Name: Eine direkte Kraft-Sonde zur Messung der mechanischen Integration zwischen dem Kern und dem Zytoskelett (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Mikropipetten-Methode zur Messung nukleärer Mechanik in lebenden Zellen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Kraft, die zum Verformen des Zellkerns erforderlich ist, und liefert Einblicke in die mechanische Integration zwischen Kern und Zytoskelett.

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1. Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung
Hinweis: Die unmittelbaren Zwangs-Sonde (DFP) kann für adhärente Zelltypen jeglicher Art verwendet werden. Hier werden NIH-3 t 3-Maus-Fibroblasten als die Modell-Zell-Linie für dieses Protokoll verwendet.
<ol><li>Kultur NIH-3 t 3-fibroblastenzellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % Spender Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin auf einem 35-mm-Glasboden Schale bis zum gewünschten Konfluenz. Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2zu erhalten.<ol>
<li>Achten Sie darauf, alle 35 mm unten Glasschalen mit 5 µg/mL Fibronektin (oder ähnliche ECM-Protein), Mantel vor der Aussaat NIH-3 t 3-Zellen für die Bildgebung. Hinweis: Die Zellen müssen vollständig verteilt und Anhänger auf dem Teller für das Experiment. Es gibt keine Einschränkungen in Bezug auf die Konfluenz für die DFP-Methode zu arbeiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Unmittelbar vor dem Experiment waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS gefolgt von einem einzigen waschen mit vollständigen Wachstumsmedium.</li>
	<li>Die untere Glasschale 3 mL komplette Wachstumsmedium hinzufügen.</li>
</ol>2. Mikroskopie und Bildaufnahme
Hinweis: Ein umgekehrtes Fluoreszenz Mikroskop (oder Äquivalent) mit Mikromanipulator auf den Seitenarm, entsprechend den Empfehlungen des Herstellers installiert. Das Mikroskop sollte auch mit einer Klimakammer weiterhin die Temperatur bei 37 ° C und CO-2 -Ebene mit 5 % ausgestattet werden. Ein Mikromanipulator und Microinjector mit dem Mikroskop verbunden ist ebenfalls erforderlich. Ein Öl-Immersion 40 X / 1,3 NA oder 60 X / 1,49 NA (oder gleichwertige Ziele) werden empfohlen für die Experimente. Das Mikroskop sollte auf einem Rütteltisch isoliert montiert werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig1.jpg"> Abbildung 1 . Nukleare Verformung und Mikroskop mit Schwerpunkt A. maximale nukleare Verformung und Entspannung der nuklearen Verformung. Vor der Berechnung maximale nukleare Deformation, wurden die hinteren Kanten der nuklearen Formen zuerst fiel um für die Übersetzung von deformierten Kern zu korrigieren. Die Form des Kerns zum Zeitpunkt der Mikropipette Tipp Ablösung war vor dem abziehen auf nukleare Ausgangsform überlagert. Der Unterschied im Bereich zwischen den beiden Formen als Δ gemessen wurdeeine1. Die maximale nukleare Verformung wurde als ΔA1 geteilt durch die ursprünglichen nuklearen Bereich definiert. Auch ein zweiter Parameter, Δ2, kann durch die Überlagerung der endgültigen Steady-State nuclear Form nach Mikropipette Ablösung auf die nukleare Originalform definiert werden. B. konzentrieren sich die Zelle auf der Fläche A und Verschieben der Brennebene bis Ebene B Mikropipette Tipp zu finden. Während der Aufnahme, wurde die Mikropipette nach rechts (Richtung oranger Pfeil) übersetzt. Diese Zahl wurde von Neelam Et al.modifiziert. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58038/58038fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol><li>Schalten Sie die Microinjector pro des Herstellers Protokoll.</li>
	<li>Tragen Sie mit einer eintauchen Öl Pipette einen einzigen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv.</li>
	<li>Klemmen Sie die Schüssel fest in die Schale Halter und laden Sie die Schale Halter auf die Bühne. Hinweis: Die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 während des Experiments einzuhalten.</li>
	<li>Passen Sie die Höhe des Ziels, die Zellen in den Fokus (Ebene A, Abbildung 1 b) bringen.</li>
	<li>Bewegen Sie den Mikroskoptisch, eine Zelle von Interesse zu finden.</li>
	<li>Drehen Sie den Joystick auf der Mikromanipulator, pipettieren Halter an die oberste Position zu bewegen. Laden Sie die 0,5 µm Durchmesser Spitze Mikropipette auf den Halter pipettieren.<ol>
<li>Zur Vermeidung von Zelladhäsion, die Mikropipette Vorbehandeln der Mikropipette Spitze mit 0,3 mg/mL PLL-g-PEG-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur. Haftung durch Berühren der Mikropipette in den Zellkern ohne Saug Druck, und dann übersetzen die Mikropipette vom Nucleus testen. Keine Haftung kann von einem völligen Mangel an nuklearen Verformung und Übersetzung erkannt werden. Hinweis: Führen Sie Herstellung Vorschläge, um das Paket zu öffnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erhöhen die objektiven Brennebene über Flugzeug A und am oberen Rand der Zelle nach Flugzeug B durch die Feinsteuerung einstellen (Abbildung 1 b, siehe Punkt 2.4).</li>
	<li>Legen Sie die Mikromanipulator auf grob Kontrolle. Bringen Sie langsam die Mikropipette bis Flugzeug B durch die Beobachtung für die Silhouette des mikropipette, bis die Mikropipette voll ins Blickfeld kommt.</li>
	<li>Sobald die Mikropipette Tipp korrekt ausgerichtet ist, soll der Mikromanipulator Feinsteuerung .</li>
	<li>Senken Sie das Ziel, die äquatorialebene der Zelle (Ebene A, Abbildung 1 b) und senken Sie die Mikropipette bis etwa 15 µm über Ebene A (Abb. 1 b, gestrichelten Mikropipette).</li>
	<li>Die Entschädigung Druck (P-c) auf die Microinjector auf den gewünschten Druck einstellen; warten Sie einige Sekunden für den Druck zu stabilisieren. Hinweis: Der optimale Druck-Sollwert richtet sich nach Zelltyp und die spezifischen Ziele des Experiments. In den meisten Fällen wäre 300 hPa ein guter Ausgangspunkt.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Mikropipette nicht verstopft ist, mit Hilfe der Clean -Einstellung im Feld Mikromanipulator und überprüfen, um sicherzustellen, dass Luftblasen aus der Mikropipette Spitze entstehen.</li>
	<li>Führen Sie die Spitze in die Zelle durch eine schrittweise Senkung der Mikropipette bis die Spitze die nuklearen Oberfläche leicht berührt. Hinweis: Wenn die Mikropipette absenken, die Silhouette der Mikropipette Spitze wird klar, wie es in den Fokus kommt. Bevor die Mikropipette den Kern berührt, erhöhen Sie den Objektive Fokus zu und richten Sie die Mikropipette Spitze mit Kern (gleichen X-y-Koordinate, höheren Z-Ebene). Im Mittelpunkt der Äquatorebene des Kerns (Ebene A, Abbildung 1 b) zurück wieder und senken Sie allmählich die Mikropipette Spitze.</li>
	<li>Erstellen Sie eine Dichtung zwischen der Mikropipette Spitze und die Kernmembran durch das Trennen der Druck-Zuleitung von der Mikroinjektion System, und eröffnet damit die Mikropipette Rohrende in die Atmosphäre. Dieser Schritt schafft einen negativen Druck gleich Pc an der nuklearen Oberfläche.</li>
	<li>Bilder mit den Mikroskopen Bild Datenerfassungs-Software zu erwerben. Eine Avi-Erwerb (Video) oder Nd-Erwerb (Bilder) in der Bild-Datenerfassungs-Software einrichten. Hinweis: Für jede Imaging Software zu erwerben, eingerichtet in Echtzeit video Bildgebung oder Zeitraffer Bild Akquisitionen mit einem kurzen Zeitintervall.</li>
	<li>Umschalten auf das entsprechende Leuchtstoff imaging Channel (z. B. GFP, RFP, etc.) und Bildgebung zu beginnen.</li>
	<li>Übersetzen die Mikropipette Spitze vom Körper der Zelle (nach rechts, Abbildung 1 b) bis der Kern aus der Mikropipette löst. Hinweis: Ziehen Sie die Spitze entlang der positiven X-Richtung (nach rechts in das Blickfeld). Die ziehende Rate kann programmiert und gesteuert durch Computer oder der Joystick kann manuell verschoben werden. Haben wir nicht gefunden, eine Korrelation zwischen der ziehen-Rate und nukleare Verformung15 schlägt eine in erster Linie elastische Reaktion zu zwingen.</li>
</ol>(3) Datenanalyse
<ol><li>Führen Sie Bildanalyse mit grundlegenden Bildverarbeitungs-Software zur Verfügung. Das Ausmaß der nuklearen Verformung kann durch die Länge Belastung (Ɛ) oder der Bereich Belastung (Abbildung 1A) quantifiziert werden. Quantifizieren, Länge Belastung mit Formel 1, wo L und L0 darstellen bzw. die Länge des Kerns auf maximale Deformation und die ursprüngliche Position. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58038/58038eq1.jpg">(Gleichung 1)</li>
</ol>

<ol><li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li>
<li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li>
<li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+and+heterochromatin%3A+a+complex+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li>
<li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+rheology+of+isolated+nuclei+with+deformation+mapping+of+nuclear+substructures%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures.</a> Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li>
<li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li>
<li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li>
<li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li>
<li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002(2013).</li>
<li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li>
<li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li>
<li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion%2C+migration%2C+and+cyclic+strain-induced+reorientation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living%2C+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Messung der mechanischen Integration des Kerns mit dem Zytoskelett ist eine Herausforderung für die aktuellsten Methoden, z. B. Mikropipette Anspruch16, weil sie entweder einzelne Kerne erfordern (wo ist der Kern von dem Zytoskelett entkoppelt) oder Kerne in den suspendierten Zellen (wo extrazelluläre Kräften wie Zugkräfte, fehlen). Auf den Kern wurde Kraft angewandt, indem biaxiale Beanspruchung auf Zellen Anhänger auf eine Membran17,18; ...

Krankheiten wie Krebs betreffen Änderungen an nuklearen Form und Struktur1,2, die in der Regel von einer Erweichung der Kern3,4begleitet werden. Nukleare Widerstand gegen mechanische Verformung hat in der Regel durch Krafteinwirkung auf isolierten Kernen5gekennzeichnet.
Kern in Zellen ist Molekular mit dem Zytoskelett der Linker Nucleoskeleton und Cytoskelett (LINC) komplexe6,7,8,9verbunden. Infolgedessen ist der Kern mechanisch mit dem Zytoskelett und durch Zelle-Substrat Verwachsungen, die extrazelluläre Matrix integriert. Mechanisch sondieren des Kerns im Inneren adhärente Zellen bieten einen Einblick in diese mechanischen Integration. Methoden der Kerne in lebenden Zellen zu manipulieren zählen Mikropipette Anspruch10,11und atomic Force Microscopy12,13,14. Wir beschrieben vor kurzem eine unmittelbaren Zwangs-Sonde (DFP), die mechanische Kräfte direkt auf den Kern in einem lebendigen adhärente Zellen15gilt.
Hier beschreiben wir das Verfahren für die Nutzung einer Mikroinjektion Systems, die häufig in Mikroskopie Einrichtungen, eine bekannte, Nano-Maßstab mechanische Kraft direkt in den Zellkern in eine adhärente Zellen anzuwenden. Ein Femtotip (0,5 µm Durchmesser Mikropipette Spitze) ist montiert und die Mikroinjektion System durch ein Rohr verbunden. Der Tipp, positioniert in einem 45° Winkel relativ zur Oberfläche der Kulturschale sinkt bis angrenzend an der nuklearen Oberfläche. Das Rohr ist dann nicht getrennt und die Atmosphäre, die schafft eines negativen Saugdruck an der nuklearen Oberfläche und dichtet die Mikropipette Spitze gegen die nukleare Oberfläche eröffnet. Durch die Übersetzung der Mikropipette Spitze ist der Kern verformt und schließlich (abhängig von der Größe der Krafteinwirkung), losgelöst von der Mikropipette. Diese Abteilung tritt auf, wenn die Rückstellkräfte (widerstehen), ausgeübt durch den Kern und die Zelle, die Saugkraft durch die Mikropipette aufgetragen gleich. Analyse kann erfolgen durch die Verschiebung des Kerns, Messung der Länge Dehnung (Gleichung 1) oder der Bereich Belastung (Abb. 1A).

<table><tbody><tr><td>Fluorschale</td><td></td><td>WPI FD35</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 59</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11341</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI2</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>eingestellt, aktuelles gleichwertiges Modell: InjectMan 4</td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>Aktuelles Modell FemtoJet 4i</td></tr><tr><td>Plan Fluor Öl Immersion 40x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Apo TIRF Öl Immersion 60x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Donor Rinderserum (DBS)</td><td>ThermoFisher Wissenschaftliche</td><td>16030074</td><td>NIH 3T3-Serum</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM)</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>MT10013CVRF</td><td>NIH 3T3 Medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>MT30004CIRF</td><td>NIH 3T3 Medium Ergänzung</td></tr><tr><td>Immersionsöl Typ LDF Nicht fluoreszierend</td><td>Nikon</td><td>77007</td><td>Immersionsöl für Objektiv&nbsp;</td></tr></tbody></table>

eine direkte kraft-sonde zur messung der mechanischen integration zwischen dem kern und dem zytoskelett

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Die mechanischen Eigenschaften des Kerns bestimmen seine Reaktion auf mechanische Kräfte, die in den Zellen erzeugt. Da der Kern mit dem Zytoskelett Molekular kontinuierlich ist, werden Methoden benötigt, das mechanische Verhalten in adhärenten Zellen zu untersuchen. Hier diskutieren wir die unmittelbaren Zwangs-Sonde (DFP) als Instrument zur Kraft direkt in den Zellkern in lebenden adhärente Zellen anwenden. Wir legen einen schmalen Mikropipette zur nuklearen Oberfläche mit Absaugung. Die Mikropipette wird vom Nucleus, übersetzt, was bewirkt, den Kern dass zu verformen und zu übersetzen. Wenn die Rückstellkraft der Saugkraft entspricht, wird der Kern löst und elastisch entspannt. Da der Saugdruck genau bekannt ist, wird die Kraft auf die nukleare Oberfläche bezeichnet. Diese Methode hat ergeben, dass Nano-Maßstab Kräfte ausreichen, um zu verformen und übersetzen den Zellkern in adhärenten Zellen und identifiziert Zellskelett Elemente, mit die den Kern Kräften widerstehen können. Die DFP kann verwendet werden, um die Beiträge der zellulären und nuklearen Komponenten zur nuklearen mechanischen Eigenschaften in lebenden Zellen zu sezieren.

Abbildung 2A zeigt einem NIH-3 t 3 Maus Fibroblasten Kern zu zwingen. Die Mikropipette Spitze auf der rechten Seite übersetzt wird, der Kern verformt sich und löst sich schließlich von der Mikropipette Spitze. Die Länge Belastung des Kerns wird gesehen, mit zunehmender Saugkraft (Abb. 2 b) zu erhöhen. Die Vorderkante des Kerns (Mikropipette Kante ziehen) bildet eine nukleare Vorwölbung und die Hinterkante ist von seiner ursprüngl...

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Mikropipette-Methode, um eine kontrollierte Kraft direkt in den Zellkern in einer lebenden Zelle anwenden. Dieser Test ermöglicht Verhör der nuklearen mechanischen Eigenschaften in der lebendigen, anhaftende Zelle.

Eine direkte Kraft-Sonde zur Messung der mechanischen Integration zwischen dem Kern und dem Zytoskelett

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Kernmechanik zu beantworten. Welche Kraft ist zum Beispiel erforderlich, um den Zellkern in einer Zelle zu verformen? Welchen Beitrag leisten zelluläre und nukleare Komponenten zum nuklearen Widerstand gegen Verformung?Oder variiert die Kernkopplung mit zellulären Strukturen je nach Zelltyp? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, das integrierende Nukleozytoskelett in einer lebenden adhärenten Zelle mit Sondierungskraft zu verformen. Obwohl diese Methode verwendet wurde, um Einblicke in die kernmechanischen Eigenschaften in NIH-3T3-Zellen zu erhalten, kann sie auch auf jeden adhärenten Zelltyp angewendet werden, z. B. auf die Untersuchung der kernmechanischen Eigenschaften in Hutchinson-Gilford-Progerialzellen.Um dieses Verfahren zu beginnen, beschichten Sie eine 35 Millimeter große Glasbodenschale mit 5 Mikrogramm pro Milliliter Fibronektin. Anschließend werden die NIH 3T3-Fibroblastenzellen in DMEM, ergänzt mit 10 % Spender-Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin, auf der beschichteten Schale bei 37 Grad Celsius kultiviert, bis die gewünschte Konfluenz erreicht ist. Unmittelbar vor dem Experiment waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, gefolgt von einer einmaligen Wäsche mit vollständigem Wachstumsmedium.Gib anschließend drei Milliliter des kompletten Wachstumsmediums in eine Schale mit Glasboden. Schalten Sie bei diesem Verfahren den Mikroinjektor ein. Tragen Sie mit einer Pipette einen Tropfen Immersionsöl auf die Objektivlinse auf.Klemmen Sie dann die Schüssel fest an den Schalenhalter und laden Sie den Schalenhalter auf die Bühne. Bitte beachten Sie, dass die Zellen während des gesamten Experiments bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gehalten werden sollten. Passen Sie als Nächstes die Höhe des Objektivs an, um die Zellen in den Fokus zu bringen.Bewegen Sie den Mikroskoptisch, um eine Zelle von Interesse zu finden. Bewegen Sie den Pipettenhalter mit dem Mikromanipulator in die höchste Position. Laden Sie anschließend die Mikropipette mit einer Spitze von 0,5 Mikrometer Durchmesser auf den Pipettenhalter.Heben Sie dann die Objektivfokusebene über Ebene A und die Oberseite der Zelle auf Ebene B an, indem Sie den Feinregler anpassen. Stellen Sie als Nächstes den Mikromanipulator auf eine grobe Steuerposition. Bringen Sie die Mikropipette langsam nach unten auf Ebene B, indem Sie auf die Silhouette der Mikropipette achten, bis die Mikropipette vollständig scharf ist.Sobald die Spitze der Mikropipette scharf ist, stellen Sie den Mikromanipulator auf Feinsteuerung. Senken Sie anschließend das Objektiv auf die Äquatorebene der Zelle ab und senken Sie die Mikropipette auf etwa 15 Mikrometer darüber ab. Stellen Sie den Ausgleichsdruck am Mikroinjektor auf den gewünschten Druck ein.Warten Sie einige Sekunden, bis sich der Druck stabilisiert hat. Es ist wichtig zu überprüfen, ob die Pipettenspitze gebrochen oder verstopft ist, da sonst die Kraftmessung ungenau wäre. Stellen Sie sicher, dass die Mikropipette nicht verstopft ist, indem Sie die saubere Einstellung auf dem Mikromanipulatorfeld verwenden, und stellen Sie sicher, dass die Luftblasen aus der Mikropipettenspitze austreten.Führen Sie dann die Spitze der Mikropipette in die Zelle ein, bis sie die Kernoberfläche leicht berührt. Stellen Sie eine Abdichtung zwischen der Mikropipettenspitze und der Kernmembran her, indem Sie das Druckversorgungsrohr vom Mikroinjektionssystem trennen und dadurch das Ende der Mikropipette zur Atmosphäre hin öffnen. Dieser Schritt erzeugt einen Unterdruck, der dem Ausgleichsdruck auf der Kernoberfläche entspricht.Öffnen Sie als Nächstes die Bildsammlungssoftware. Richten Sie eine AVI-Erfassung für Videos oder eine ND-Erfassung für Bilder in der Bildsammlungssoftware ein. Wechseln Sie dann zum entsprechenden Fluoreszenzbildgebungskanal und beginnen Sie mit der Bildgebung.Bewegen Sie die Spitze der Mikropipette vom Zellkörper weg, bis sich der Zellkern von der Mikropipette löst. Diese Abbildung zeigt den Antrieb eines NIH 3T3-Maus-Fibroblastenkerns. Wenn sich die Mikropipettenspitze nach rechts bewegt, verformt sich der Zellkern und löst sich schließlich von der Mikropipettenspitze.Es ist zu beobachten, dass die Längendehnung des Kerns mit zunehmender Saugkraft zunimmt. Die Vorderkante des Kerns bildet einen Kernvorsprung und die Hinterkante wird aus ihrer ursprünglichen Position verschoben. Die Länge des Vorsprungs ist viel größer als die Hinterkantenverschiebung, was auf eine enge Integration zwischen dem Zellkern und dem umgebenden Zytoplasma hindeutet.Die Zeitskalen sind kurz für die Entspannung der nuklearen Vorderkante und der nuklearen Hinterkante. Mit Hilfe der Direktkraftsonde wurde der Beitrag von intranukleären und zytoskelettalen Strukturen zum Widerstand des Zellkerns gegen Verformung bestimmt. Fluoreszierende Bilder zeigten die Überlagerung des Zellkerns vorher und nachher im angegebenen Zustand.Während nach der F-Aktin-Disruption oder der Mikrotubuli-Disruption keine signifikanten Unterschiede in der nukleären Deformation oder Translation gefunden wurden, führte die Verringerung der Menten-Expression durch siRNA-basierten Knockdown zu einer signifikant stärkeren nuklearen Translation und Deformation. Dies deutet darauf hin, dass die Menten-Zwischenfilamente in Fibroblasten das wichtigste Element des Zytoskeletts sind, das dem Zellkern hilft, der lokalen Kraft zu widerstehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine kontrollierte und bekannte Kraft auf den Zellkern in einer lebenden adhärenten Zelle ausüben können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir stellen zwei unabhängige, Mikroskop-basierten Tools zur induzierten Nuklear-und Zytoskelett-Verformungen in Einzel-, Wohn adhärente Zellen in Reaktion auf die globale oder lokale Dehnung Anwendung zu messen. Diese Techniken werden verwendet, um nukleare Steifigkeit (dh, Verformbarkeit) zu ermitteln und intrazellulären Kraftübertragung zwischen dem Kern und dem Zytoskelett-Sonde.

Biophysikalische Assays auf die mechanischen Eigenschaften der Interphase Zellkern Probe: Substrat Dehnungs-Anwendung und Mikronadel Manipulation

Vor kurzem wurde eine Reihe von FRET-basierten Kraft-Biosensoren entwickelt, die die proteinspezifische Auflösung der intrazellulären Kraft ermöglichen. In diesem Protokoll zeigen wir, wie einer dieser Sensoren, der für den Linker des Nukleoskelett-Zytoskelett (LINC)-Komplexproteins Nesprin-2G entwickelt wurde, zur Messung von Aktomyosinkräften auf den nukleären LINC-Komplex verwendet werden kann.

Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Charakterisierung von Nukleosom Partikel auf der Einzelmolekül-Ebene mit statischen und Zeitraffer Rasterkraftmikroskopie (AFM) bildgebende Verfahren. Die Oberfläche Funktionalisierung beschriebene Methode ermöglicht die Erfassung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen in hoher Auflösung im Nanobereich.

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von gestreiften Muskelmyofibrils mit Nano-Newton-Auflösung vorgestellt. Das Protokoll verwendet ein Setup mit einer Interferometrie-basierten optischen Kraftsonde. Dieses Setup erzeugt Daten mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht die Beurteilung der kontraktilen Kinetik von Myofibrils.

Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von DNA-basierten Spannungssonden beschrieben, um die von Immunzellen ausgeübten Rezeptorkräfte abzubilden. Dieser Ansatz kann Rezeptorkräfte &gt;4,7 pN in Echtzeit abbilden und Kräfte über die Zeit integrieren.

DNA-Spannungssonden zur Kartierung der transienten Piconewton-Rezeptor-Kräfte durch Immunzellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die intrazellulären mechanischen Eigenschaften isolierter embryonaler Zebrafischzellen im dreidimensionalen Einschluss mit direkter Kraftmessung durch eine optische Falle zu untersuchen.

Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

Hier stellen wir ein Protokoll zur Rekonstitution von Mikrotubulibündeln in vitro und zur direkten Quantifizierung der in ihnen ausgeübten Kräfte durch simultanes optisches Einfangen und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Dieser Assay ermöglicht die Messung der Kräfte und Verschiebungen, die von Proteinensembles in aktiven Mikrotubuli-Netzwerken erzeugt werden, auf Nanoskala-Ebene.

Direkte Messung von Kräften innerhalb rekonstituierter aktiver Mikrotubulibündel

Diese Studie stellt ein neues Protokoll vor, um mechanische Kraft direkt auf den Zellkern durch magnetische Mikroperlen auszuüben, die in das Zytoplasma abgegeben werden, und simultane Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen.

Kombination von 3D-Magnetkraftaktor und multifunktionaler Fluoreszenzbildgebung zur Untersuchung der Kernmechanobiologie

Die Wechselwirkung zwischen HCN-Kanäle und deren Hilfsuntereinheit als ein therapeutisches Ziel in der Major Depressive Disorder identifiziert worden. Hier wird eine Fluoreszenzpolarisationsgestütztes Verfahren zur Identifizierung von Kleinmolekül-Inhibitoren dieser Protein-Protein-Interaktion, dargestellt.

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Konformationsänderungen Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion. Hier beschreiben wir die Verwendung von zeitaufgelöster Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie gekoppelt Wasserstoff-Deuterium-Austausch für die schnellen Strukturveränderungen Sondieren, die Funktion in geordneten und ungeordneten Proteinen treiben.

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Erfahren Sie die Mikropipetten-Methode zur Messung nukleärer Mechanik in lebenden Zellen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Kraft, die zum Verformen des Zellkerns erforderlich ist, und liefert Einblicke in die mechanische Integration zwischen Kern und Zytoskelett.

Eine direkte Kraft-Sonde zur Messung der mechanischen Integration zwischen dem Kern und dem Zytoskelett

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