Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Transkriptionsregulierung beantworten, z. B. die Rolle von Chromatin-Interaktionen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine relativ unvoreingenommene Erfassung der Wechselwirkungen für einen Ort von Interesse bietet. Obwohl diese Methode Einblicke in Diepromithilfe-Enhancer-Interaktionen bieten kann, kann sie auch angewendet werden, um andere Arten von Chromatin-Wechselwirkungen zu identifizieren.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es mehrere Tage für das Protokoll dauert, und das Primerdesign erfordert Versuch und Fehler und atypische Primerorientierung. Um Chromatin-Wechselwirkungen in Zellen ihrer Wahl zu erhalten, kreuzen Sie sie, indem Sie 9,5 Milliliter formaldehyd der Elektronenmikroskopie in PBS pro 10 Millionen Zellen hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen während des Schaukelns für 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Übertragen Sie die Reaktionsrohre auf Eis, um die Kreuzverknüpfungsreaktion zu löschen und ein Molarglycin eiskalt zu einer Endkonzentration von 0,125 Mol hinzuzufügen und durch sanfte Inversion zu mischen. Nach zentrifugieren und waschen die Zellen nach dem Textprotokoll, setzen Sie das Pellet in 125 Mikroliter von fünf Millimolar EDTA mit 0,5%SDS und einem X-Protease-Inhibitoren wieder aus. Die Zellsuspension auf Eis für 10 Minuten inkubieren.

Um sicherzustellen, dass die Zelllyse vollständig ist, mischen Sie sechs Mikroliter der Zellen mit sechs Mikroliter Trypanblau auf einem Mikroskopschlitten und decken Sie mit einem Deckelschlupf ab. Sehen Sie unter einem Mikroskop das Innere der lysierten Zellen blau und unlysierte Zellen weiß. Für die erste Restriktionsverdauung 30 Mikroliter 10 X Restriktionsenzympuffer und 27 Mikroliter 20%Triton X-100 in die Zellsuspension geben und das Gesamtvolumen auf 300 Mikroliter mit Wasser einstellen.

Entfernen Sie einen 15 Mikroliter Aliquot und speichern Sie bei vier Grad Celsius als unverdaute Kontrolle. Zum verbleibenden Reaktionsgemisch fügen Sie 200 Einheiten des Restriktionsenzyms eins hinzu. Über Nacht bei der für das Enzym geeigneten Temperatur in einem schüttelenden Heizblock mit 900 Umdrehungen bebrüten.

Am nächsten Tag fügen Sie weitere 200 Einheiten des Enzyms hinzu und setzen Sie diese Inkubation über Nacht fort. Entfernen Sie einen 15 Mikroliter Aliquot und speichern Sie bei vier Grad Celsius als verdaut Kontrolle. Zur Bestimmung der Verdauungseffizienz fügen Sie 82,5 Mikroliter von 10 Millimolar Tris-HCl, pH 7,5, zu jeder unverdauten und verdauten Kontrollen hinzu.

2,5 Mikroliter Proteinase K hinzufügen und eine Stunde bei 65 Grad Celsius brüten, um die Formaldehyd-Kreuzverbindung umzukehren. Um die verdaute DNA zu isolieren, fügen Sie 100 Mikroliter Phenolchloroform in die Röhre. Mischen Sie durch mehrere schnelle Inversionen, um Restproteinkontamination zu entfernen.

Zentrifuge bei 16, 100 G bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach der Zentrifugation die wässrige Phase in ein neues Rohr übertragen. Natriumacetat, Glykogen und 100% Ethanol in die Röhre geben und durch Inversion sanft mischen.

Inkubieren Bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde, um die DNA zu fällen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 16, 100 G bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und fügen Sie dann 500 Mikroliter 70% Ethanol hinzu, um das DNA-Pellet zu waschen.

Zentrifuge bei 16, 100 G bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach dem Entfernen der überstehenden Luft trocknen Sie das Pellet bei Raumtemperatur für zwei Minuten, um Restethanol zu entfernen. Setzen Sie das getrocknete Pellet in 50 Mikrolitern aus und nukkelen Sie freies Wasser und bestimmen Sie die Verdauungseffizienz durch QPCR, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um sich auf Ligation vorzubereiten, erhitzen und aktivieren Sie das Restriktionsenzym, indem Sie die Röhre 20 Minuten bei 65 Grad Celsius inkubieren. Dann übertragen Sie den Inhalt der Röhre auf eine 50 Milliliter konische Röhre, und fügen Nuklease freies Wasser, 10 X Ligase Puffer, und T4 DNA Ligase. Mischen Sie sanft durch Wirbeln, und inkubieren Über Nacht bei 16 Grad Celsius und gehen Sie wie im Textprotokoll beschrieben.

Um die Kreuzverbindung umzukehren, fügen Sie 15 Mikroliter Proteinase K hinzu und brüten über Nacht bei 65 Grad Celsius. Am nächsten Tag 30 Mikroliter RNase A hinzufügen und bei 45 Minuten bei 37 Grad Celsius brüten. Um mit der Chromatin-Isolierung fortzufahren, fügen Sie sieben Milliliter Phenolchloroform hinzu und mischen Sie sie durch mehrere schnelle Inversionen.

Zentrifugieren Sie das Rohr bei 3, 300 G bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Nach der Zentrifugation die wässrige Phase auf ein neues 50-Milliliter-Rohr übertragen und nukleasefreies Wasser, drei Molnatriumacetat, Glykogen und 100% Ethanol hinzufügen. Mischen Sie den Inhalt und brüten bei negativen 80 Grad Celsius für eine Stunde.

Nach der Inkubation zentrieren Sie das Rohr bei 3, 900 G bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und waschen Sie dann das Pellet mit 10 Milliliter eiskaltem 70%Ethanol. Zentrifuge bei 3, 300 G bei vier Grad Celsius für 15 Minuten.

Entfernen Sie den Überstand, und trocknen Sie das Pellet kurz bei Raumtemperatur. Lösen Sie das Pellet in 150 Mikroliter n10 Millimolar Tris-HCl pH 7,5 bei 37 Grad Celsius auf. Bei negativen 20 Grad Celsius lagern oder mit der zweiten Einschränkungsverdauung, Ligation und DNA-Reinigung fortfahren, wie im Textprotokoll beschrieben.

Führen Sie QPCR nach der DNA-Reinigung mit inversen PCR-Primern und Cyber- und ROX-Farbstoffen durch, um die Anzahl der Amplifikationszyklen für die inverse PCR-Verstärkung unbekannter Interaktionssequenzen zu bestimmen, wie im Text beschrieben. Um DNA für die Sequenzierung vorzubereiten, schneiden Sie Ködersequenzen mit der dritten Einschränkungsverdauung ab, indem Sie ein Mikrogramm gereinigtes Produkt der inversen PCR sowie einen Restriktionsenzymmonitor verdauen. Führen Sie das verdauliche Restriktionsenzym oder RE-Monitor auf einem Agarose-Gel mit einer Konzentration aus, die den erwarteten Fragmenten entspricht.

Sobald die Verdauungseffizienz durch Gelelektrophorese bestimmt wurde, fahren Sie mit der inversen PCR-Produktreinigung und Der Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Die dritte Einschränkungsverdauung ist in diesem Protokoll für die Sequenzierung der kreisförmigen Chromosomenbestätigungserfassung der nächsten Generation wichtig. Diese Verdauung schneidet Ködersequenzen ab, die die Identifizierung von Chromatin-Attraktionen erleichtern können.

Die Agarose-Gel-Elektrophorese des verdauten RE-Monitors zeigte eine ausreichende Verdauung des parallel verdauten inversen PCR-Produkts an. Nach Fertigstellung wurden vier C-Sequenzierungs-Lesevorgänge mit dem BWA-Softwarepaket getrimmt und dem menschlichen Referenzgenom hg38 zugeordnet. Die meisten Lesevorgänge richten sich wie erwartet an Denkgebieten HindiIII oder CviQ1I an, die an HindiIII-Standorte angrenzen.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sicherzustellen, dass Ihre Zellen lysiert sind und das Chromatin ausreichend verdaut ist. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Chromatin-Immunfällung oder CHIP durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Identifizierung von Transkriptionsfaktoren zu beantworten, die an den Chromatin-Wechselwirkungen beteiligt sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Chromatin-Bereich, um physikalische regulierungsrechtliche Netzwerke zu erforschen.