Name: Funktionsauswertung olfaktorische Wege im Leben Xenopus Kaulquappen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Funktionsauswertung olfaktorischer Wege in lebenden Xenopus-Kaulquappen. Diese Techniken ermöglichen In-vivo-Imaging und Verhaltensanalysen für neurobiologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) mitfinanziert von European Regional Development Fonds (EFRE), durch wettbewerbsfähige Forschungspreise aus der M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Stipendium Fonds, Laura und Arthur Colwin ausgestattet Sommer Research Fellowship Fund , das Fischbach Fellowship und der große Generation Fund der Marine Biological Laboratory und der nationalen Xenopus Ressource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, Massachusetts) wo ein Teil dieser Arbeit wurde durchgeführt. Wir danken auch CERCA Programm / Generalitat de Catalunya für institutionelle Unterstützung. A.L. ist Serra Húnter Fellow.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Papier beschreibt Techniken, die sinnvoll, die Funktionalität der olfaktorische Wege im Leben zu untersuchen sind Xenopus Kaulquappen. Das aktuelle Protokoll eignet sich besonders für die Laboratorien, die funktionieren, oder haben Zugang zu Xenopus; Allerdings ist es auch interessant für jene Forscher studieren die zellulären und molekularen Grundlagen der neuronale Regeneration und Reparatur. Ergebnisse im Xenopus kombinierbar mit Daten aus anderen vertebrate Modelle, konservierte Mech...

Xenopus Kaulquappen bilden ein ausgezeichnetes Tiermodell um die normale Funktion des Nervensystems zu studieren. Transparenz, ein vollständig sequenzierte Genom1,2und Zugänglichkeit zu chirurgischen, elektrophysiologische und bildgebende Techniken sind einzigartige Eigenschaften des Xenopus -Larven, die es ermöglichen, Untersuchung neuronale Funktionen in-vivo3 . Einige der mehrere experimentelle Möglichkeiten dieses Tiermodell werden durch gründliche Studien am Kaulquappe sensorischen und motorischen Systeme4,5,6dargestellt. Eine besonders gut geeignet neuronale Schaltung, viele Aspekte der Informationsverarbeitung auf der Ebene der Synapsen ist Xenopus Kaulquappe olfaktorischen System7. Erstens die synaptische Konnektivität ist klar definiert: olfaktorische Rezeptor Neuronen (ORNs) Projekt auf den Riechkolben und synaptischen Kontakte mit Dendriten Mitral-/getuftet Zellen innerhalb von Glomeruli Geruch Karten zu generieren. Zweitens entstehen seine ORNs kontinuierlich durch Neurogenese während des gesamten Lebens die Funktionalität von olfaktorische Bahnen8zu erhalten. Und drittens, weil des olfaktorischen Systems eine große regenerative Fähigkeit zeigt, Xenopus Kaulquappen können ihre Riechkolben ganz nach Ablation9zu reformieren.
In diesem Artikel beschreiben wir Ansätze, die Darstellung der olfaktorischen Glomeruli in lebenden Kaulquappen mit Verhaltensexperimente, die Funktionalität der olfaktorische Bahnen zu studieren. Die hier beschriebenen Methoden wurden verwendet, um die funktionelle Wiederherstellung der glomerulären Konnektivität in den Riechkolben nach Riechnerv Durchtrennung10zu studieren. In Xenopus Kaulquappen gewonnenen Daten sind Vertreter der Wirbeltiere, da olfaktorische Verarbeitung evolutionär ist konserviert.
Die beschriebenen Methoden sind beispielhaft dargestellt, mit X. tropicalis , aber sie können leicht in Xumgesetzt werden. Laevis. Trotz der größeren Größe des Erwachsenen laevissind beide Arten in Kaulquappe Phasen bemerkenswert ähnlich. Die Hauptunterschiede liegen auf Genomebene. Laevis zeigt schlechte genetische Lenkbarkeit, vor allem durch seine Allotetraploid Genom und lange Generationszeit (ca. 1 Jahr) bestimmt. X. Tropicalis ist dagegen besser geeignet, um genetische Veränderungen aufgrund der kürzeren Generationszeit (5 – 8 Monate) und diploiden Genom. Die repräsentative Experimente sind für Wildtyp Tiere und drei verschiedenen transgenen Linien dargestellt: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) und Tubb2:GFP (laevis).
Die in die aktuelle Arbeit beschriebenen Methoden sollte neben der genetischen fortschreitet im Feld Xenopus betrachtet werden. Die Einfachheit und die einfache Umsetzung der vorgestellten Techniken macht sie besonders nützlich für die Bewertung der bereits beschriebenen Mutanten11sowie Xenopus Linien von CRISPR-Cas9 Technologie12generiert. Wir beschreiben auch einen chirurgischen Eingriff zur Geruchsnerven Transekt, die in jedem Labor Zugang zu Xenopus Kaulquappen umgesetzt werden können. Die Ansätze für die Bewertung der präsynaptischen Kalzium Antworten verwendet und olfaktorischen geführte Verhalten erfordern spezielle Ausrüstung, wenn auch auf einem moderaten Kosten zur Verfügung. Methoden sind in einer einfachen Form zur Förderung ihrer Verwendung in Forschungsgruppen vorgestellt und konnte die Grundlagen von komplexeren Assays festgelegt, durch die Implementierung von Verbesserungen oder durch den Verein zu anderen Techniken, d.h., histologische oder genetische Ansätze.

<table><tbody><tr><td>Salze für Aquarien (Instant Ocean Salt)</td><td>Tecniplast</td><td>XPSIO25R</td><td></td></tr><tr><td>Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette #5 (Spitze 0,025 x 0,005 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Schere (Spitze 0,015 x 0,015)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Whatman qualitatives Filterpapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>WH3030917</td><td></td></tr><tr><td>X. laevis tubb2-GFP</td><td>National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731</td><td>NXR_0.0035</td><td></td></tr><tr><td>X.tropicalis NBT-GFP</td><td>European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CM-DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-7001</td><td></td></tr><tr><td>Calciumgrünes Dextran, Kaliumsalz, 10.000 MW, anionisch</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-3713</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatkapillaren für Mikroinjektion</td><td>Sutter Instrument</td><td>B100-75-10</td><td>AD = 1,0 mm, ID = 0,75 mm.</td></tr><tr><td>Abzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Parker</td><td>Instruments Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761028-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Microfil Mikropipetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>Aufrechtes Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager-A1</td><td></td></tr><tr><td>Master-8 Stimulator</td><td>A.M.P.I.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>Image EM</td><td></td></tr><tr><td>Magnetventile</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 Sechs-Kanal-System</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Hochvakuumfett</td><td>VWR Scientific</td><td>636082B</td><td></td></tr><tr><td>Tubocurarinhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2379</td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Zeiss</td><td>MRC-5 Kamera</td><td>gesteuert von Zen Software</td></tr><tr><td>Kameraobjektiv</td><td>Thorlabs</td><td>MVL8ML3</td><td>Es gibt mehrere Möglichkeiten, die an das verwendete Kameramodell angepasst werden sollten</td></tr><tr><td>Epoxidharz</td><td>RS Components</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verteiler</td><td>Warner</td><td>Instruments MP-6 Perfusionsverteiler Mikromanipulator</td><td></td></tr><tr><td>für die lokale Bereitstellung von Lösungen</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Magnetklemmen</td><td>Warner Instruments</td><td>MAG-7, MAG-6</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylen-Schlauch</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0755</td><td>Außendurchmesser = 1,57 mm, Innendurchmesser = 1,14 mm.</td></tr></tbody></table>

funktionsauswertung olfaktorische wege im leben xenopus kaulquappen

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems zu untersuchen. Sie bieten mehrere experimentelle Vorteile, wie z. B. Zugriff auf zahlreiche bildgebende Ansätze, elektrophysiologische Techniken und Verhaltens-Assays. Das Xenopus Kaulquappe olfaktorische System eignet sich besonders gut zu untersuchen, die Funktion der Synapsen gegründet während der normalen Entwicklung oder nach einer Verletzung reformiert. Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven. Wir skizzieren eine Kombination aus in-vivo Messungen der präsynaptischen Kalzium Antworten in Glomeruli den Riechkolben mit olfaktorischen geführte Verhalten Assays. Methoden können mit der Durchtrennung der Geruchsnerven, studieren die Neuverkabelung der synaptischen Konnektivität kombiniert werden. Experimente werden vorgestellt mit Wildtyp und gentechnisch veränderte Tiere mit dem Ausdruck GFP-Reporter in den Zellen des zentralen Nervensystems. Anwendung der Ansätze beschrieben, gentechnisch veränderten Kaulquappen ist nützlich für die Entschlüsselung der molekularen Grundlagen, die vertebrate Verhalten definieren.

In diesem Beitrag präsentieren wir eine Kombination aus zwei komplementäre Ansätze in Vivo Studie über die Funktionalität des Xenopus Kaulquappe olfaktorischen Systems ausführen: ich) ein Verfahren zur Bildgebung präsynaptischen Ca2 + ändert in den Glomeruli des Lebens Kaulquappen mit einem fluoreszierenden Kalzium Indikator und Ii) geführte ein Geruch Verhaltens Assay, die verwendet werden, um die Reaktion auf bestimmte wasserbasierte Geruchsstoffe zu untersu...

Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems in vivo zu untersuchen. Wir beschreiben Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven unter Normalbedingungen Aufzucht oder nach Verletzungen.

Funktionsauswertung olfaktorische Wege im Leben Xenopus Kaulquappen

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Diese Methode kann nützlich sein, um wichtige Fragen in neurobiologischen Bereichen zu beantworten, wie z. B. wie präsynaptische Terminals in vivo funktionieren. Der Hauptvorteil dieser Techniken ist, dass wir kostenlose Ansätze zeigen, um die Funktion von Geruchswegen mit Xenopus Kaulquappen als Tiermodell zu beanstanden. Diese Prozedur werde ich, Beatrice Terni und Paolo Pacciolla, demonstrieren.Beginnen Sie das Transektionsverfahren, indem Sie zwei Stücke von cellulosequalitativem Filterpapier in 0,02%MS2 22 Anästhesielösung benetzen und unter den Sezierbereich stellen. Dann eine Kaulquappe aus dem Tank holen und in eine Schale mit Anästhesieein eintauchen. Die Kaulquappe sollte innerhalb von zwei bis vier Minuten aufhören zu schwimmen.Überprüfen Sie die richtige Betäubung durch das Fehlen einer Reaktion auf mechanische Reize, die auf der Schwanzebene mit einer Pinzette angewendet werden. Legen Sie die anästhesierte Kaulquappe auf das Filterpapier unter den Rahmen. Positionieren Sie das Tier mit seiner Rückenseite nach oben, damit Hirnstrukturen visualisiert werden können.Für Verhaltensexperimente verwenden Sie Veni-Schere, um beide Nerven zu transsektieren, um alle Geruchsinfor

functional-evaluation-of-olfactory-pathways-in-living-xenopus-tadpoles

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir zeigen Varianten der extrazellulären Multi-Unit-Aufnahmetechnik, um Geruch hervorgerufenen Reaktionen in den ersten drei Stufen der wirbellosen olfaktorischen charakterisieren. Diese Techniken können leicht an ensemble Aktivität in anderen neuronalen Systemen sowie zu untersuchen.

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Xenopus laevis Kaulquappen schwimmen lieber auf der weißen Seite einer schwarz / weißen Tank. Dieses Verhalten wird von ihrer Vision geleitet. Basierend auf diesem Verhalten stellen wir eine einfache Test, um die visuelle Funktion der Kaulquappen zu testen.

Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in<em&gt; Xenopus laevis</em

Die Maus akzessorischen olfaktorischen Bulbus (AOB) ist schwierig gewesen, im Rahmen der sensorischen Kodierung zu studieren. Hier zeigen wir eine Dissektion, die eine Ex-vivo-Vorbereitung, in der AOB Neuronen funktionell bleiben, um ihre angeschlossenen Peripherieeingänge, die Erleichterung der Forschung in der Informationsverarbeitung von Maus Pheromone und Kairomonen produziert.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

Wir beschreiben ein Protokoll für die in vivo-Markierung von olfaktorischen sensorischen Neuronen durch Elektroporation und anschließende konfokale Laser-Scanning- oder Multiphotonenmikroskopie, um die neuronale Morphologie und ihre Entwicklung im Laufe der Zeit zu visualisieren.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren In Vivo

Die Analyse der physiologischen Eigenschaften von olfaktorischen sensorischen Neuronen stößt immer noch an technische Grenzen. Hier erfassen wir sie durch perforierte Patch-Clamp in einer intakten Präparation des olfaktorischen Epithels bei gengesteuerten Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Charakterisierung von Membraneigenschaften und Reaktionen auf spezifische Liganden von Neuronen, die definierte Geruchsrezeptoren exprimieren.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung und Analyse von Temperaturreaktionen im Riechkolben von Xenopus laevis. Geruchsrezeptor-Neuronen und Mitralzellen werden differentiell gefärbt, woraufhin Kalziumveränderungen aufgezeichnet werden, was eine Empfindlichkeit einiger neuronaler Netzwerke im Kolben gegenüber Temperaturabfällen widerspiegelt, die an der Nase induziert werden.

Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em&gt; Xenopus laevis</em

Dieses Protokoll analysiert Navigations Verhalten von Drosophila Larve in Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen. 630 nm Wellenlänge wird verwendet, um einzelne olfaktorischen Neuronen mit dem Ausdruck einer rot-verschoben Kanal Rhodopsin zu aktivieren. Larval Bewegung gleichzeitig verfolgt, digital erfasst und mit individuell geschriebenen Software analysiert.

Tracking von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen

Dieses Protokoll soll zeigen, wie man ein DNA/DOTAP-Gemisch in Augenknospen von eintägigen Xenopus laevis Embryonen mikroinjiziert und wie man einzelne grüne fluoreszierende Proteine (GFP) abbilden und rekonstruieren kann, die optische axonale Lauben in tektalen Midhirnen von intakte, lebende Xenopus Kaulquappen.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Dieses Protokoll beschreibt das Dissektionsverfahren, den Kulturzustand und die Live-Bildgebung eines Antennen-Hirn-Explantationssystems zur Untersuchung der olfaktorischen Schaltkreisanordnung.

Ein Explantationssystem für Zeitraffer-Bildgebungsstudien der olfaktorischen Schaltkreismontage bei Drosophila

Wir beschreiben hier Methoden zur Induktion und Analyse des olfaktorischen erfahrungsabhängigen Umbaus von synaptischen Glomeruli des Antennenlappens im juvenilen Gehirn von Drosophila .

Erfahrungsabhängiger Umbau der synaptischen Konnektivität von olfaktorischen sensorischen Neuronen im juvenilen Gehirn in einer kritischen Phase im frühen Leben

Erfahren Sie Methoden zur Funktionsauswertung olfaktorischer Wege in lebenden Xenopus-Kaulquappen. Diese Techniken ermöglichen In-vivo-Imaging und Verhaltensanalysen für neurobiologische Forschung.

Funktionsauswertung olfaktorische Wege im Leben Xenopus Kaulquappen

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