Name: Die Nutzung von Maus Splenocyten, Pathogen-assoziierte molekulare Muster Einfluss auf die Genexpression Uhr abzuschätzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Erfahren Sie, wie PAMPs die Genexpression der molekularen Uhr in Maus-Splenozyten beeinflussen. Diese reproduzierbare Methode verbindet Immunologie mit Chronobiologie und erleichtert die Untersuchung zirkadianer Mechanismen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Fakultät Forschung aus der College of Arts and Sciences Dean Büro an der University of Hartford gewährt.

Während der Studie Tierpflege und Behandlung National Institutes of Health Policy eingehalten, wurden in Übereinstimmung mit Richtlinien und wurden von der University of Hartford institutionelle Animal Tierpflege und Use Committee genehmigt.
(1) die Mitnahme von Tieren
Hinweis: Zwanzig Wochen alten männlichen B6129SF2/J Mäusen werden in der Studie verwendet.
<ol><li>Mitzureißen Mäuse auf ein 12 h Licht (standard Overhead weißes Licht) / 12 h Dunkel-Zyklus für 2 Wochen vor dem Experiment. Hinweis: Hier Zeitgeber Zeit (ZT) 0 entspricht, leuchtet und ZT12 Licht aus, unter Beibehaltung aller anderen Umweltfaktoren (z.B. Nahrungsmittel, Wasser und Raumtemperatur) konstant 21.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, und Herausforderung Medium
<ol><li>Autoklaven-Zange und sezierenden Scheren. Wickeln Sie Paare von satiniertem Objektträger in Aluminiumfolie und Autoklaven.</li>
	<li>Bereiten Sie Kulturmedium durch Zugabe von fetalen bovine Serum (FBS), RPMI 1640, eine Endkonzentration von 10 %. Vorbereitung 10 mL Medium Herausforderung in 50 mL Röhrchen durch Hinzufügen der folgenden PAMPs zu dem Kulturmedium (RPMI mit 10 % FBS); LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), Hitze-getötet Listeria Monocytogenes (108 HKLM/mL), oder ein anderes PAMP in der empfohlenen Konzentration.</li>
	<li>Kultur und Herausforderung Medium auf 37 ° C im Wasserbad erwärmen und etwa 70 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2) bei Zimmertemperatur aufbewahren.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 10 mL Kulturmedium mit 10 mL-Pipette und Pipette Hilfen für eine 50 mL-Tube und Platz auf dem Eis.</li>
	<li>Fügen Sie etwa 30 mL 70 % igem Ethanol zu einem 100 mL Becherglas und Ort endet sezieren Scheren und Pinzetten in das Becherglas, mikrobielle Kontamination zu verhindern.</li>
	<li>Bereiten Sie Lyse Puffer RNA Isolierung durch Zugabe von 10 µL β-Mercaptoethanol (unter einem Abzug vor) zu jeder 1 mL Puffer RLT in ein 50 mL-Tube. Machen Sie nur die Menge, die benötigten (600 µL pro Probe) werden ca. 1 x 106 Zellen bestehend. Hinweis: Der Puffer RLT ist ein Bestandteil der RNA-Extraktion-Kit, das die Bindung der RNA der Kieselsäure Membran unterstützt.</li>
</ol>3. Splenocyte Isolation und Herausforderung
<ol><li>Einschläfern Sie Mäuse zu einem bestimmten Zeitgeber Zeitpunkt über Narkose halten sie in ihrem ursprünglichen Käfig und den Käfig mit einer Durchflussrate von 3 L/min. weiter liefert CO2 für 1 min nach Atmung stoppt CO2 hinzufügen.</li>
	<li>Tod durch zervikale Dislokation zu bestätigen, indem Sie Daumen und Zeigefinger auf beiden Seiten des Halses an der Basis des Schädels. Oder drücken Sie einer Rute an der Basis des Schädels und schnell ziehen (mit der anderen Hand) die Basis für das Heck oder der hinteren Gliedmaßen, Trennung der Halswirbel vom Schädel22zu verursachen.</li>
	<li>Sprühen Sie den Maus-Stamm mit 70 % Ethanol und mit einem Papiertuch abwischen. Platzieren Sie den Mauszeiger auf seinen Rücken und schräg auf der rechten Seite. Schneiden Sie das Fell, Schere mit sezieren, entlang der Maus links über auf halbem Weg zwischen der Vorder- und Hinterbeine.</li>
	<li>Mit Pinzette, schnappen Sie sich das Bauchfell und einen Einschnitt nicht zu beschädigen die Milz aufmerksam machen. Milz mit einer Pinzette entfernen und in eine sterile 50 mL Röhrchen mit etwa 10 mL der Nährmedien auf Eis legen. Wiederholen Sie für die restlichen Tiere. Hinweis: Die Milz ist die Farbe der Kidney-Bohnen, und er ist länger und flacher als der Niere.</li>
	<li>
Übertragen Sie eine Milz mit 2 mL Kulturmedium auf eine kleine sterile Petrischale.
	<ol>
<li>Die Milz durch Schleifen zwischen den mattierten Teil zwei sterile mattierte Folien zu homogenisieren. Halten Sie wenn möglich die Ausgabe und die Zellen im Medium bei der Homogenisierung.</li>
		<li>Einmal gründlich homogenisiert, pipettieren der 2 mL Kulturmedium mit der splenocyten durch ein 40 µm Nylon Zelle Sieb in ein 50 mL-Tube.</li>
		<li>Wiederholen Sie die obigen Schritte für die verbleibenden Milz mit neuen Paare mattierte Folien, 50 mL Röhrchen mit Nährmedium und Zelle Siebe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hinzugeben Sie 8 mL kalte Kulturmedium zu jedem der 50 mL Röhrchen mit splenocyten für ein Gesamtvolumen von 10 mL/Tube. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter mit einem Hemocytometer.</li>
	<li>Fügen Sie hinzu, ca. 1 x 106 Zellen/Well Kultur 6-Well-Platten. Anzahl der Bohrungen, die entsprechen der Anzahl der verschiedenen PAMPs für das Experiment verwendet wird und ein Steuerelement fügen Sie auch Zellen hinzu. Fügen Sie 3 mL Kulturmedium oder 3 mL Herausforderung Medium in die jeweiligen Vertiefungen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in 5 % CO2 für 3 h.</li>
	<li>Kratzen Sie die Zellen aus der Tiefe der nun mit einer 1.000 µL pipettieren Tipp mit einer Mikropipette P1000 verbunden. Die Zellen mit der gleichen 1.000 µL pipettieren Spitze, eine 15 mL Tube-haltigem Medium zu übertragen.</li>
	<li>Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 167 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand zu entfernen und Waschen der Zelle Pellet mit 5 mL PBS.</li>
	<li>Pellet-Zellen ein zweites Mal bei 167 X g für 5 min, überstand zu entfernen und die Zelle Pellet 600 µL Lyse Puffer hinzufügen, um die Zellen lysiert. Fahren Sie dann mit RNA isoliert.</li>
</ol>(4) RNA Isolation und cDNA Synthese
<ol><li>RNA von splenocyten mit dem RNA-Extraktion-Kit nach Herstellerangaben zu isolieren und die "optionale" auf Spalte DNA Verdauung führen.</li>
	<li>Bestimmen Sie vor cDNA Synthese RNA-Konzentration mit einer Microvolume Spektralphotometer, stellen Sie sicher, dass die Konzentration im optimalen Bereich der RNA (bis zu 2 µg) die cDNA-Synthese-Kit.</li>
	<li>
Synthese cDNA für jede der Proben mit der reversen Transkription-Kit nach Herstellerangaben. Verwenden Sie 10 µL RNA für jede der Proben in eine gesamte Reaktionsvolumen von 20 µL. Fügen Sie am Ende der reversen Transkription (Thermocycler laufen) 20 μL H2O, jede Reaktion.
</li>
	<li>Der standard geschwungenen mit P10 und P20 Mikropipette mRNA von ein paar Kontrollproben (z. B. 5 µL aus 2 Proben für eine Gesamtmenge von 10 µL) in ein 0,5 mL Röhrchen zur Vorbereitung der cDNA Pool zu bauen.<ol>
<li>Fügen Sie 10 µL 2 x Reverse-Transkriptase-master-Mix.</li>
		<li>Fügen Sie bei der Fertigstellung der reversen Transkription 10 µL H2O das Reaktionsgefäß hinzu, dienen als Ausgangspunkt Konzentration ("1") wird in der Verdünnungsreihe für die Standardkurve.</li>
		<li>Führen Sie ein 10-divisibel Verdünnungsreihe (1 bis 10-4) durch Zugabe von Wasser mittels einer Mikropipette P100 oder P200 in vier 0,5 mL Röhrchen benannt 10-410-1, 10-2und 10-345 µL.<ol>
<li>Fügen Sie 5 µL der Ausgangspunkt Konzentration "1" in das erste Rohr (10-1) mit einem P20 Micropipettor, Mix von oben und unten pipettieren mehrmals, dann Transfer 5 µL aus der 10-1 Tube in die Röhre bezeichnet, 10-2 und Mix.</li>
			<li>5 µL mit einer Mikropipette P20 aus der Tube 10-2 in die Röhre bezeichnet 10-3 zu übertragen und zu mischen. 5 µL mit einem P20 Micropipettor aus der Tube 10-3 in das Rohr benannt 10-4 zu übertragen und zu mischen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)
<ol><li>Bestimmen Sie relative Quantifizierung der mRNA-Niveaus durch qPCR. Innerhalb der experimentellen einzurichten, wählen Sie "Quantifizierung – Relative Standardkurve" und "TaqMan" Chemie. Änderung das Reaktionsvolumen zu 10 µL. Geben Sie die relevante Informationen in das Platte-Layout (z.B.Zielgen Standardkurve, Reporter, usw.).</li>
	<li>Die Reaktion so aufzubereiten, dass es 0,5 µL den Primer/Sonden-Assay, 5 µL der Gen-Expression-master-Mix, H2O 2 µL und 2.5 enthält µL cDNA (10 – 100 ng).<ol>
<li>Bereiten Sie einen master-Mix durch Multiplikation aller vorhergehenden Reagenzien (mit Ausnahme der cDNA) durch die Anzahl der Reaktionen, achten Sie darauf, gehören diejenigen von der Standardkurve Negativkontrollen, Durchführung jeder Reaktion in Duplikat und 2 zusätzliche Reaktionen, die berücksichtigt werden pipettieren Variation.</li>
		<li>Pipettieren 7,5 µL bereit master-Mix in vorgegebenen Vertiefungen in einer Reaktion der 96-Well-Platte mit einer Mikropipette oder einer Mehrkanal-Pipette. Pipettieren 2,5 µL cDNA in den entsprechenden Brunnen für die unbekannten und Standards und 2,5 µL von H2O in die negativ-Kontrolle-Brunnen.</li>
		<li>Beinhalten Sie Primer/Sonden-Assays für die verschiedenen molekularen uhrengene und auch einen Test für eine endogene Steuerung (z. B. β-Aktin).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um relative Ausdruckswerte zu ermitteln, berechnen Sie die mittlere relative Menge für jede Wiederholung, dann für jede Probe, teilen Sie die mittlere relative Menge für das jeweilige Zielgen durch die mittlere relative Menge für β-Aktin.</li>
</ol>6. statistische Analyse
<ol><li>Statistische Analyse-Software verwenden, geben Sie Daten in das Programm unter der Spalte Statistik-Option. Wählen Sie eine einfache ANOVA mit der Dunnett post-hoc-Test zur Bewertung der Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Uhr Genexpression nach PAMP Herausforderung gegenüber der Kontrolle.</li>
</ol>

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Der Autor hat nichts preisgeben.

Innerhalb dieses Protokolls kann ein Microvolume Spektralphotometer zur Quantifizierung und Beurteilung der Reinheit der verwendeten bei der Bestimmung der Genexpression RNA verwendet werden. Nukleinsäuren absorbieren UV-Licht bei 260 nm, Proteine in der Regel absorbieren Licht bei 280 nm, während andere potentielle Schadstoffe verwendet, während ein RNA-Extraktionsverfahren (z. B. Phenol) nachweisbar bei 230 sind nm. Daher, durch die Beurteilung der Extinktion (A) Verhältnis bei 260/280 nm (RNA zum Protein) und...

Der master-Clock bei Säugetieren, der 24 h Schwingungen für fast alle Aspekte der Physiologie und Verhalten orchestriert, liegt in den suprachiasmatischen Kern (SCN) des Hypothalamus1,2. Neben der Regulierung der biologischen Prozesse auf organismal Ebene, synchronisiert der master-Clock auch periphere zelluläre Uhren im gesamten Körper3,4,5. Während der molekularen Uhr Maschinen aus mindestens drei ineinandergreifenden transkriptionelle translationale Feedback-Schleifen besteht, besteht der Kern der Periode (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, und Uhr Gene6,7. Neben der Pflege des genaue Timing der molekularen Uhr Kern, einige ergänzende Uhr Genprodukte (z. B. Rev-Erbα und Dbp) regulieren auch Ausdruck des nicht-uhrengene, d. h. Uhr kontrollierten Gene (KVG)6 , 7.
Funktionelle Molekulare Uhren wurden in verschiedenen immun Gewebe (z. B. Milz und Lymphknoten)8 und Zellen (z. B. B Zellen, Dendritische Zellen, Makrophagen)8,9beschrieben. Diese Zellen erkennen und reagieren auf Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs), konservierte mikrobielle Komponenten über angeborene immune Anerkennung Rezeptoren wie Toll-Like-Rezeptoren (TLR)10. Bisher wurden 13 funktionale TLRs beschrieben, erkennen die mikrobielle Bestandteile wie bakterielle Zellwand-Komponenten, flagellar Protein und mikrobielle Nukleinsäuren10. PAMP, Lipopolysaccharid (LPS), eine Zellwand-Komponente von Gram-negativen Bakterien erkannt von TLR4, nachweislich zirkadianen Rhythmen auf organismal und molekularer Ebene zu verändern. Z. B. in Vivo Herausforderung der LPS induzierte photic-ähnliche Phase Verzögerungen Aktivität in Mäusen11 gemessen und führte zu reduzierten Uhr gen-Expression in der SCN und Leber in Situ Hybridisierung und quantitative PCR bestimmt, bzw. in Ratten12. Nach einer in-Vivo -Herausforderung mit LPS ergab die Analyse der menschlichen peripheren Blut Leukozyten13 und subkutanem Fettgewebe14 veränderte Expression von mehreren uhrengene gemessen über qPCR. Zu guter Letzt geändert ex Vivo LPS Herausforderungen des menschlichen Makrophagen und Maus peritonealen Makrophagen, führte auch zu Uhr Ausdruck qPCR14gemessen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um den Einfluss der PAMPs LPS, ODN1826 (synthetische Oligonukleotide mit unmethylated CpG Motive), zu bewerten und Hitze getötet Listeria Monocytogenes (HKLM), anerkannt von TLR4, TLR9 und TLR2, bzw. auf Molekulare Uhr Genexpression in Maus splenocyten. Das Protokoll enthält Maus Splenektomie, Splenocyte Isolierung und Herausforderung, RNA Extraktion, cDNA Synthese und qPCR Ausdruck mehrere uhrengene bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht für den rechtzeitigen Erwerb einer großen Anzahl von Immunzellen mit sehr kleinen Tier oder zellulären Manipulation, die dann ex Vivo mit verschiedenen PAMPs in Frage gestellt. Die molekulare Uhr hat gezeigt, dass verschiedene Aspekte der Immunantwort8,15,16modulieren, Störung der molekularen Uhr beeinträchtigt daher höchstwahrscheinlich die richtige zeitabhängige Variation von der Immunantwort. Darüber hinaus da Störungen des zirkadianen Rhythmen zu schweren Pathologien17,18,19,20führen können, kann es von Interesse für Forscher, splenocyten mit einer breiten Palette von Herausforderung sein Moleküle und deren Einfluss auf die Uhr zu beurteilen.

<table><tbody><tr><td>Frosted Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Zellsiebe</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharid&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ltrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>ODN1826</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-1826-1</td><td></td></tr><tr><td>HKLM</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-hklm</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-043</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104 oder 74106</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>Denville</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>50-ml-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15-ml-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>352097</td> cDNA-Reverse-Transkriptionskit <td></td></tr><tr>mit hoher Kapazität <td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genexpressions-Assays b-Aktin</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00607939_s1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genexpressionsassays Per2</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00478113_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genexpressionsassays Rev-erba</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00520708_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genexpressionsassays Bmal1</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00500226_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genexpressionsassays Dbp</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00497539_m1</td><td></td></tr><tr><td>qPCR-Gerät StepOnePlus</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genexpression Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Schnelle 96-Well-Reaktionsplatte (0,1 mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Statistische Analysesoftware</td><td>Prism 7.0a</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die nutzung von maus splenocyten, pathogen-assoziierte molekulare muster einfluss auf die genexpression uhr abzuschätzen

The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

Vom Verhalten, Genexpression regulieren ZIRKADIANE Rhythmen fast alle Aspekte der Physiologie. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Maus splenocyten mit der Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) Lipopolysaccharid (LPS), ODN1826 und Hitze getötet Listeria Monocytogenes hinterfragen und prüfen ihre Wirkung auf die molekularen zirkadianen Uhr. Bisher haben Studien untersuchen den Einfluss von LPS auf der molekularen Uhr mit einer Vielzahl von in Vivo und ex Vivo Ansätze aus einem Sortiment von Modellen (z. B. Maus, Ratte und Mensch) fokussiert. Dieses Protokoll beschreibt die Isolation und die Herausforderung des splenocyten sowie die Methodik zur Uhr Gen Ausdruck nach Herausforderung über quantitative PCR zu beurteilen. Dieser Ansatz lässt sich nicht nur der Einfluss der mikrobielle Komponenten auf der molekularen Uhr aber auch andere Moleküle zu bewerten, die Ausdruck der Uhr ändern kann. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um die molekularen Mechanismen wie PAMP-Toll-Like-Rezeptor-Interaktion beeinflusst Uhr Ausdruck auseinander zu necken.

Mäuse wurden geopfert, bei ZT13, splenocyten wurden isoliert und ex Vivo mit den PAMPs LPS, ODN1826 oder HKLM in Frage gestellt. Nach 3 h RNA wurde isoliert und qPCR wurde verwendet, um relative Ausdruck Niveaus der molekularen uhrengene zu beurteilen, die Uhr, Per2, Dbp, und Rev-Erbα im Vergleich zu unangefochten Kontrollzellen. Nach PAMP Herausforderung waren Uhr Ausdruck Niveaus nicht wesentlich anders als Ausdruck in der Kontrollze...

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, mit der Maus splenocyten, um Pathogen-assoziierte molekulare Muster zu entdecken, die molekulare Uhr Genexpression verändern.

Die Nutzung von Maus Splenocyten, Pathogen-assoziierte molekulare Muster Einfluss auf die Genexpression Uhr abzuschätzen

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen aus der Immunologie und Chronobiologie zu beantworten, etwa wie mikrobielle Komponenten die molekulare Uhr verändern. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie einfach durchzuführen ist, die Auswirkungen verschiedener mikrobieller Komponenten auf die molekulare Uhr bewertet werden und sie sehr gut reproduzierbar ist. Bereiten Sie zu Beginn des Protokolls das Kulturmedium vor, indem Sie fötales Rinderserum zu RPMI 1640 bis zu einer Endkonzentration von 10 % hinzufügen. Bereiten Sie 10 Milliliter Provokationsmedium für jedes der zu testenden PAMPS in 50-Milliliter-Röhrchen vor, indem Sie das aufgeführte PAMP-Kulturmedium hinzufügen.Besprühen Sie einen zuvor vorbereiteten Mäusestamm mit 70%igem Ethanol und wischen Sie ihn mit einem Papiertuch ab. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken und neigen Sie leicht auf die rechte Seite. Schneiden Sie dann das Fell mit einer Präparierschere entlang der linken Seite der Maus ab, etwa auf halber Höhe zwischen den Vorder- und Hinterbeinen.Fassen Sie mit einer Pinzette das Bauchfell und machen Sie vorsichtig einen Schnitt, ohne die Milz zu beschädigen. Entfernen Sie die Milz mit einer Pinzette und legen Sie sie in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen mit etwa 10 Millilitern Nährmedium auf Eis. Dann geben Sie die Milz mit zwei Millilitern Nährmedium in eine kleine, sterile Petrischale.Homogenisieren Sie die Milz, indem Sie sie zwischen dem mattierten Teil von zwei sterilen mattierten Objektträgern mahlen. Nach der gründlichen Homogenisierung pipettieren Sie die zwei Milliliter Kulturmedium mit den Splenozyten durch ein 40-Mikron-Nylon-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie acht Milliliter kaltes Kulturmedium in jedes der 50-Milliliter-Röhrchen mit den Splenozyten, was ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern pro Röhrchen ergibt.Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter mit einem Hämozytometer. Geben Sie ungefähr eins mal 10 zu den sechsten Zellen pro Vertiefung auf Sechs-Well-Kulturplatten. Nach dem Hinzufügen der Zellen geben Sie drei Milliliter Kulturmedium oder drei Milliliter Challenge-Medium zu den Zellen.Dann inkubieren Sie die Platten drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Kratzen Sie die Zellen mit einer 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze, die an einer P1000-Mikropipette befestigt ist, vom Boden der Vertiefung ab. Übertragen Sie mit derselben Pipettenspitze das Medium mit den Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen.Pelletieren Sie die Zellen bei 167 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet mit fünf Millilitern PBS. Nachdem Sie die Zellen ein zweites Mal bei 167 mal g für fünf Minuten pelletiert haben, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie dem Zellpellet 600 Mikroliter Lysepuffer hinzu.Isolieren Sie RNA aus Splenozyten mit dem RNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers und führen Sie den optionalen DNA-Verdau auf der Säule durch. Synthetisieren Sie cDNA für jede der Proben mit dem reversen Transkriptionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 10 Mikroliter RNA für jede der Proben in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 Mikrolitern.Ziehen Sie mRNA aus einigen Kontrollproben in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen, um die cDNA für die Standardkurve bei der quantitativen PCR vorzubereiten. Fügen Sie 10 Mikroliter 2X reverse Transkriptase-Mastermix hinzu. Nach Abschluss der reversen Transkription werden 10 Mikroliter Wasser in das Reaktionsröhrchen gegeben, das als Ausgangskonzentration in der Verdünnungsreihe für die Standardkurve dient.Führen Sie eine zehnfache Verdünnungsreihe durch, indem Sie 45 Mikroliter Wasser in vier 0,5-Milliliter-Röhrchen geben, die mit 10 zu minus eins, 10 zu minus zwei, 10 zu minus drei und 10 zu minus vier bezeichnet werden. Geben Sie fünf Mikroliter der Ausgangskonzentration eins in das zweite Röhrchen, 10 bis minus eins, mit einer P20-Mikropipette. Mischen Sie, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren und dann fünf Mikroliter von der 10 in die minus eine Tube in die mit 10 bezeichnete Tube in die mit minus zwei bezeichnete Tube geben und mischen.Übertragen Sie fünf Mikroliter mit einer P20-Mikropipette vom 10- zum Minus-Zwei-Röhrchen in das Röhrchen mit der Bezeichnung 10 zu minus drei und mischen Sie. Zum Schluss fünf Mikroliter mit einer P20-Mikropipette vom 10- zum Minus-Drei-Röhrchen in das Röhrchen mit der Aufschrift 10 zu minus vier geben und mischen. Bereiten Sie die Reaktion so vor, dass sie 0,5 Mikroliter des Primer-Sonden-Assays, fünf Mikroliter Genexpressions-Mastermix, zwei Mikroliter Wasser und 2,5 Mikroliter cDNA enthält.Pipettieren Sie die RNA-Proben in eine 96-Well-qPCR-Platte. Inkubieren Sie Primer-Sonden-Assays für verschiedene molekulare Uhrengene und fügen Sie einen Assay für eine endogene Kontrolle hinzu und laden Sie ihn in eine qPCR-Maschine, um die relative Quantifizierung der mRNA-Spiegel zu bestimmen. Wählen Sie innerhalb des Versuchsaufbaus die Quantifizierung, die relative Standardkurve und die TaqMan-Chemie aus.Ändern Sie anschließend das Reaktionsvolumen auf 10 Mikroliter. Geben Sie die relevanten Informationen in das Plattenlayout ein. Die qPCR wurde an isolierter RNA durchgeführt, um die relativen Expressionsniveaus der molekularen Uhrengene clock, clock, Per2, Dbp und Rev-erb alpha zu bestimmen.Nach der PAMP-Provokation unterschieden sich die Taktexpressionsniveaus nicht signifikant im Vergleich zu Kontrollzellen. Die Per2-Expressionsniveaus waren in Zellen, die mit LPS und ODN1826 konfrontiert waren, im Vergleich zu nicht angegriffenen Kontrollen signifikant erhöht. LPS war das einzige PAMP, das die Rev-erb-alpha-Expression veränderte, da die mRNA-Spiegel signifikant niedriger waren als bei den unangefochtenen Kontrollen.Im Vergleich zu den Kontrollen wurden signifikant niedrigere mRNA-Spiegel für Dbp nach Provokation mit jedem der PAMPs beobachtet. Nach diesem Verfahren können andere Moleküle als PAMPs verwendet werden, um ihren Einfluss auf die molekulare Uhr in Splenozyten zu beurteilen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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Die Nutzung von Maus Splenocyten, Pathogen-assoziierte molekulare Muster Einfluss auf die Genexpression Uhr abzuschätzen

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