Name: Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Lernen Sie eine hochdurchsatzfähige Genotypisierungsmethode für Zebrafischlarven durch Fin Clipping. Diese Technik ermöglicht die frühe Identifizierung von Genotypen für biomedizinische Forschung.

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Die Autoren möchte die seltene Krankheitsmodelle und Mechanismus (RDMM) Netzwerk (gefördert durch den kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR) und Genom-Kanada) zu danken. CK wird unterstützt durch ein Stipendium UROP (Universität von Ottawa). DLJ wird durch ein Vanier Canada Graduate Stipendium unterstützt. IAP wird von einem kanadischen Institute der Gesundheit Forschung (CIHR) postdoctoral Fellowship Award unterstützt. Die Autoren danken der Genetics Society of America für die Erteilung der Erlaubnis, dieses Protokoll zu veröffentlichen und zu verwenden, eine Anpassung des zusätzliche Abbildung 5 von Pena, Et Al.

Verfahren mit tierische Themen genehmigt worden und sind nach Tierbetreuung Richtlinien zur Verfügung gestellt von der Canadian Council Tier Pflege und der University of Ottawa Tierbetreuung Ausschüsse.
1. Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die Dissektion Oberfläche durch Abkleben 9 cm Petrischale Deckel mit Autoklav Band über seine innere Oberfläche. Positionieren Sie es unter dem Stereo-Mikroskop.</li>
	<li>Legen Sie 3 bis 5 Tage nach Befruchtung (Dpf) zebrafischlarven in ein Petri-Schale und in ˜1.5 mM Tricaine in 1 x E3 Embryo Medien (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, pH 7,2) zu betäuben.</li>
	<li>Zum Jahresende ein P1000 PIPETTENSPITZE mit einem Paar der Schere oder einer Rasierklinge auf einen Durchmesser von 2 mm bis 3 Dpf Larve mit minimalem Stress Platz abgeschnitten.</li>
</ol>2. Fin Clipping von Zebrafischlarven
<ol><li>Einem narkotisierten Larve mit der modifizierten P1000 Mikropipette abholen und legen der Zebrafisch-Larve auf das positionierte Autoklav-Band auf dem Deckel der Petrischale.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Tricaine Lösung rund um die Larve mit einer Mikropipette. Das Gebiet sollte so trocken wie möglich, erfolgreich Abschnitt und holen die Flosse aber noch feucht ist, Überleben zu sichern.</li>
	<li>Verwenden ein Mikro Skalpell, Abschnitt der Schwanzflosse unter dem Stereo-Mikroskop, wie in Abbildung 1angezeigt, wie im Wilkinson Et al.16beschrieben. Während die Inzision gelten Sie stetigen Druck innerhalb der Pigment-Baulücke der Schwanzflosse, distale bis an die Grenze der Durchblutung (Abbildung 1A). Üben Sie sanften Druck zur Vermeidung von Schäden der Chorda.</li>
	<li>Visualisieren Sie die geschnittenen Flosse unter dem Mikroskop und positionieren Sie das Stück auf der Spitze der Microscalpel Klinge (Abbildung 2A). Legen Sie die Microscalpel mit der Flosse auf der Oberfläche von einem kleinen Stück Filterpapier. Hinweis: Aufgrund des Vorhandenseins von Melanozyten in der durchtrennten Gewebes ermöglicht diesen Schritt Visualisierung der Finne als kleiner schwarzer Fleck (Abb. 2 b).</li>
	<li>Mit Schere und Pinzette (Abbildung 2), übertragen Sie das Filterpapier mit der Flosse, eine 96-Well-PCR-Platte, enthält 25 μL 50 mM NaOH Lösung pro Bohrloch (Abb. 2D).</li>
	<li>Bereiten Sie eine flach-Boden-96-Well-Platte, Nummerierung des Brunnens nach dem Etikett der PCR Platte. Mit der veränderten P1000 Pipette gefüllt mit 200 µL frische 1 x E3 Embryo Medien, sorgfältig sammeln Sie die Zebrafisch-Larven mit leichtem Druck. Die Larve in der Gewebekultur 96-Well-Platte im gleich gut wie die PCR-Platte (Abb. 2E) Nummer zu verzichten.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier gut in der Lösung (Abbildung 2F) untergetaucht ist. Reinigen Sie die Klinge des Microscapel und Pinzette zwischen jedem Schnitt um Kreuzkontaminationen zu vermeiden durch Eintauchen in 70 % EtOH Lösung. Wischen Sie die Klinge mit sauberem Papier Gewebe/wischen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.7, bis alle Embryonen abgeschnitten worden.</li>
	<li>Speichern Sie die Larven in 96-Well-Platte bei 28 ° C, bis die Genotypen identifiziert wurden. Hinweis: Der Embryo Medien muss nicht geändert werden, da das Protokoll bequem in weniger als 2 Tagen abgeschlossen werden kann. Wenn mehr Zeit erforderlich ist, empfiehlt sich ein Medienwechsel.</li>
</ol>(3) genomische DNA-Extraktion
<ol><li>Versiegeln Sie die 96-Well-PCR-Platte und Zentrifuge, die die Proben bei 1.000 x g für 1 min um sicherzustellen, dass alle Filterpapiere innerhalb der NaOH-Lösung getaucht werden.</li>
	<li>Erwärmen Sie für Gewebe Lyse die Proben in einem Thermocycler bei 95 ° C für 5 min, gefolgt von Kühlung auf 4 ° C für 10 min.</li>
	<li>Fügen Sie 6 μL von 500 mM Tris-HCl, pH 8.0 zu jeder Probe. Vortex.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie kurz die Platte bei 1.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Verwenden Sie 1,5 μl des Überstands DNA pro PCR-Reaktion.</li>
	<li>Bereiten Sie einer PCR Genotyp der Larven, wie in Tabelle 1-2. Hinweis: Dieses Protokoll wurde für zwei Anwendungen getestet: multiplex-PCR-Reaktionen enthüllt den Genotyp mit Agarose Gele9und Heteroduplex schmelzen Assay (HMA) enthüllt die Genotypen mit Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE)17.</li>
</ol>4. alternative genomische Extraktion mittels eine Komplexbildner Harz
<ol><li>Komplette Schritt 2.5 indem Filterpapier mit beschnittenen Fin zu einer 96-Well-PCR-Platte mit 30 μl 5 % chelatisierenden Harz (Styrol-Divinylbenzene-Copolymeren mit gekoppelten Iminodiacetate-Ionen). Hinweis: Diese Art des Harzes wird häufig für Gewebe-Lyse und Vorbereitung von PCR-Ready DNA in eine schnelle und effiziente Weise18verwendet.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 2.6-2.8, wie angegeben.</li>
	<li>Verschließen Sie die 96-Well-PCR-Platte und kurz Zentrifugieren Sie die Proben um sicherzustellen, dass alle Filterpapier innerhalb der Komplexbildner Harz eingetaucht ist.</li>
	<li>Erwärmen Sie für Gewebe Lyse die Proben in einem Thermocycler bei 95 ° C für 15 min, gefolgt von Kühlung auf 4 ° C für 10 min. Hinweis: In diesem Schritt können Lyse und anschließende Bindung von polar harzkügelchen, zellulären Komponenten, während DNA und RNA in Lösung bleiben.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie kurz die Proben um die harzkügelchen pellet und die DNA in der Suspension zu erhalten.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 3,5-3,6, Genotypisierung Verfahren abzuschließen.</li>
</ol>5. Anwendung 1: Multiplex-PCR, gefolgt von Agarose-Gel-Analyse
<ol><li>Nach Tabelle 1, Einrichten einer Multiplex-PCR-Reaktion ermöglicht die Unterscheidung zwischen reinerbigen Mutanten, Heterozygote und WT-Larven. Verwenden einer 96-Well-Thermocycler, PCR-Reaktionen mit den Radsport in Tabelle 3beschriebenen Bedingungen durchzuführen. Hinweis: Die PCR-Reaktionen können auch in jeder anderen konventionellen PCR Thermocycler durchgeführt werden. Dieses Beispiel beschreibt die PCR-Strategie von Pena, Et Al. verwendet 9 , aldh7a1 WT und 5-bp Einfügung mutierten Allele in der gleichen Multiplex-Reaktion zu identifizieren.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 1 % Agarosegel in Natrium-Borat-Puffer, befleckt mit 1 X GelRed. Hinweis: 20 x Natrium-Borat ausgleichslagers 40 mL 10 M NaOH, 1800 mL DdH2O, pH 8,5 mit 76 g Borsäure angepasst und anschließend zu 2 L Endvolumen mit DdH2O. besteht aus</li>
	<li>Führen Sie das Gel in 1 X Natrium-Borat-Puffer für 15 min bei 250 V. Um den Prozess zu erleichtern, verwenden Sie nach Möglichkeit ein Gel-System, das kompatibel mit Multichannel-mehrkanalpipette zu höheren Durchsatz ermöglichen durch die Reduzierung der Zeit zum Proben zu laden ist.</li>
	<li>Bild das Gel unter ultraviolettem (UV) Licht um Diskriminierung der verschiedenen Genotypen zu ermöglichen.</li>
</ol>6. Anwendung 2: Heteroduplex schmelzen Assay
<ol><li>Bereiten Sie Seite 12 % Gele mit 1,5 mm Spacer Platte und die 15-Proben Kämme. Bereiten Sie zwei Seite-Gele mit 12,21 mL DdH2O, 2,52 mL 10 x Tris/Borat/EDTA (TBE), 10 mL 30 % Acrylamid, 250 μl 10 % Ammonium Bleichen (APS) und 20 μL der Tetramethylethylenediamine (TEMED). Verwenden Sie 1 X TBE-Puffer (0,089 M Tris-HCl, 0,089 M Borsäure und 0,002 M Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)) als Puffer ausgeführt.</li>
	<li>Erhitzen Sie die PCR-Produkte bei 94 ° C für 5 min.</li>
	<li>Cool die Rohre auf Eis oder in den Thermocycler für 10 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Last 10 μL pro PCR Probe und 8 μl Molekulargewicht Marker.</li>
	<li>Führen Sie die Seite 150 V 1 x TBE mit einem vertikalen Elektrophorese-System für 1 h oder bis das Molekulargewicht Marker fast erreicht die Linie der Glasplatte.</li>
	<li>Bild das Gel unter UV-Licht zur Diskriminierung der verschiedenen Genotypen zu ermöglichen.</li>
</ol>

<ol><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li>
<li>Stewart, A. M., Kalueff, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+better+and+more+valid+animal+models+of+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Developing better and more valid animal models of brain disorders.</a> Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).</li>
<li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+epilepsy+research%3A+legacies+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models in epilepsy research: legacies and new directions.</a> Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+targeted+gene+disruption+in+zebrafish+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/">In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Pena, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-Dependent+Epilepsy+in+Zebrafish+Caused+by+Aldh7a1+Deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency.</a> Genetics. 207, 1501-1518 (2017).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, 2410(2013).</li>
<li>Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+ablation+of+dopaminergic+neurons+leads+to+transient+locomotor+impairments+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae.</a> J Neurochem. 135, 249-260 (2015).</li>
<li>Scheldeman, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28888969">Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis.</a> Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).</li>
<li>Zabinyakov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+knock-out+aldh7a1+zebrafish+model+for+pyridoxine-dependent+epilepsy+using+CRISPR-Cas9+technology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology.</a> PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).</li>
<li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy%2C+behavioral+abnormalities%2C+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+%28STXBP1%29+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS One. 11 (3), (2016).</li>
<li>Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of transgenic zebrafish.</a> Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).</li>
<li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Sci Rep. 4, 6420(2014).</li>
<li>Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelex+100+as+a+medium+for+simple+extraction+of+DNA+for+PCR-based+typing+from+forensic+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.</a> Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).</li>
<li>Ewing, B., Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basecalling+of+automated+sequencer+traces+using+phred.+II.+Error+probabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities.</a> Genome Res. 8, 175-185 (1998).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Gen Bearbeitungstools beschäftigt waren einzuführen genau Mutationen und transgene im Zebrafisch in den letzten Jahren5,6,7,8. Wenn Sie Krankheit Modellierung im Zebrafisch durchführen, sind frühe Larven- oder juvenile Phänotypen oft9,12,13,14beobachtet. Die hier vorg...

Der Zebrabärbling (Danio Rerio) ist ein fest gefügten Organismus verbreitet als Modell für die Untersuchung der Krankheit sowie für präklinische Tests von therapeutische Hypothesen1,2,3. Diese Tiere haben eine kurze Generationszeit, sind leicht zu verarbeiten, zeigen eine hohe Fortpflanzungsrate, low-cost und genetische Manipulationen durch Mikroinjektion von DNA in Embryonen4leicht zugänglich sind. Durch die zunehmende Entwicklung neuartiger transgener und gen Bearbeitung Technologien wie Zinkfinger-Nukleasen (ZFN)5, TAL-wie Effektor Nukleasen (TALENs)6,7, und die gruppierten regelmäßig dazwischen kurz Palindromische wiederholt (CRISPR) / CRISPR-assoziierten 9 (Cas9) System8, dem Zebrafisch wird balanciert, um das Verständnis der verschiedenen pathologischen Bedingungen wesentlich zu verbessern. Diese Technologien wurden verwendet, um gezielte Knockouts in beiden somatische erstellen und Keimbahnzellen im Zebrafisch, effizient erzeugt genetisch modifiziert Tiere8. Jüngste Beispiele in der Literatur sind die erfolgreiche Entwicklung von genetischen Modellen von Epilepsie und Stoffwechselstörungen im Zebrafisch3,9,10,11,12 .
Mit den Fortschritten im Zebrafish Genom-Bearbeitung ist schnelle und zuverlässige Genotypisierung eine unbestreitbare Bandbreitenbegrenzung Schritt geworden. Identifizierung von spezifischen DNA-Mutationen angrenzend an den vorhergesagten Erbgut Bearbeitung Zielstandort ist eine wichtige Etappe des Protokolls. Traditionell, sind Genotypisierung Techniken von Fin Clipping in der Regel nur bei Jugendlichen oder Erwachsenen Zebrafisch. Aber der Zeitaufwand erhöhen Zebrafisch bis zum Erwachsenenalter (> 2 Monate) Fortschritte in der Forschung erheblich verzögert. In vielen Fällen kann durch den Knockout der wesentlichen Gene (z. B. in der Krankheit Modellierung) oder Gain-of-Function-Mutationen führen zu schädlichen phänotypischen Auswirkungen Erwachsenenalter erreicht werden. Darüber hinaus mehrere Assays erfordern, Bündelung von Larven, z. B. in RNA oder Metaboliten Extraktion und beinhalten damit vorherige Identifizierung der Genotypen, die schwierig sein kann, wenn nur post-Hoc Genotyping Techniken verfügbar sind. Diese genannten Beispiele unterstreichen die Bedeutung der Larven Genotypisierung Techniken die zur gleichen Zeit präzise und vollständige Genesung und die normale Entwicklung der Larven zu ermöglichen. Frühen Stadium Zebrafisch Genotypisierung scheinen derzeit nicht am meisten benutzt sein; Dies spiegelt sich durch aktuelle Publikationen der Krankheitsmodelle in denen Larven Genotypen über Post-Mortem-Genotypisierung anstatt Genotypisierung vor der Ausführung des Experiments12,13,14identifiziert werden. In diesem Papier ist eine Larven Fin Clip Strategie vorgestellt, mit dem Ziel, vorher festgelegten Genotypisierung Verfahren zu verbessern.
In der Vergangenheit Leben Strategien beschäftigen Proteinase K-Verdauung, Genotyp Zebrafisch, die Larven zu Variablen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Effizienz15geführt haben. Obwohl mehr vor kurzem mikroskopische Schweif Biopsie Technik zur Verfügung gestellt viel versprechende Ergebnisse16veröffentlicht, waren wir und andere Gruppen nicht in der Lage, die hohe Effizienz und DNA Wiederherstellung berichtet von den Autoren zu reproduzieren. Ein schwerer Rückschlag des Protokolls von Wilkinson Et Al. beschrieben 16 kann die Übertragung des Gewebes Heck mit dem PCR-Rohr. Aufgrund seiner mikroskopischen Größe ist es hart, um sicherzustellen, dass die Flosse wurde ordnungsgemäß gesammelt und durch pipettieren verzichtet. Um diese Barriere zu begegnen, haben wir eine verbesserte Protokoll für die Genotypisierung zahlreicher live zebrafischlarven mit fast 100 % Wirkungsgrad9entwickelt. Mit einer Microscalpel, die Fin Schwanzspitze entfernt und auf ein Stück Filterpapier gelegt. Das Stück Filterpapier mit dem Gewebe kann leicht visualisiert und in ein PCR-Röhrchen korrekt platziert. Genomische DNA-Extraktion erfolgt dann, gefolgt von PCR-Amplifikation der Region von Interesse zum Genotyp der Probe. Die Vorteile dieser Methode sind eine hohe Effizienz der PCR, einer niedrige false-positive-Rate und eine niedrige Sterblichkeitsrate. Darüber hinaus ist die Genotypisierung einer großen Anzahl von Embryonen möglich unter Verwendung dieses Protokolls. Die hier beschriebene Protokoll ermöglicht Fin-Clipping von Hunderten von Larven innerhalb von 2-3 Stunden mit diesem Ansatz und korrekte Identifizierung der genotypisiert Fisch und Schweif Regeneration innerhalb von zwei Tagen.

<table><tbody><tr><td>Petrischale</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskalpell</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Tricain/Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-PCR Teller</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>S25548A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>5% Chelex 100 Natriumform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 1x</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Subzelle Modell 192 System</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1704508</tr><tr><td>30 %ige Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5: 1</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1610158</tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix, 2X</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>Papiertücher (Kimwipes&reg; Einwegwischer)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>1kb-plus Molecylar Gewichtsmarker&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1343</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Modell 192 System (Hochdurchsatz-Agarose-Gel-System)</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1704508</tr><tr><td>vertikales Gelelektrophoresesystem Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1658004</tr></tbody></table>

hochdurchsatz-dna-extraktion und genotypisierung von 3dpf zebrafischlarven durch fin clipping

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafisch (Danio Rerio) besitzen Orthologe 84 % der Gene bekannt, um menschliche Krankheiten zugeordnet werden. Darüber hinaus diese Tiere haben eine kurze Generationszeit, sind leicht zu verarbeiten, zeigen eine hohe Fortpflanzungsrate, low-cost, und sind leicht zugänglich, genetische Manipulationen durch Mikroinjektion von DNA in Embryonen. Die jüngsten Fortschritte im Gen Bearbeitungstools ermöglichen präzise Einführung von Mutationen und transgene im Zebrafisch. Erkrankung oft im Zebrafisch Modellierung führt zu Larven Phänotypen und frühen Tod die schwierig sein kann, um zu interpretieren, wenn Genotypen unbekannt sind. Diese Früherkennung von Genotypen ist auch im Experimente erfordern Probe zu bündeln, wie z. B. Gen Ausdruck oder Mass Spectrometry Studien. Jedoch wird umfangreiche genotypischen Screening von den traditionellen Methoden begrenzt, die in den meisten Labors nur auf Erwachsene Zebrafisch oder im Post-mortem Larven durchgeführt werden. Wir haben dieses Problem durch Anpassung eine Methode zur Isolierung von PCR-Ready genomische DNA aus live zebrafischlarven, die so früh wie 72 h nach Befruchtung (hpf) erreicht werden kann. Diese Zeit- und kostengünstige Technik, verbesserte sich von einer zuvor veröffentlichten Genotypisierung-Protokoll ermöglicht die Identifikation von Genotypen aus mikroskopischen Fin Biopsien. Die Flossen regenerieren schnell wie die Larven entwickeln. Forscher können dann auswählen und die gewünschte Genotypen bis zum Erwachsenenalter durch die Nutzung dieser Hochdurchsatz-PCR-basierten Genotypisierung Verfahren zu erhöhen.

Die Effizienz des Protokolls zeigte sich durch Genotypisierung der Nachzucht von einem heterozygoten Kreuz (aldh7a1+ / ot100, hier dargestellt als aldh7a1+ /-) ()Abbildung 3A- C)9. Die aldh7a1ot100mutierten Allels hat eine 5-Basenpaaren (bp) Einfügung in die ersten kodierenden Exon der Zebrafisch- aldh7a1 -Gens, das führt zu Frameshif...

Zebrafisch wurden als zuverlässige genetische Modellorganismen in der biomedizinischen Forschung, vor allem mit dem Aufkommen von Gen-Bearbeitung Technologien verwendet. Wenn Larven Phänotypen zu erwarten sind, kann DNA-Extraktion und Genotyp Identifizierung schwierig sein. Hier beschreiben wir eine effiziente Genotypisierung Verfahren für zebrafischlarven durch Rute zuschneiden, so früh wie 72 h nach Befruchtung.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im biomedizinischen Bereich zu beantworten. Wie zum Beispiel die Verwendung von Zebrafischen zur Erstellung genetischer Modelle von Krankheiten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine frühzeitige Identifizierung von Genotypen mit einer einfachen Hochdurchsatzmethode ermöglicht.Obwohl diese Methode umfangreiche Forschungen mit Zebrafischmodellen genetischer Epilepsien ermöglichen kann, kann sie auch auf andere genetische Krankheitsmodelle und jede Art von Mutationsstudie angewendet werden. Im Allgemeinen können Individuen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Durchtrennung der Larvenflosse genau innerhalb des Pigmentspalts des Schwanzes durchgeführt werden muss. Bevor Sie mit dem Flossenschnitt der Zebrafischlarven beginnen, bereiten Sie die Präparierfläche vor.Kleben Sie ein Stück Autoklavenband über die Innenfläche eines neun Zentimeter großen Petrischalendeckels und positionieren Sie den Deckel unter einem Stereomikroskop. Bereiten Sie eine P1000-Pipettenspitze vor, um eine Larve mit drei dpf bei minimalem Stress aufzunehmen, indem Sie das Ende der Pipettenspitze auf einen Durchmesser von zwei Millimetern abschneiden. Legen Sie die Zebrafischlarven drei bis fünf Tage nach der Befruchtung (dpf) in eine Petrischale und betäuben Sie sie in 1,5 millimolaren Tricain in 1x E3-Embryomedium.Mit der modifizierten Mikropipette P1000 die Zebrafischlarve aufnehmen, betäuben und auf das positionierte Autoklavenband auf dem Deckel der Petrischale legen. Entfernen Sie überschüssige Tricainlösung, die die Larve umgibt. Der Bereich sollte so trocken wie möglich sein, um die Flosse erfolgreich zu durchtrennen und aufzunehmen, aber immer noch nass, um das Überleben zu sichern.Um Blutungen zu vermeiden und das Überleben der Larve während des Flossenschnitts zu sichern, muss die Durchtrennung innerhalb des Pigmentspalts erfolgen. Distal bis zur Grenze der Durchblutung, wie in diesem Bild gezeigt. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop ein Mikroskalpell, um die Schwanzflosse zu schneiden.Üben Sie während des Schnitts einen gleichmäßigen, aber sanften Druck nach unten aus, um eine Beschädigung der Chorda zu vermeiden. Visualisieren Sie die geschnittene Flosse unter dem Mikroskop und positionieren Sie das Stück auf der Spitze der Mikroskalpellklinge. Legen Sie das Mikroskalpell mit der Flosse auf die Oberfläche eines kleinen Stücks Filterpapier.Aufgrund des Vorhandenseins von Melanozyten im durchtrennten Gewebe erscheint die Flosse als kleiner schwarzer Fleck. Um eine erfolgreiche DNA-Extraktion zu gewährleisten, ist es wichtig, dass ein schwarzer Punkt, der die Platzierung der Flosse markiert, auf dem Filterpapier beobachtet wird, bevor mit dem Protokoll fortgefahren wird. Übertragen Sie das Filterpapier mit der Flosse mit einer Schere und einer Pinzette in eine Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte, die 25 Mikroliter einer 50 Millimolaren Natriumhydroxidlösung enthält.Bereiten Sie als Nächstes eine 96-Well-Gewebekulturplatte mit flachem Boden vor und nummerieren Sie die Wells gemäß dem Etikett der PCR-Platte. Mit der modifizierten P1000-Pipette, gefüllt mit 200 Mikrolitern frischem e3-Embryomedium, sammeln Sie die Zebrafischlarve vorsichtig und mit leichtem Druck. Geben Sie die Larve in die 96-Well-Platte in der gleichen Well-Nummer wie die PCR-Platte.Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier mit der Lamelle gut in die Lösung eingetaucht ist. Um eine Kreuzkontamination zwischen den einzelnen Schnitten zu vermeiden, reinigen Sie die Klinge des Mikroskalpells und die Pinzette, indem Sie sie in eine 70%ige Ethanollösung tauchen. Wischen Sie die Klinge mit einem sauberen Papiertaschentuch oder Tuch ab.Wenn alle Larven geschoren wurden, lagern Sie die Larven in der 96-Well-Platte bei 28 Grad Celsius, bis ihre Genotypen identifiziert wurden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die 96-Well-PCR-Platte, die die Flossenstücke enthält, verschließen und die Proben eine Minute lang bei 1000-fachem G zentrifugieren. Stellen Sie sicher, dass alle Filterpapiere in die Natronlauge getaucht sind.Für die Gewebelyse erhitzen Sie die Proben in einem Thermocycler fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius. Gefolgt von einer Abkühlung auf vier Grad Celsius für 10 Minuten. Als nächstes fügen Sie jeder Probe sechs Mikroliter 500 millimolare Tris-HCL pH8,0 hinzu.Wirbeln Sie die Proben. Die Platte bei 1500 mal G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur kurz zentrifugieren. Um genomische DNA mit dieser Methode zu extrahieren, schneiden Sie die Flosse wie zuvor gezeigt ab, aber geben Sie das Filterpapier mit der abgeschnittenen Flosse in eine Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte, die 30 Mikroliter 5%iges Chelatharz enthält.Nachdem alle Flossenstücke abgeschnitten wurden, verschließen Sie die 96-Well-PCR-Platte und zentrifugieren Sie die Proben kurz, um sicherzustellen, dass alle Filterpapiere mit dem Chelatbildnerharz eingetaucht sind. Erhitzen Sie die Proben in einem Thermocycler 15 Minuten lang auf 95 Grad Celsius und kühlen Sie sie anschließend 10 Minuten lang auf vier Grad Celsius ab. Zentrifugieren Sie die Proben kurz, um die Harzkügelchen zu pelletieren und die DNA in der Suspension zu erhalten.Ein Multiplex-PCR-Assay wird die Unterscheidung zwischen homozygoten Mutanten, Heterozygoten und Wildtyp-Larven ermöglichen. Richten Sie die PCR-Reaktion wie im Textprotokoll beschrieben ein. Führen Sie die PCR-Reaktionen in einem 96-Well-Thermocycler durch.Bereiten Sie ein 1%iges Agarose-Gel in Natriumboratpuffer vor, das mit 1x Gel rot gefärbt ist. Um den Prozess zu erleichtern, verwenden Sie, wenn möglich, ein Gelsystem, das mit Mehrkanalpipetten kompatibel ist, um einen höheren Durchsatz zu ermöglichen, indem die Zeit zum Laden der Proben verkürzt wird. Lassen Sie das Gel in 1x Natriumboratpuffer bei 250 Volt für 15 Minuten laufen.Bilden Sie das Gel unter ultraviolettem Licht ab, um die Unterscheidung der verschiedenen Genotypen zu ermöglichen. Beginnen Sie diesen Assay mit der Vorbereitung von zwei 12%igen Polyacrylamid-Gelen unter Verwendung der 1,5-Millimeter-Abstandsplatte und der 15 Probenkämme, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie ein vertikales Elektrophoresesystem und 1x TBE-Puffer als Laufpuffer.Nachdem Sie die PCR wie im Textprotokoll beschrieben durchgeführt haben, erhitzen Sie die PCR-Produkte fünf Minuten lang auf 94 Grad Celsius, gefolgt von einer Abkühlung auf vier Grad Celsius für 10 Minuten. Laden Sie 10 Mikroliter pro PCR-Probe und acht Mikroliter Molekulargewichtsmarker. Lassen Sie das Gel eine Stunde lang bei 150 Volt laufen oder bis der Molekulargewichtsmarker fast die Fußlinie der Glasplatte erreicht.Bilden Sie das Gel unter ultraviolettem Licht ab, um die Unterscheidung der verschiedenen Genotypen zu ermöglichen. Dieses Protokoll wurde zur Genotypisierung der Nachkommen einer heterozygoten Kreuzung verwendet, bei der die mutierte Ileale eine Insertion von 5 Basenpaaren im ersten Beschichtungsexon des aldh7a1-Gens aufweist. Das erwartete Ergebnis der PCR-Amplifikation sowohl von Wildtyp- als auch von mutierten Ilealen ist ein 434 BP Amplicon.Eine 293 BP-Bande entsteht durch Amplifikation des mutierten Ileals, und eine 195 BP-Bande wird für das Wildtyp-Ileal erhalten. Die Analyse von PCR-Reaktionen auf einem 1%-Agarose-Natriumborat-Gel identifizierte Wildtyp-Genotypen in den Spuren zwei und sechs, heterozygote Genotypen in den Spuren drei, vier und fünf und einen homozygoten mutierten Genotyp in Spur eins. Verschiedene Mutationen wurden mit Hilfe eines Heteroduplex-Schmelzassays genotypisiert.Die mutierten Ileale plpbpot101 und plpbpot102 des plpbp-Gens lassen jeweils eine Frame-Shift- und ein frühes Stopp-Codon zu. Nach der Denaturierung und dem Glühen würden die PCR-Fragmente für heterozygote Tiere Heteroduplex- und Homoduplex-DNA enthalten, die mit Hilfe von Polyacrylamid-Gelelektrophoresen leicht getrennt und sichtbar gemacht werden können. In den Lanes zwei, vier und acht wurden compound-heterozygote mutierte Genotypen identifiziert, in den Lanes drei, sechs, sieben, neun und zehn heterozygote Genotypen und in Lane fünf ein Wildtyp-Genotyp.Einmal gemeistert, kann das Flossenschneiden von 96 Larven mit dieser Technik in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. das Pooling von Zebrafischlarven desselben Genotyps für die Gewebeextraktion, durchgeführt und bestellt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. Biomarker-Untersuchungen und Krankheitsmodelle. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forschung auf dem Gebiet der Modelle der metabolischen Epilepsie, um die Physiologie des Krankheitsverlaufs beim Zebrafisch zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man drei Tage alte Zebrafischlarven durch Mikrodissektion einer Schwanzflosse richtig genotypisiert.

high-throughput-dna-extraction-genotyping-3dpf-zebrafish-larvae-fin

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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