entstehen begriffene rückständigen Strang DNA Wenn URA3 OR2 wird (Abbildung 3).<ol>
<li>Führen Sie die radiolabeling Reaktion mit 10-20 ng verstärkt URA3 Fragment als Schablone DNA, 2 μL der Primer (10 μM bestand), 5 μL 10 x Ex Taq Puffer (Mg2 + plus), 4 μL von 2,5 mM dNTPs (abzüglich dCTP), 5 μL (50 μCi) der a -32P-dCTP , 0,5 μL der ExTaq DNA-Polymerase (5 U/μl) und die letzte Lautstärke zu 50 μL mit H2O. Run Folgendes für enzymatische Programm: 94 ° C für 5 min; 25 Zyklen von 94 ° C für 1 min, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 1 min; 72 ° C für 5 min und Halt bei 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden Sie eine G-25 Spin-Spalte, um nicht inkorporierten radioaktiven Etikett zu entfernen. Vor Zugabe der radioaktiven Probe, Zentrifugieren der Spalte für 1 min bei 720 x g und Monta-Puffer durch pipettieren. Laden Sie die radioaktiven reaktionsproduktes und Zentrifuge für 2 min bei 720 X g, um die markierte Sonde eluieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie bei 95 ° C für 5 min um die Sonde unmittelbar vor der Hybridisierung zu denaturieren. Kurz auf Eis abkühlen.</li>
	</ol></li>
	<li>Southern-Hybridisierung<ol>
<li>Die benetzte Membran in einer Hybridisierung Röhre Rollen und 25 mL frisch zubereitete Hybridisierung Puffer: 0,5 M-Natrium-Phosphat-Puffer, pH 7,2, 7 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), 1 % Rinderserumalbumin (BSA). Bei 65 ° C für 1-2 h mit Drehung in eine Hybridisierung Ofen inkubieren.</li>
		<li>Vorsichtig Gießen Sie die Lösung und 25 mL Hybridisierung Puffer plus möglicher Sonde. Bei 65 ° C für 16-18 h mit Rotation inkubieren.</li>
		<li>Gießen Sie die Lösung in einen radioaktiven Abfallbehälter. Führen Sie 5 Wäschen von 5 min bei Raumtemperatur mit Phosphat-SDS waschen Lösung I: 40 mM Natrium-Phosphat-Puffer, pH 7,2, 5 % SDS, 0,5 % BSA, 1 mM EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>Führen Sie 2 Wäschen von 15 min bei 65 ° C mit Phosphat-SDS waschen Lösung II: 40 mM-Natrium-Phosphat-Puffer, pH 7,2, 1 % SDS, 1 mM EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>Entfernen Sie die Membran aus der Hybridisierung Tube mit einer Pinzette zu und legen Sie in einem geöffneten Kunststoffhülse Beschützer. Decken und setzen auf eine speicherfolie. Versuchen Sie eine Reihe von verschiedenen Belichtungszeiten von 4 h bis hin zu 4D.</li>
		<li>Falls erforderlich, Streifen und Re Sonde den Fleck mit einer anderen Sonde ca. 3 - 4 mal. Um zu Streifen, brüten Sie die Membran für 2 h bei 65 ° C in 25 mL einer 50 % Formamid, 2 X SSPE-Lösung. Hinweis: 20 X SSPE-Stammlösung: 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4, 0,02 M EDTA, pH 7.4.</li>
		<li>Gießen Sie die Lösung in einen radioaktiven Abfallbehälter. Phosphat-SDS waschen Lösung II führen Sie 2 Wäschen von 15 min bei 65 ° C.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Membran mit einem Geigerzähler und wiederholen Sie stripping Protokoll zu, wenn Signal bleibt.</li>
		<li>Führen Sie Pre-Hybridisierung und Hybridisierung, wie oben beschrieben.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Messung der Mutationsrate und Spezifität in S. Cerevisiae -Stämmen
<ol><li>Vorbereiten der Zellkultur<ol>
<li>Impfen Sie eine einzige Kolonie (gesunder Hefe Zellen dauert ca. 2-3 Tage bei 30 ° C zu bilden, die richtige Größe Kolonien) gewachsen auf YPD Agar ergänzt mit 100 mg/mL Adenin in 5 mL YPDA Brühe ergänzt mit 250 mg/mL Adenin (die Ergänzung von Adenin ist nur notwendig wenn der verwendete Stamm ist ein Adenin-Auxotroph). Wachsen Sie in einem Shaker Inkubator oder auf ein Rotator bei 30 ° C, bis die Kultur Sättigung (36-48 h für eine Sorte ohne einen starken Wachstum defekt) erreicht.</li>
		<li>Spin-down der Zellen bei ~ 2000 X g für 5 Minuten.</li>
		<li>Den überstand verwerfen und die Zellen mit 5 mL sterilem Wasser zu waschen.</li>
		<li>Die Zellen in 500 mL sterilem Wasser aufschwemmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdünnung der Zellkultur und Beschichtung<ol>
<li>Verdünnen Sie für nicht-Auswahl Steuerelemente die Zellen in einer 96-Well-Platte mit einem Faktor von 1.600.000 und Platte 100 mL einer jeden Kultur auf eine komplette Platte (COM).</li>
		<li>Wählen Sie für ura3 Mutanten, Platte 100 mL der unverdünnten Zellen auf einen 5-FOA Teller für ein Wildtyp (WT) Belastung. Verdünnen Sie die Zellen entsprechend, wenn die Mutationsrate der Belastung von Interesse wird voraussichtlich höher sein als in einem WT-Stamm.</li>
		<li>Can1 Mutanten auswählen, die Zellen 5-fach verdünnen und 100 mL auf einen Canavanine-haltigen Teller (CAN) für eine Belastung von WT-Platte. Der Verdünnungsfaktor ist 0,5.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C bis Hefe Kolonien bilden. Für Stämme ohne Wachstum Mangel 2-3 Tage reicht in der Regel für COM und können Platten und 3-5 Tage für 5-FOA Platten. Um die Mutationsraten zwischen verschiedenen Stämmen zu vergleichen, ist es am besten, am selben Tag des Wachstums zu Kolonien zählen zu wählen. Speichern Sie die Platten bereit, in den kalten Raum (~ 4 ° C) gezählt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Berechnung der spontanen Mutationsrate<ol>
<li>Zählen Sie sichtbare Kolonien auf jeder Platte zu und machen Sie sich Notizen von Kolonie Zahlen</li>
		<li>Die Mutationsrate mit Drake Formel zu berechnen: μ = f ÷ ln (μNt). f ist die Mutation Frequenz berechnet, indem die Anzahl der Mutanten, geteilt durch die Anzahl der Zellen in der letzten Kultur. NT ist die Anzahl der Zellen in der letzten Kultur und μ ist die Mutationsrate. Diese Gleichung kann durch eine iterative Methode wie die Newton-Raphson Methode gelöst werden. Es gibt andere Schätzer Methoden, einschließlich des Lea und Coulson Tests, um die Mutation Rate15berechnen.</li>
		<li>Berechnen Sie das Konfidenzintervall vorausgesetzt Log Normalverteilung der Raten geht von einzelnen Isolate. Das 95 %-Konfidenzintervall wird am häufigsten verwendet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse der Mutation Spektrum<ol>
<li>Wählen Sie eine einzige Kolonie von jeweils 5-FOA oder Platte können, und aktualisieren Sie auf einer YPDA Platte.</li>
		<li>Führen Sie Kolonie PCR URA3 oder CAN1 gen und Sequenz zu verstärken, um Mutationen, die unter Verwendung der folgenden Zündkapseln zu erkennen: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3 ") und URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3") für beide PCR-Amplifikation und Sequenzierung des Gens URA3 800 bp; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3 ") und CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3") zur Verstärkung und CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3 "), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3"), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3 ") und CAN1-BR ( 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3 ") für die Sequenzierung des reportergens 1800 bp CAN1 .</li>
		<li>Um Kolonie PCR durchzuführen, eine einzige Kolonie in 5 μL von H2O aufschwemmen und 1 μl als Vorlage verwenden. Fügen Sie 1 μL jeder der Primer (5 μM bestand), 2 μL der 5 x KAPA2G-Puffer (Mg2 + plus), 0,5 μl dNTP (2,5 mM), 0,5 μL des KAPA2G schnell DNA-Polymerase, 12 μL von H2O.</li>
		<li>Für die Verstärkung des URA3 -Gens, führen Sie das folgende PCR-Programm: 95 ° C für 5 min; 5 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 61 ° C für 15 s, 72 ° C für 30 s; 35 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 61 ° C für 15 s, 72 ° C für 30 s; 72 ° C für 2 min und Halt bei 4 ° C. Für die Verstärkung des CAN1 Gens, führen Sie das folgende PCR-Programm: 95 ° C für 5 min; 5 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 61 ° C für 15 s, 72 ° C für 45 s; 35 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 61 ° C für 15 s, 72 ° C für 45 s; 72 ° C für 2 min und Halt bei 4 ° C.</li>
		<li>Richten Sie die Ergebnisse der Sequenzierung zu einer referenzsequenz mit einem Programm wie DNASTAR Seqman Pro oder Sequencher Mutationen zu identifizieren.</li>
		<li>Kompilieren Sie die Mutationen Daten durch Mutation Typ (Abbildung 4) oder Mutation Position (Abbildung 5). Berechnen Sie die Gesamtrate der Mutation die spezifische Mutation Preise durch die Häufigkeit einer Mutation (die Anzahl der beobachteten Ereignisse geteilt durch Anzahl der Mutanten, die sequenziert) multipliziert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016(2012).</li>
<li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir die Protokolle für zwei Sätze von Experimenten, die häufig verwendet werden, um Purine aufgenommen während der DNA-Replikation und die mutagene Wirkung von unrepariert Purine Semi-quantitativ zu analysieren. Obwohl diese Ansätze die Modell Eukaryote S. Cerevisiaebeinhalten, können diese Techniken leicht zu anderen Mikroben und noch höheren Eukaryoten angepasst werden.
Sondierung für unrepariert Purine in DNA mit Hilfe von alkalischen Agarose Elektrophorese gepaart...

Während der eukaryotischen nukleare DNA-Replikation fließen Purine in das Genom von allen drei großen DNA Replicases, DNA-Polymerasen (Pols) α, ε und δ1,2. RNase H2-abhängige Ribonukleotidreduktase Exzision Reparatur (RER3) wird den Großteil dieser eingebetteten Purine entfernt.
Ribonukleotidreduktase in DNA ist anfällig gegenüber Hydrolyse, 2'-Hydroxylgruppe des Zucker-Verbindungsgruppe die angrenzenden Phosphodiester-Anleihe, Freigabe von einem Ende mit einer zyklischen Phosphat 2' - 3' und das andere mit einer 5'-OH-4angreifen kann. Alkalische Bedingungen können diese Reaktion erheblich beschleunigt. So verursacht die Hydrolyse von eingebetteten Purine während der Inkubation in eine Basislösung Fragmentierung der genomischen DNA, die durch alkalische Agarose Elektrophorese5visualisiert werden kann. Diese DNA kann auf eine Membran übertragen und sondiert durch südlicher Fleckanalyse mit Strang-spezifischen Sonden, die es die Identifizierung von alkaliempfindlichen Websites durch Purine aufgenommen in der im Entstehen begriffenen führenden ermöglichen- oder -Verzögerungsstrang DNA verursacht, bzw..
In Hefezellen RNase H2 Aktivität fehlt kann Abbau der Purine eingeleitet werden, wenn Topoisomerase ich (Top1) die DNA im eingebetteten Ribonukleotidreduktase6,7 Nicks. Jedoch wenn Top1 auf 3' der die Ribonukleotidreduktase zerspaltet, generiert das 5'-OH und 2' - 3' zyklischen Phosphat DNA-enden, die refraktär gegenüber Religation sind. Reparatur oder abweichende Verarbeitung diese'schmutzigen 'enden können, genomische Instabilität führen. Darüber hinaus tritt der Schnitt innerhalb von einer wiederholte DNA-Sequenz, kann die Reparatur-Prozess zu Löschung Mutationen führen. Dies ist besonders problematisch für Tandem wiederholt, wo kurze Deletionen (von zwischen zwei und fünf Basenpaaren) sind häufig in RNase H2-defizienten Zellen beobachtet. Die Top1-abhängige schädlichen Wirkungen bei fehlender Hefe RNase H2 Aktivität werden in eine DNA-Polymerase ε Mutante (pol2-M644G) promiscuous Ribonukleotidreduktase Aufnahme während der im Entstehen begriffenen führenden Strang-Synthese verstärkt.
Verarbeitung der Purine in DNA führt zu spontanen Mutationen und diese Mutagenese kann durch die Verwendung geeigneter Reporter-Gene und Auswahl für die begleitenden phänotypische Veränderung erkannt werden. Eine Fluktuation Test oder Luria und Delbrück Experiment ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden, um spontane Mutation mit wählbaren Reporter Gene8,9messen. In Hefe können die URA3 und CAN1 Gene als Reporter in einem vorwärts Mutation Assay verwendet werden, ermöglicht die Erkennung aller Arten der Mutation, die zum Verlust der Genfunktion. Die spontane Mutationsrate dürfte als der Median, die für mehrere parallele Kulturen begann aus einzelnen Kolonien ohne Mutationen in das Zielgen Reporter beobachtet. Eine Hefe RNase H2-defizienten Stamm wie rnh201Δ hat einen leicht erhöhten insgesamt spontane Mutationsrate, die weitgehend von einer erhöhten Inzidenz von 2-5 bp Löschungen im Tandem verursacht wird wiederholen Sequenzen. Also, um die mutagenen Wirkungen der Purine im Genom vollständig zu charakterisieren, spezifische Mutationsraten müssen ermittelt werden. In diesem Fall URA3 oder CAN1 Reporter-Gene können verstärkt und sequenziert, um festzustellen, die Typen und Standorte der Mutationen, und spezifische Mutationsraten errechnet werden. Kompilieren von Mutationen identifiziert in mehrere unabhängige URA3 oder CAN1 Mutanten kann dann verwendet werden, um eine Mutation-Spektrum zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td>YPD-Medien</td><td></td><td></td><td>20 g Dextrose, 20 g Pepton, 10 g Hefeextrakt, in deionisiertem H2O bis zu 1 L, 20 g Bacto-Agar für feste Medien zugeben, autoklavieren.</td></tr><tr><td>COM-Platten</td><td></td><td></td><td>1,3 g SC-Dropout-Mix, 1,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren oder (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g Dextrose, 20 g Bacto-Agar deionisiert H2O bis zu 1 L. pH-Wert auf 5,8 einstellen. Autoklav und 30 &ndash; 35 ml pro Platte.</td></tr><tr><td>CAN-Platten</td><td></td><td></td><td>1,3 g SC-Ura Dropout-Pulver, 1,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren oder (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g Dextrose, 20 g Bacto-Agar, 25 mg Uracil und H2O bis zu 1 L. Autoklav für 15 Min. bei 121 & Grad; C und auf 56 °C abkühlen lassen. 6 ml filtersterilisierte 1%ige Canavaninsulfatlösung hinzufügen.</td></tr><tr><td>5-FOA-Platten</td><td></td><td></td><td>1,3 g SC-Ura Dropout-Pulver, 1,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren oder (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g Dextrose, 20 g Bacto-Agar, 25 mg Uracil und H2O bis zu 800 mL. Autoklav für 15 Minuten bei 121 °; C und auf 60 °C abkühlen lassen. 200 ml filtersterilisierte 0,5%ige 5-FOA-Lösung hinzufügen.</td></tr><tr><td>L-Canavanine sulfate</td><td>US Biological</td><td>C1050</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>US Biological</td><td>F5050</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Glaskulturröhrchen</td><td></td><td></td><td>Jede Marke</td></tr><tr><td>Kulturrotator in 30 & deg; C-Inkubator</td><td></td><td></td><td>Shaker-Inkubator kann stattdessen verwendet werden</td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td></td><td></td> mit rundem Boden <td>Steril, jede Marke</td></tr><tr><td>3 mm Glasperlen</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>Autoklav vor Gebrauch</td></tr><tr><td>12-Kanal-Pipetten</td><td></td><td></td><td>Beliebige Marken</td></tr><tr><td>Ex Taq DNA Polymerase</td><td>TaKaRa</td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>Epizentrum MasterReine Hefe-DNA Aufreinigungskit</td><td>Epizentrum</td><td>MPY80200</td><td></td></tr><tr><td>3 M Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>100 % Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>Neueres Modell verfügbar</td></tr><tr><td>dsDNA BR Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td></td><td></td>DSF10400</tr><tr><td>Bromkresolgrün</td><td>Eastman</td><td>6356</td><td></td></tr><tr><td>Xylolcyanol FF</td><td>International Technologies Inc.</td><td>72120</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8,0)</td><td>Teknova</td><td>T5080</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nukleinsäure-Gel-Färbung</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>UV-Transilluminator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Nylonmembran Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>3 MM CHR Chromotographie-Papier</td><td>Whatman</td><td>3030-392</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>G-25 Spin-Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>1 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390)</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>Geigerzähler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studium ribonukleotidreduktase aufnahme: strang-spezifischen nachweis von purine hefegenoms und messen ribonukleotidreduktase induzierter mutagenese

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Das Vorhandensein der Purine in Kern-DNA hat sich gezeigt, eine Quelle der genomischen Instabilität sein. Das Ausmaß der Ribonukleotidreduktase Aufnahme beurteilt werden kann, durch alkalische Hydrolyse und gel-Elektrophorese als RNA Hydrolyse in alkalischen Bedingungen sehr anfällig ist. Dies, in Kombination mit südlicher Fleckanalyse lässt sich bestimmen Sie den Speicherort und Litze in die der Purine aufgenommen wurden. Aber dieses Verfahren ist nur semi-quantitativen und möglicherweise nicht empfindlich genug, um kleine Änderungen in Ribonukleotidreduktase Inhalte zu erkennen, obwohl das Strang-spezifische Südlicher Fleck sondieren die Empfindlichkeit verbessert. Als Maß für eines der auffälligsten biologischen Folgen der Purine in DNA kann spontane Mutagenese mit einem vorwärts Mutation Assay analysiert werden. Mit entsprechenden Reporter-Gene, können seltene Mutationen, die den Verlust der Funktion ausgewählt und allgemeine und spezifische Mutationsraten gemessen werden, indem Daten aus Fluktuation Experimente mit DNA-Sequenzierung des reportergens. Die Fluktuation-Assay ist für eine Vielzahl von mutagenen Prozessen in spezifischen genetischen Hintergrund oder Wachstumsbedingungen zu untersuchen.

Behandlung von genomischer DNA mit Alkali, gefolgt von alkalischen Gelelektrophorese erlaubt semiquantitativen Nachweis von DNA-Fragmentierung wegen der Fülle an stabil eingebaute Purine. Abbildung 2 zeigt die Gelbilder der Hefe genomischer DNA mit oder ohne KOH5behandelt. Die M644L Variante des Pol2, die katalytische Untereinheit der Polε, hat die Möglichkeit, Purine zu integrieren, während die M644G mutierten mehr Purine als WT-Polym...

Purine gehören zu den am häufigsten vorkommenden nicht-kanonischen Nukleotiden während Eukaryotische nukleare DNA-Replikation in das Genom integriert. Wenn nicht richtig entfernt, verursachen Purine DNA-Schäden und Mutagenese. Hier präsentieren wir Ihnen zwei experimentelle Ansätze, die verwendet werden, um die Fülle der Ribonukleotidreduktase Einbindung in DNA und seine mutagenen Wirkungen zu beurteilen.

Studium Ribonukleotidreduktase Aufnahme: Strang-spezifischen Nachweis von Purine Hefegenoms und Messen Ribonukleotidreduktase induzierter Mutagenese

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Diese Methode kann helfen, Fragen zu beantworten, z. B. wie viele Ribonukleotide in die entstehende, führende und nachlaufende Strang-DNA im Genom eingebaut sind. Obwohl diese Methode quantitative und qualitative Informationen über die Ribonukleaotiddichte im Hefegenom liefern kann, kann sie auch auf andere Systeme, wie z. B. Säugetiergenome, angewendet werden. Die alkalische Gelelektrophorese bietet einen semiquantitativen Überblick über den Ribonukleotideinbau in das gesamte Genom und das strangspezifische Southern-Blotting ermöglicht eine höhere Sensitivität und Quantifizierung an einem spezifischen genomischen Ort.Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie jeder Probe frisch zubereiteter genomischer Hefe-DNA sechs Mikroliter eines molaren Kaliumhydroxids hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 55 Grad Celsius. Nach zwei Stunden inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang auf Eis. Geben Sie dann zu jeder Probe vier Mikroliter 6-6 alkalischen DNA-Ladepuffer.Gießen Sie ein alkalisches Gel, das aus einem Prozent Agarose, 50 Millimolar Natriumhydroxid und einem Millimolaren EDTA pH Acht besteht, mit einem Kamm, mit dem 24 Mikroliter DNA-Probe pro Bahn geladen werden können. Drehen Sie die Röhrchen mit den Proben kurz herunter. Laden Sie die gesamten 24 Mikroliter jeder Probe in das alkalische Agarosegel.Fügen Sie einen geeigneten DNA-Größenmarker hinzu. Elektrophorese bei 30 Volt für 30 Minuten. Senken Sie dann die Spannung auf 10 Volt und Elektrophorese für 18 bis 20 Stunden.Am nächsten Tag neutralisieren Sie das Gel. Tauchen Sie das Gel in den Neutralisationspuffer eins und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren für 45 Minuten. Ersetzen Sie die Neutralisationspuffermischung durch frischen Puffer.Und weitere 45 Minuten inkubieren. Um die DNA zu färben, weichen Sie das neutralisierte Gel in 200 Millilitern Wasser ein, das eine Verdünnung von 1 bis 10000 Sybr-Goldfleck bei Raumtemperatur enthält, und schütteln Sie es zwei Stunden lang leicht. Visualisieren Sie die DNA mit einem UV-Transilluminator.Die DNA aus dem alkalischen Gel wird durch Kapillarwirkung auf eine positiv geladene Nylonmembran übertragen. Weichen Sie das alkalische Gel zunächst 15 Minuten bei Raumtemperatur in alkalischem Transferpuffer ein. Befeuchten Sie anschließend die Nylonmembran kurz mit Wasser und weichen Sie sie fünf Minuten lang in alkalischem Transferpuffer ein.Richten Sie die Transferplattform ein, indem Sie drei 100-Milliliter-Glasbecher in einer Glasauflaufform umdrehen, die etwas größer ist als die Größe des Agarosegels. Stellen Sie eine Glasplatte auf die Glasbecher. Drapieren Sie zwei große Stücke von drei MMCHR Chromatographiepapier über die Glasplatte.Gießen Sie alkalischen Transferpuffer über das Chromatographiepapier und füllen Sie die Glasschale zur Hälfte. Glätten Sie die Blasen mit einer Fünf-Milliliter-Glaspipette. Lege das Agarose-Gel darauf.Wieder die Blasen glätten. Umgeben Sie alle Ränder des Gels mit Parafilm. Gießen Sie eine kleine Menge alkalischen Transferpuffer auf das Gel.Legen Sie die vorgetränkte Nylonmembran auf das Gel und glätten Sie die Blasen. Legen Sie zwei Stücke Chromatographiepapier auf die Größe des Agarosegels zugeschnitten. Legen Sie sie auf die Membran und glätten Sie alle Blasen.Lege einen großen Stapel Papiertücher auf das Transfersandwich und lege vorsichtig eine Glasplatte auf die Papiertücher. Legen Sie einen beschwerten Gegenstand auf die Oberseite und lassen Sie die Übertragung über Nacht bei Raumtemperatur durchführen. Nehmen Sie am nächsten Tag den Transferstapel vorsichtig auseinander.Die Membran bei Raumtemperatur in Neutralisationspuffer zwei 15 Minuten einweichen. Vernetzen Sie die DNA mit der geladenen Nylonmembran mit einem UV-Vernetzer. Verwenden Sie die Einstellung für automatische Querverknüpfung.Vor Beginn des Hybridisierungsverfahrens ist die radioaktiv markierte Sonde wie im Textprotokoll beschrieben vorzubereiten. Rollen Sie die benetzte Membran in ein Hybridisierungsröhrchen und fügen Sie 25 Milliliter frisch zubereiteten Hybridisierungspuffer hinzu. Inkubieren Sie eine Temperatur von 65 Grad Celsius mit Rotation in einem Hybridisierungsofen für ein bis zwei Stunden.Gießen Sie die Lösung vorsichtig ab und fügen Sie 25 Milliliter Hybridisierungspuffer plus die Sonde hinzu. Inkubieren Sie bei 65 Grad Celsius für 16 bis 18 Stunden mit Rotation. Gießen Sie dann die Lösung in einen Behälter für radioaktive Abfälle.Geben Sie die Phosphat-STS-Waschlösung eins in das Hybridisierungsröhrchen und drehen Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Führen Sie auf diese Weise fünf Waschgänge von jeweils fünf Minuten mit Phosphat-STS-Waschlösung eins durch. Nach der fünften Wäsche mit Phosphat-STS-Waschlösung einmal die Membran zweimal mit Phosphat-STS-Waschlösung waschen, zwei Mal für 15 Minuten bei 65 Grad Celsius mit Rotation.Entfernen Sie die Membran mit einer Pinzette aus dem Hybridisierungsröhrchen und legen Sie die Membran in einen geöffneten Kunststoffhüllenschutz. Abdecken und auf eine Speicherfolie belichten. Falls erforderlich, entfernen Sie den Blot und sondieren Sie ihn erneut mit einer anderen Sonde.Zum Abstreifen bedecken Sie die Membran mit 25 Millilitern einer 50-prozentigen Formamid-2XSSPE-Lösung und inkubieren zwei Stunden lang bei 65 Grad Celsius. Gießen Sie die Lösung in einen Behälter für radioaktive Abfälle. Geben Sie die zweite Phosphat-STS-Waschlösung in das Hybridisierungsröhrchen und drehen Sie sie 15 Minuten lang bei 65 Grad Celsius.Überprüfen Sie die Membran mit einem Geigerzähler, um das Fehlen eines Signals zu bestätigen, bevor Sie die Prähybridisierung und Hybridisierung durchführen, wie zuvor gezeigt. Diese Gelbilder mit genomischer Hefe-DNA, die mit oder ohne Kaliumhydroxid behandelt wurde, zeigen, dass die Zellen, denen RNH2 fehlt, mehr Ribonukleotide im Genom behalten. Die M644L-Variante der Polymerase zwei reduziert die Fähigkeit, Ribonukleotide einzubauen, während die M644G-Mutante mehr Ribonukleotide enthält als die Wildtyp-Polymerase.Ein alkalisches Agarose-Gel kann durch eine strangspezifische Southern-Blot-Analyse weiter untersucht werden. In diesem Beispiel glühen die Sonden an den entstehenden führenden DNA-Strang innerhalb des URA3-Reportergens, der in der Nähe von ARS306 in zwei entgegengesetzten Orientierungen eingefügt wurde. Repräsentative Ergebnisse des Southern-Blottings unter Verwendung der naszierenden führenden strangspezifischen Sonden zeigen ein DNA-Fragmentierungsmuster, das durch die Alkalispaltung an Ribonukleotiden und naszierenden führenden Strängen der DNA in einem Wildtypstamm und in Stämmen verursacht wird, die die Varianten der Polymerasen alpha, delta und epsilon exprimieren, die promiskuitiv für den Ribonukleotideinbau sind.Diese Grafik zeigt die Quantifizierung des radioaktiven Signals nach einem Bruchteil der Gesamtmenge in jeder Spur ab dem Southern Blot. Beim Versuch des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, immer frisch isolierte DNA aus Lockface-Zellen zu verwenden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der DNA-Reparatur, um die Dichte und den Strang zu quantifizieren, in den Ribonukleotide durch die replikativen DNA-Polymerasen eingebaut wurden.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die hydrolierte Endsequenzierung oder HydEn-seq durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Position der Ribonukleotide im Genom zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Materialien äußerst gefährlich sein kann und dass immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, um eine Kontamination der Werkbank und der Ausrüstung während dieses Verfahrens zu vermeiden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Genetische Studien in Hefe kann eingesetzt werden, um die molekularen und zellulären Funktionen der menschlichen Gene in Zellen DNA-Stoffwechsel zu untersuchen. Es werden Methoden für die genetische Charakterisierung des menschlichen...

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

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Studium Ribonukleotidreduktase Aufnahme: Strang-spezifischen Nachweis von Purine Hefegenoms und Messen Ribonukleotidreduktase induzierter Mutagenese (Video) | JoVE Journal

Studium Ribonukleotidreduktase Aufnahme: Strang-spezifischen Nachweis von Purine Hefegenoms und Messen Ribonukleotidreduktase induzierter Mutagenese

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