Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet Abschnitte für die Beurteilung der Morphologie der peripheren Nerven

Diese Methode könnte dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Schädigung und Regeneration des peripheren Nervs zu beantworten, z. B. wie ist die Morphometrie eines peripheren Nervs, wie viele Axone sind vorhanden, wie ist der Zustand der Myelinisierung und ist fibrotisches Gewebe vorhanden? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine hochauflösende Visualisierung von Nervenmerkmalen ermöglicht. Beginnen Sie damit, eine betäubte Ratte in Bauchlage auf eine Seziermatte zu legen.

Platzieren Sie einen Nasenkonus, um die Anästhesie mit 1-2% Isofluran aufrechtzuerhalten. Um eine ausreichende Narkosetiefe zu gewährleisten, werden die Tiere auf Pedalrückzug und Lidreflexe der Hinterfüße getestet. Sobald eine angemessene Narkosetiefe erreicht ist, rasieren Sie die Haare der Hintergliedmaßen und sterilisieren Sie die rasierten Bereiche mit 70% Ethanol.

Palpieren Sie den Oberschenkelknochen, um die richtige Stelle für den Schnitt zu identifizieren. Der Femur befindet sich genau proximal des am besten zugänglichen Segments des Ischiasnervs. Nachdem Sie einen zwei bis drei Zentimeter langen Schnitt in der Haut entlang der hinteren Extremität vom Knie bis zum Trochanter major gemacht haben, lokalisieren Sie die Ebene zwischen dem Musculus biceps femoris und dem Musculus gluteus maximus.

Trennen Sie dann mit einer Mikrodissektionsschere die darunterliegende Faszie und legen Sie zwei bis drei Zentimeter des darunter liegenden Ischiasnervs frei. Verwenden Sie einen Retraktor, um den Abstand zwischen den beiden Muskeln zu vergrößern. Trennen Sie mit einer feinen Pinzette und einer Irisschere den Nerv vorsichtig vom umgebenden Bindegewebe und achten Sie darauf, den Nerv nicht zu komprimieren oder zu durchtrennen.

Bedecken Sie anschließend den freiliegenden Nerv mit Trumps Fixativ und lassen Sie ihn 10 Minuten einwirken. Legen Sie bei Bedarf Gaze unter das Hinterbein, um den Winkel zu verbessern, damit mehr Fixiermittel in die Kavität gegeben werden kann. Entfernen Sie das Fixiermittel nach 10 Minuten und wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male.

Schneiden Sie unter dem Präpariermikroskop den Ischiasnerv von beiden Seiten mit einer feinen Präparierschere ab und achten Sie darauf, den Nerv nicht zu dehnen oder einzuklemmen. Legen Sie die Nervenabschnitte sofort in 15-ml-Röhrchen mit Trumps Fixiermittel und fixieren Sie es eine Woche lang bei vier Grad Celsius, wobei Sie das Fixiermittel alle 48 Stunden wechseln. Entfernen Sie nach der Fixation vorsichtig das restliche Fett und Bindegewebe vom Nerv und schneiden Sie den Nerv mit einem scharfen Skalpell in etwa fünf Millimeter lange Segmente.

Nervensegmente können in verschiedene markierte Röhren unterteilt werden. Tauchen Sie Nervensegmente zwei Stunden lang in frisch zubereitetes 2%Osmiumtetroxid. Bereiten Sie mit einem Epoxid-Einbettungsset die endgültige Einbettmischung vor.

Mischen Sie das Epoxid-Einbettmedium mit der DDSA-Lösung und mischen Sie das Epoxid-Einbettmedium mit der NMA-Lösung. Mischen Sie beide Lösungen mindestens 20 Minuten lang mit einem Magnetrührer. Kombinieren Sie unmittelbar vor der Verwendung den DPM-Beschleuniger mit Lösung B, und kombinieren Sie diesen dann mit Lösung A, sodass der endgültige Anteil des Beschleunigers zwischen einem Komma fünf und 2 % des Gesamtvolumens liegt.

Übertragen Sie die Nervensegmente auf einen Punkt fünf Milliliter Röhrchen und beginnen Sie nach dem Waschen mit PBS den Dehydratisierungsprozess, indem Sie das PBS durch steigende Konzentrationen von Aceton und destilliertem Wasser für jeweils 10 Minuten ersetzen, dann dreimal für jeweils 10 Minuten in 100% Aceton. Ein kritischer Schritt ist die Dehydrierung des Gewebes. Wasser und Harz interagieren nicht, so dass das im Gewebe verbleibende Wasser nicht vom Harz infiltriert wird und Löcher im Schnitt ohne histologische Eigenschaften hinterlässt.

Für die Harzinfiltration legen Sie zunächst die Nervensegmente 30 Minuten lang in eine Eins-zu-Eins-Mischung aus Einbettmischung und 100%igem Aceton. Übertragen Sie die Segmente nach 30 Minuten für 30 Minuten auf eine Zwei-zu-Eins-Mischung aus Einbettmischung und 100 % Aceton. Platzieren Sie die Nervensegemente in Silikonkautschuk-Einbettungsformen und geben Sie das Harz vorsichtig auf die Nerven, wobei Sie darauf achten, dass das gesamte Nervensegment bedeckt ist und Luftblasen vermieden werden.

Lassen Sie das Harz über Nacht bei 60 Grad Celsius polymerisieren. Platzieren Sie einen Harzblock mit eingebettetem Nerv mit der trapezförmigen Seite nach oben in den Ultramikrotomhalter. Verwenden Sie beim Betrachten durch das Ultramikrotom-Zielfernrohr eine einschneidige Klinge, um überschüssiges Harz zu entfernen, das das Nervengewebe umgibt.

Dringen Sie nicht in die Längsoberfläche des Nervensegments ein, die an der dunklen Verfärbung mit Osmiumtetroxid erkennbar ist. Machen Sie mit einem einfachen Glasmesser auf dem Ultramikrotom mehrere Querschnitte, um eine gleichmäßige Querschnittsoberfläche des Nervs freizulegen. Sobald dies erledigt ist, wechseln Sie zu einem Glasmesser, wobei das Boot mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gefüllt ist, und stellen Sie das Ultramikrotom auf ein bis zwei Mikrometer ein, um dünne Schnitte zu schneiden.

Verwenden Sie eine Metallschlaufe, um schwimmende Dünnteile vom Glasmesserboot auf einen Tropfen deionisiertes Wasser auf einem Glasobjektträger zu übertragen. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Übertragung des Dünnschliffs vom Glasmesser auf den Objektträger. Diese dünnen Schnitte sind sehr zerbrechlich und können brechen oder sich falten.

Trocknen Sie die Abschnitte auf den Objektträgern, indem Sie die Folie mehrmals über eine Flamme führen, wobei Sie darauf achten, dass die Abschnitte nicht überhitzen. Objektträger können mehrere Tage bei Raumtemperatur gelagert werden, wenn sie nicht sofort mit Toluidinblau gefärbt werden. Um die Nervenabschnitte zu färben, verwenden Sie eine Plastikpipette oder Mikropipette, um einen Tropfen Toluidinblau-Lösung auf die Oberseite der Nervenabschnitte zu geben.

Spülen Sie nach 20 bis 30 Sekunden alle überschüssigen Toluidinblau-Lösungen ab, indem Sie die Objektträger vorsichtig in ein Glas mit entionisiertem Wasser tauchen und dies drei- bis viermal wiederholen, bis die Abschnitte klar sind. Trocknen Sie die Objektträger mindestens 15 Minuten bei 60 Grad Celsius oder über Nacht bei Raumtemperatur. Nach dem Trocknen normales Eindeckmedium hinzufügen und die Abschnitte mit einem Deckglas abdecken.

Untersuchen Sie abschließend die montierten Sektionen unter einem Lichtmikroskop. Für detaillierte Bilder zur Berechnung der g-Verhältnisse wird eine 100-fache Ölimmersionslinse empfohlen. Ischiasnervenabschnitte, die in Harzmedium eingebettet und mit Toluidinblau gefärbt waren, zeigten klare Bilder mit optimaler Auflösung bei Erhöhung der Vergrößerung von 10X auf 20X, 40X und 60X.

Diese Methode bewahrt die Nervenstruktur und ermöglicht eine hochauflösende Bildgebung mit hoher Vergrößerung, die die Messung mehrerer Parameter erleichtert, wie z. B. des g-Verhältnisses, das das Verhältnis des Axondurchmessers, angezeigt durch den Pfeil mit der Bezeichnung B, zum Gesamtfaserdurchmesser mit der Bezeichnung A. Eine Vielzahl von Faktoren kann zu nicht optimalen peripheren Nervenabschnitten führen, einschließlich des Vorhandenseins von Rissen in dem Abschnitt aufgrund unsachgemäßer Handhabung des Nervs. Auch durch unzureichende Dehydrierung können Löcher in der Sektion entstehen. Ein weiterer möglicher Fehler im Verfahren ist das Falten der Sektionen, was durch die Verwendung von Impfösen für die Übertragung der Profile auf den Objektträger behoben werden kann.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Axonquantifizierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie hoch ist der Regenerationsgrad in einem regenerativen Nerv? Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein bis zwei Mikrometer lange periphere Nervenschnitte erhalten, um die Nervenmorphometrie zu beurteilen.