Eine direkte Kraft-Sonde zur Messung der mechanischen Integration zwischen dem Kern und dem Zytoskelett

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Kernmechanik zu beantworten. Welche Kraft ist zum Beispiel erforderlich, um den Zellkern in einer Zelle zu verformen? Welchen Beitrag leisten zelluläre und nukleare Komponenten zum nuklearen Widerstand gegen Verformung?

Oder variiert die Kernkopplung mit zellulären Strukturen je nach Zelltyp? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, das integrierende Nukleozytoskelett in einer lebenden adhärenten Zelle mit Sondierungskraft zu verformen. Obwohl diese Methode verwendet wurde, um Einblicke in die kernmechanischen Eigenschaften in NIH-3T3-Zellen zu erhalten, kann sie auch auf jeden adhärenten Zelltyp angewendet werden, z. B. auf die Untersuchung der kernmechanischen Eigenschaften in Hutchinson-Gilford-Progerialzellen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, beschichten Sie eine 35 Millimeter große Glasbodenschale mit 5 Mikrogramm pro Milliliter Fibronektin. Anschließend werden die NIH 3T3-Fibroblastenzellen in DMEM, ergänzt mit 10 % Spender-Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin, auf der beschichteten Schale bei 37 Grad Celsius kultiviert, bis die gewünschte Konfluenz erreicht ist. Unmittelbar vor dem Experiment waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, gefolgt von einer einmaligen Wäsche mit vollständigem Wachstumsmedium.

Gib anschließend drei Milliliter des kompletten Wachstumsmediums in eine Schale mit Glasboden. Schalten Sie bei diesem Verfahren den Mikroinjektor ein. Tragen Sie mit einer Pipette einen Tropfen Immersionsöl auf die Objektivlinse auf.

Klemmen Sie dann die Schüssel fest an den Schalenhalter und laden Sie den Schalenhalter auf die Bühne. Bitte beachten Sie, dass die Zellen während des gesamten Experiments bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gehalten werden sollten. Passen Sie als Nächstes die Höhe des Objektivs an, um die Zellen in den Fokus zu bringen.

Bewegen Sie den Mikroskoptisch, um eine Zelle von Interesse zu finden. Bewegen Sie den Pipettenhalter mit dem Mikromanipulator in die höchste Position. Laden Sie anschließend die Mikropipette mit einer Spitze von 0,5 Mikrometer Durchmesser auf den Pipettenhalter.

Heben Sie dann die Objektivfokusebene über Ebene A und die Oberseite der Zelle auf Ebene B an, indem Sie den Feinregler anpassen. Stellen Sie als Nächstes den Mikromanipulator auf eine grobe Steuerposition. Bringen Sie die Mikropipette langsam nach unten auf Ebene B, indem Sie auf die Silhouette der Mikropipette achten, bis die Mikropipette vollständig scharf ist.

Sobald die Spitze der Mikropipette scharf ist, stellen Sie den Mikromanipulator auf Feinsteuerung. Senken Sie anschließend das Objektiv auf die Äquatorebene der Zelle ab und senken Sie die Mikropipette auf etwa 15 Mikrometer darüber ab. Stellen Sie den Ausgleichsdruck am Mikroinjektor auf den gewünschten Druck ein.

Warten Sie einige Sekunden, bis sich der Druck stabilisiert hat. Es ist wichtig zu überprüfen, ob die Pipettenspitze gebrochen oder verstopft ist, da sonst die Kraftmessung ungenau wäre. Stellen Sie sicher, dass die Mikropipette nicht verstopft ist, indem Sie die saubere Einstellung auf dem Mikromanipulatorfeld verwenden, und stellen Sie sicher, dass die Luftblasen aus der Mikropipettenspitze austreten.

Führen Sie dann die Spitze der Mikropipette in die Zelle ein, bis sie die Kernoberfläche leicht berührt. Stellen Sie eine Abdichtung zwischen der Mikropipettenspitze und der Kernmembran her, indem Sie das Druckversorgungsrohr vom Mikroinjektionssystem trennen und dadurch das Ende der Mikropipette zur Atmosphäre hin öffnen. Dieser Schritt erzeugt einen Unterdruck, der dem Ausgleichsdruck auf der Kernoberfläche entspricht.

Öffnen Sie als Nächstes die Bildsammlungssoftware. Richten Sie eine AVI-Erfassung für Videos oder eine ND-Erfassung für Bilder in der Bildsammlungssoftware ein. Wechseln Sie dann zum entsprechenden Fluoreszenzbildgebungskanal und beginnen Sie mit der Bildgebung.

Bewegen Sie die Spitze der Mikropipette vom Zellkörper weg, bis sich der Zellkern von der Mikropipette löst. Diese Abbildung zeigt den Antrieb eines NIH 3T3-Maus-Fibroblastenkerns. Wenn sich die Mikropipettenspitze nach rechts bewegt, verformt sich der Zellkern und löst sich schließlich von der Mikropipettenspitze.

Es ist zu beobachten, dass die Längendehnung des Kerns mit zunehmender Saugkraft zunimmt. Die Vorderkante des Kerns bildet einen Kernvorsprung und die Hinterkante wird aus ihrer ursprünglichen Position verschoben. Die Länge des Vorsprungs ist viel größer als die Hinterkantenverschiebung, was auf eine enge Integration zwischen dem Zellkern und dem umgebenden Zytoplasma hindeutet.

Die Zeitskalen sind kurz für die Entspannung der nuklearen Vorderkante und der nuklearen Hinterkante. Mit Hilfe der Direktkraftsonde wurde der Beitrag von intranukleären und zytoskelettalen Strukturen zum Widerstand des Zellkerns gegen Verformung bestimmt. Fluoreszierende Bilder zeigten die Überlagerung des Zellkerns vorher und nachher im angegebenen Zustand.

Während nach der F-Aktin-Disruption oder der Mikrotubuli-Disruption keine signifikanten Unterschiede in der nukleären Deformation oder Translation gefunden wurden, führte die Verringerung der Menten-Expression durch siRNA-basierten Knockdown zu einer signifikant stärkeren nuklearen Translation und Deformation. Dies deutet darauf hin, dass die Menten-Zwischenfilamente in Fibroblasten das wichtigste Element des Zytoskeletts sind, das dem Zellkern hilft, der lokalen Kraft zu widerstehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine kontrollierte und bekannte Kraft auf den Zellkern in einer lebenden adhärenten Zelle ausüben können.