Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im biomedizinischen Bereich zu beantworten. Wie zum Beispiel die Verwendung von Zebrafischen zur Erstellung genetischer Modelle von Krankheiten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine frühzeitige Identifizierung von Genotypen mit einer einfachen Hochdurchsatzmethode ermöglicht.

Obwohl diese Methode umfangreiche Forschungen mit Zebrafischmodellen genetischer Epilepsien ermöglichen kann, kann sie auch auf andere genetische Krankheitsmodelle und jede Art von Mutationsstudie angewendet werden. Im Allgemeinen können Individuen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Durchtrennung der Larvenflosse genau innerhalb des Pigmentspalts des Schwanzes durchgeführt werden muss. Bevor Sie mit dem Flossenschnitt der Zebrafischlarven beginnen, bereiten Sie die Präparierfläche vor.

Kleben Sie ein Stück Autoklavenband über die Innenfläche eines neun Zentimeter großen Petrischalendeckels und positionieren Sie den Deckel unter einem Stereomikroskop. Bereiten Sie eine P1000-Pipettenspitze vor, um eine Larve mit drei dpf bei minimalem Stress aufzunehmen, indem Sie das Ende der Pipettenspitze auf einen Durchmesser von zwei Millimetern abschneiden. Legen Sie die Zebrafischlarven drei bis fünf Tage nach der Befruchtung (dpf) in eine Petrischale und betäuben Sie sie in 1,5 millimolaren Tricain in 1x E3-Embryomedium.

Mit der modifizierten Mikropipette P1000 die Zebrafischlarve aufnehmen, betäuben und auf das positionierte Autoklavenband auf dem Deckel der Petrischale legen. Entfernen Sie überschüssige Tricainlösung, die die Larve umgibt. Der Bereich sollte so trocken wie möglich sein, um die Flosse erfolgreich zu durchtrennen und aufzunehmen, aber immer noch nass, um das Überleben zu sichern.

Um Blutungen zu vermeiden und das Überleben der Larve während des Flossenschnitts zu sichern, muss die Durchtrennung innerhalb des Pigmentspalts erfolgen. Distal bis zur Grenze der Durchblutung, wie in diesem Bild gezeigt. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop ein Mikroskalpell, um die Schwanzflosse zu schneiden.

Üben Sie während des Schnitts einen gleichmäßigen, aber sanften Druck nach unten aus, um eine Beschädigung der Chorda zu vermeiden. Visualisieren Sie die geschnittene Flosse unter dem Mikroskop und positionieren Sie das Stück auf der Spitze der Mikroskalpellklinge. Legen Sie das Mikroskalpell mit der Flosse auf die Oberfläche eines kleinen Stücks Filterpapier.

Aufgrund des Vorhandenseins von Melanozyten im durchtrennten Gewebe erscheint die Flosse als kleiner schwarzer Fleck. Um eine erfolgreiche DNA-Extraktion zu gewährleisten, ist es wichtig, dass ein schwarzer Punkt, der die Platzierung der Flosse markiert, auf dem Filterpapier beobachtet wird, bevor mit dem Protokoll fortgefahren wird. Übertragen Sie das Filterpapier mit der Flosse mit einer Schere und einer Pinzette in eine Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte, die 25 Mikroliter einer 50 Millimolaren Natriumhydroxidlösung enthält.

Bereiten Sie als Nächstes eine 96-Well-Gewebekulturplatte mit flachem Boden vor und nummerieren Sie die Wells gemäß dem Etikett der PCR-Platte. Mit der modifizierten P1000-Pipette, gefüllt mit 200 Mikrolitern frischem e3-Embryomedium, sammeln Sie die Zebrafischlarve vorsichtig und mit leichtem Druck. Geben Sie die Larve in die 96-Well-Platte in der gleichen Well-Nummer wie die PCR-Platte.

Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier mit der Lamelle gut in die Lösung eingetaucht ist. Um eine Kreuzkontamination zwischen den einzelnen Schnitten zu vermeiden, reinigen Sie die Klinge des Mikroskalpells und die Pinzette, indem Sie sie in eine 70%ige Ethanollösung tauchen. Wischen Sie die Klinge mit einem sauberen Papiertaschentuch oder Tuch ab.

Wenn alle Larven geschoren wurden, lagern Sie die Larven in der 96-Well-Platte bei 28 Grad Celsius, bis ihre Genotypen identifiziert wurden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die 96-Well-PCR-Platte, die die Flossenstücke enthält, verschließen und die Proben eine Minute lang bei 1000-fachem G zentrifugieren. Stellen Sie sicher, dass alle Filterpapiere in die Natronlauge getaucht sind.

Für die Gewebelyse erhitzen Sie die Proben in einem Thermocycler fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius. Gefolgt von einer Abkühlung auf vier Grad Celsius für 10 Minuten. Als nächstes fügen Sie jeder Probe sechs Mikroliter 500 millimolare Tris-HCL pH8,0 hinzu.

Wirbeln Sie die Proben. Die Platte bei 1500 mal G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur kurz zentrifugieren. Um genomische DNA mit dieser Methode zu extrahieren, schneiden Sie die Flosse wie zuvor gezeigt ab, aber geben Sie das Filterpapier mit der abgeschnittenen Flosse in eine Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte, die 30 Mikroliter 5%iges Chelatharz enthält.

Nachdem alle Flossenstücke abgeschnitten wurden, verschließen Sie die 96-Well-PCR-Platte und zentrifugieren Sie die Proben kurz, um sicherzustellen, dass alle Filterpapiere mit dem Chelatbildnerharz eingetaucht sind. Erhitzen Sie die Proben in einem Thermocycler 15 Minuten lang auf 95 Grad Celsius und kühlen Sie sie anschließend 10 Minuten lang auf vier Grad Celsius ab. Zentrifugieren Sie die Proben kurz, um die Harzkügelchen zu pelletieren und die DNA in der Suspension zu erhalten.

Ein Multiplex-PCR-Assay wird die Unterscheidung zwischen homozygoten Mutanten, Heterozygoten und Wildtyp-Larven ermöglichen. Richten Sie die PCR-Reaktion wie im Textprotokoll beschrieben ein. Führen Sie die PCR-Reaktionen in einem 96-Well-Thermocycler durch.

Bereiten Sie ein 1%iges Agarose-Gel in Natriumboratpuffer vor, das mit 1x Gel rot gefärbt ist. Um den Prozess zu erleichtern, verwenden Sie, wenn möglich, ein Gelsystem, das mit Mehrkanalpipetten kompatibel ist, um einen höheren Durchsatz zu ermöglichen, indem die Zeit zum Laden der Proben verkürzt wird. Lassen Sie das Gel in 1x Natriumboratpuffer bei 250 Volt für 15 Minuten laufen.

Bilden Sie das Gel unter ultraviolettem Licht ab, um die Unterscheidung der verschiedenen Genotypen zu ermöglichen. Beginnen Sie diesen Assay mit der Vorbereitung von zwei 12%igen Polyacrylamid-Gelen unter Verwendung der 1,5-Millimeter-Abstandsplatte und der 15 Probenkämme, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie ein vertikales Elektrophoresesystem und 1x TBE-Puffer als Laufpuffer.

Nachdem Sie die PCR wie im Textprotokoll beschrieben durchgeführt haben, erhitzen Sie die PCR-Produkte fünf Minuten lang auf 94 Grad Celsius, gefolgt von einer Abkühlung auf vier Grad Celsius für 10 Minuten. Laden Sie 10 Mikroliter pro PCR-Probe und acht Mikroliter Molekulargewichtsmarker. Lassen Sie das Gel eine Stunde lang bei 150 Volt laufen oder bis der Molekulargewichtsmarker fast die Fußlinie der Glasplatte erreicht.

Bilden Sie das Gel unter ultraviolettem Licht ab, um die Unterscheidung der verschiedenen Genotypen zu ermöglichen. Dieses Protokoll wurde zur Genotypisierung der Nachkommen einer heterozygoten Kreuzung verwendet, bei der die mutierte Ileale eine Insertion von 5 Basenpaaren im ersten Beschichtungsexon des aldh7a1-Gens aufweist. Das erwartete Ergebnis der PCR-Amplifikation sowohl von Wildtyp- als auch von mutierten Ilealen ist ein 434 BP Amplicon.

Eine 293 BP-Bande entsteht durch Amplifikation des mutierten Ileals, und eine 195 BP-Bande wird für das Wildtyp-Ileal erhalten. Die Analyse von PCR-Reaktionen auf einem 1%-Agarose-Natriumborat-Gel identifizierte Wildtyp-Genotypen in den Spuren zwei und sechs, heterozygote Genotypen in den Spuren drei, vier und fünf und einen homozygoten mutierten Genotyp in Spur eins. Verschiedene Mutationen wurden mit Hilfe eines Heteroduplex-Schmelzassays genotypisiert.

Die mutierten Ileale plpbpot101 und plpbpot102 des plpbp-Gens lassen jeweils eine Frame-Shift- und ein frühes Stopp-Codon zu. Nach der Denaturierung und dem Glühen würden die PCR-Fragmente für heterozygote Tiere Heteroduplex- und Homoduplex-DNA enthalten, die mit Hilfe von Polyacrylamid-Gelelektrophoresen leicht getrennt und sichtbar gemacht werden können. In den Lanes zwei, vier und acht wurden compound-heterozygote mutierte Genotypen identifiziert, in den Lanes drei, sechs, sieben, neun und zehn heterozygote Genotypen und in Lane fünf ein Wildtyp-Genotyp.

Einmal gemeistert, kann das Flossenschneiden von 96 Larven mit dieser Technik in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. das Pooling von Zebrafischlarven desselben Genotyps für die Gewebeextraktion, durchgeführt und bestellt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. Biomarker-Untersuchungen und Krankheitsmodelle. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forschung auf dem Gebiet der Modelle der metabolischen Epilepsie, um die Physiologie des Krankheitsverlaufs beim Zebrafisch zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man drei Tage alte Zebrafischlarven durch Mikrodissektion einer Schwanzflosse richtig genotypisiert.