Die Nutzung von Maus Splenocyten, Pathogen-assoziierte molekulare Muster Einfluss auf die Genexpression Uhr abzuschätzen

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen aus der Immunologie und Chronobiologie zu beantworten, etwa wie mikrobielle Komponenten die molekulare Uhr verändern. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie einfach durchzuführen ist, die Auswirkungen verschiedener mikrobieller Komponenten auf die molekulare Uhr bewertet werden und sie sehr gut reproduzierbar ist. Bereiten Sie zu Beginn des Protokolls das Kulturmedium vor, indem Sie fötales Rinderserum zu RPMI 1640 bis zu einer Endkonzentration von 10 % hinzufügen. Bereiten Sie 10 Milliliter Provokationsmedium für jedes der zu testenden PAMPS in 50-Milliliter-Röhrchen vor, indem Sie das aufgeführte PAMP-Kulturmedium hinzufügen.

Besprühen Sie einen zuvor vorbereiteten Mäusestamm mit 70%igem Ethanol und wischen Sie ihn mit einem Papiertuch ab. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken und neigen Sie leicht auf die rechte Seite. Schneiden Sie dann das Fell mit einer Präparierschere entlang der linken Seite der Maus ab, etwa auf halber Höhe zwischen den Vorder- und Hinterbeinen.

Fassen Sie mit einer Pinzette das Bauchfell und machen Sie vorsichtig einen Schnitt, ohne die Milz zu beschädigen. Entfernen Sie die Milz mit einer Pinzette und legen Sie sie in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen mit etwa 10 Millilitern Nährmedium auf Eis. Dann geben Sie die Milz mit zwei Millilitern Nährmedium in eine kleine, sterile Petrischale.

Homogenisieren Sie die Milz, indem Sie sie zwischen dem mattierten Teil von zwei sterilen mattierten Objektträgern mahlen. Nach der gründlichen Homogenisierung pipettieren Sie die zwei Milliliter Kulturmedium mit den Splenozyten durch ein 40-Mikron-Nylon-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie acht Milliliter kaltes Kulturmedium in jedes der 50-Milliliter-Röhrchen mit den Splenozyten, was ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern pro Röhrchen ergibt.

Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter mit einem Hämozytometer. Geben Sie ungefähr eins mal 10 zu den sechsten Zellen pro Vertiefung auf Sechs-Well-Kulturplatten. Nach dem Hinzufügen der Zellen geben Sie drei Milliliter Kulturmedium oder drei Milliliter Challenge-Medium zu den Zellen.

Dann inkubieren Sie die Platten drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Kratzen Sie die Zellen mit einer 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze, die an einer P1000-Mikropipette befestigt ist, vom Boden der Vertiefung ab. Übertragen Sie mit derselben Pipettenspitze das Medium mit den Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Pelletieren Sie die Zellen bei 167 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet mit fünf Millilitern PBS. Nachdem Sie die Zellen ein zweites Mal bei 167 mal g für fünf Minuten pelletiert haben, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie dem Zellpellet 600 Mikroliter Lysepuffer hinzu.

Isolieren Sie RNA aus Splenozyten mit dem RNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers und führen Sie den optionalen DNA-Verdau auf der Säule durch. Synthetisieren Sie cDNA für jede der Proben mit dem reversen Transkriptionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 10 Mikroliter RNA für jede der Proben in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 Mikrolitern.

Ziehen Sie mRNA aus einigen Kontrollproben in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen, um die cDNA für die Standardkurve bei der quantitativen PCR vorzubereiten. Fügen Sie 10 Mikroliter 2X reverse Transkriptase-Mastermix hinzu. Nach Abschluss der reversen Transkription werden 10 Mikroliter Wasser in das Reaktionsröhrchen gegeben, das als Ausgangskonzentration in der Verdünnungsreihe für die Standardkurve dient.

Führen Sie eine zehnfache Verdünnungsreihe durch, indem Sie 45 Mikroliter Wasser in vier 0,5-Milliliter-Röhrchen geben, die mit 10 zu minus eins, 10 zu minus zwei, 10 zu minus drei und 10 zu minus vier bezeichnet werden. Geben Sie fünf Mikroliter der Ausgangskonzentration eins in das zweite Röhrchen, 10 bis minus eins, mit einer P20-Mikropipette. Mischen Sie, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren und dann fünf Mikroliter von der 10 in die minus eine Tube in die mit 10 bezeichnete Tube in die mit minus zwei bezeichnete Tube geben und mischen.

Übertragen Sie fünf Mikroliter mit einer P20-Mikropipette vom 10- zum Minus-Zwei-Röhrchen in das Röhrchen mit der Bezeichnung 10 zu minus drei und mischen Sie. Zum Schluss fünf Mikroliter mit einer P20-Mikropipette vom 10- zum Minus-Drei-Röhrchen in das Röhrchen mit der Aufschrift 10 zu minus vier geben und mischen. Bereiten Sie die Reaktion so vor, dass sie 0,5 Mikroliter des Primer-Sonden-Assays, fünf Mikroliter Genexpressions-Mastermix, zwei Mikroliter Wasser und 2,5 Mikroliter cDNA enthält.

Pipettieren Sie die RNA-Proben in eine 96-Well-qPCR-Platte. Inkubieren Sie Primer-Sonden-Assays für verschiedene molekulare Uhrengene und fügen Sie einen Assay für eine endogene Kontrolle hinzu und laden Sie ihn in eine qPCR-Maschine, um die relative Quantifizierung der mRNA-Spiegel zu bestimmen. Wählen Sie innerhalb des Versuchsaufbaus die Quantifizierung, die relative Standardkurve und die TaqMan-Chemie aus.

Ändern Sie anschließend das Reaktionsvolumen auf 10 Mikroliter. Geben Sie die relevanten Informationen in das Plattenlayout ein. Die qPCR wurde an isolierter RNA durchgeführt, um die relativen Expressionsniveaus der molekularen Uhrengene clock, clock, Per2, Dbp und Rev-erb alpha zu bestimmen.

Nach der PAMP-Provokation unterschieden sich die Taktexpressionsniveaus nicht signifikant im Vergleich zu Kontrollzellen. Die Per2-Expressionsniveaus waren in Zellen, die mit LPS und ODN1826 konfrontiert waren, im Vergleich zu nicht angegriffenen Kontrollen signifikant erhöht. LPS war das einzige PAMP, das die Rev-erb-alpha-Expression veränderte, da die mRNA-Spiegel signifikant niedriger waren als bei den unangefochtenen Kontrollen.

Im Vergleich zu den Kontrollen wurden signifikant niedrigere mRNA-Spiegel für Dbp nach Provokation mit jedem der PAMPs beobachtet. Nach diesem Verfahren können andere Moleküle als PAMPs verwendet werden, um ihren Einfluss auf die molekulare Uhr in Splenozyten zu beurteilen.