Name: Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Lernen Sie eine halbautomatisierte Bildanalysemethode zur quantitativen Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila mit ImageJ. Diese Technik minimiert Selektionsbias und maximiert die Reproduzierbarkeit bei der Proteinaggregatquantifizierung.

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Diese Arbeit wird unterstützt durch die Sheila und David Fuente neuropathischen Schmerzen Forschung Programm Graduate Fellowship (zu J.M.B.), Lois Pope LIFE Fellows Programm (, C.L., Y.Z und J.M.B.), die Snyder-Robinson Foundation Predoctoral Fellowship (zu cl), Dr. John T . Macdonald Foundation (CL), Verträge, Bewilligungen von der National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 und R56NS095893 (zu R.G.Z.), und von Taishan Gelehrter Project (Provinz Shandong, Volksrepublik China) (R.G.Z.).

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier beschriebene Protokoll lässt sich vehement und reproduzierbar quantitate Zelle biologische Prozesse visualisiert durch Fluoreszenz-basierte Bildgebung. Zusammenhang mit biologischen und technischen Einschränkungen müssen sorgfältig geprüft werden, um das experimentelle Design führen. Fluoreszierenden Marker der subzellulären Strukturen von Interesse, ob immunhistochemische, farbstoffbasierte oder genetisch ausgedrückt, müssen über Hintergrund von Morphologie und Intensität unterscheiden. FH/GAL4 -System...

Neurodegenerative Erkrankungen betreffen Millionen von Menschen jedes Jahr und die Häufigkeit nimmt mit einer alternden Bevölkerung1. Während jeder Neurodegenerative Erkrankung hat eine einzigartige Ätiologie, zeichnen Aggregation fehlgefaltete Proteine und Aufschlüsselung des proteostase Netzwerks gemeinsame pathologische viele dieser Krankheiten. Erläuterung, wie die Störung dieser grundlegenden und zusammenhängende Prozesse schief geht ist als Beitrag zu neuronalen Dysfunktion und Zelle Tod entscheidend für Verständnis neurodegenerativen Erkrankungen sowie therapeutische Interventionen führen. Fluoreszenz-basierte Bildgebung ermöglicht eine Untersuchung dieser komplexen und dynamischen Prozesse in Neuronen und trug wesentlich zum Verständnis der neuronalen Zelle Biologie. Analyse von eindringmittel tagged Proteinen ist anspruchsvoll, vor allem, wenn Experimente in Vivo, aufgrund der äußerst kompakten Gewebe, verschiedene Zelltypen und morphologischen Heterogenität durchgeführt werden. Manuell assistierte Quantifizierung ist erschwinglich und einfach, aber ist oft zeitaufwändig und unter menschlichen Vorspannung. Daher gibt es eine Notwendigkeit für Objektive, reproduzierbare und zugänglich Ansätze zur Extraktion von quantifizierbaren Daten aus bildgebenden Verfahren.
Wir haben einen einfachen und anpassungsfähigen Workflow mit Fidschi/ImageJ, eine leistungsfähige und frei zugänglichen Bildverarbeitungs-Software2,3, um quantitative Daten aus Fluoreszenz bildgebenden Studien in experimentellen Modellen der skizziert. Neurodegeneration mit Drosophila. Anhand dieses Protokolls Proteinaggregation und selbstverdauende Flussmittel Quantifizierung – zwei Handy-biologischen Funktionen, die für Neurodegenerative Krankheit-Pathologie von großer Bedeutung sind — wir bewiesen die Sensitivität und Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes. Analyse der Gewebekulturen tagged mutierte Huntingtin (Htt) Proteine in der Drosophila -Optik-Lappen ergab die Anzahl, Größe und Intensität von proteinaggregaten. Wir visualisieren einen Tandem fluoreszierende Reporter des selbstverdauende Flusses in Drosophila visuellen Systems, die verschiedenen Emission Signale je nach wohnzimmertaugliche Umwelt4anzeigt. Ratiometrischen basierende Analyse des Tandem Reporter für eine quantitative und umfassende Ansicht der Autophagie-Lysosomen Flux von Autophagosome Bildung, Reifung und Transport zu einer Verschlechterung in den Lysosomen zulässig, und zusätzlich hervorgehoben anfällig Fächer in neurodegenerativen Erkrankungen gestört. Wichtig ist, finden Sie in beiden Analysen halbautomatische Schwellwerte und Segmentierung Schritte in unser Protokoll zu minimieren unbewusste Vorurteile, Probenahme-Leistung zu erhöhen, und bieten einen Standard, um Vergleiche zwischen ähnlichen Studien zu erleichtern. Die einfache Workflow soll mächtige Fidschi/ImageJ Plugins (entwickelt von Informatikern, basierend auf mathematischen Algorithmen) zugänglicher Neurobiologen und die Life-Sciences-Gemeinschaft insgesamt.

<table><tbody><tr><td>SYLGARD(R) 184 Silikon-Elastomer-Kit</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>PF184250</td><td>Sezierschale</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm nicht TC-behandelt Easy-Grip Style Bakteriologische Petrischale</td><td>Corning</td><td>351008</td><td>Sezierschale</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Sezierwerkzeug</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>PBS-Lösung</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>PBS-Lösung</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat Monobasisch</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS-Lösung</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Wasch- und Antikörper-Inkubationslösung.&nbsp;</td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>VWR</td><td>10790-710</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Mikrozentrifugenröhrchen zur Fixierung (0,5 ml, blau)</td><td>VWR</td><td>89000-022</td><td>Fixierungs-, Wasch- und Antikörperinkubation.</td></tr><tr><td>Glatte und mattierte Mikro-Objektträger (25-fach; 75mm)</td><td>VWR</td><td>48312-004</td><td>Objektträger für die konfokale Bildgebung</td></tr><tr><td>Micro Cover Gläser, rechteckig (22 fach; 40mm)</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td>Objektträger für konfokale</td></tr><tr><td>Bildgebung Gummi Zement</td><td>Schleim</td><td>1051-A</td><td>Halterung</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>Montage</td></tr><tr><td>Scotch Magic 810 Unsichtbares Klebeband (19mm&mal; 25.4m)</td><td>3M Company</td><td>810</td><td>Montage</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>Antikörper-Inkubaton</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Nukleinsäure-Färbung. In entionisiertem Wasser auflösen, um eine 5 mg/ml-Stammlösung herzustellen, und bei -80 °C lagern. Auf eine Arbeitskonzentration von 10-20 μm verdünnen; g/mL in PBTx.</td></tr><tr><td>3,5X-90X Stereo-Zoom-Inspektion Industriemikroskop</td><td>AmScope</td><td>SM-1BNZ</td><td>Dissektions-Oszilloskop. Ausgestattet mit 6W LED Dual Schwanenhalsbeleuchtung</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.51u</td><td>Mit SCF_MPI_CBG Plugins (Version 1.1.2)</td></tr><tr><td>FV1000-IX81 Konfokal-Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Construct</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BL37749</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative zellbiologie der neurodegeneration in drosophila durch unvoreingenommene analyse der gewebekulturen tagged proteine mit imagej

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Mit der steigenden Verbreitung von neurodegenerativen Erkrankungen ist es zunehmend wichtig, die zugrunde liegende Pathophysiologie zu verstehen, die zu neuronalen Dysfunktion und Verlust führt. Fluoreszenz-imaging-Tools und Technologien ermöglichen beispiellose Analyse der subzellulären neurobiologischen Prozesse, doch gibt es noch eine Notwendigkeit für Objektive, reproduzierbare und zugänglich Ansätze zur Extraktion von quantifizierbaren Daten aus bildgebenden Verfahren . Wir haben einen einfachen und flexiblen Workflow um quantitative Daten von Fluoreszenz basierende bildgebenden Studien mit Drosophila Modelle der Neurodegeneration zu extrahieren entwickelt. Im einzelnen beschreiben wir einen easy-to-Follow, halbautomatischen Ansatz mit Fidschi/ImageJ um zwei zelluläre Prozesse zu analysieren: Erstens quantifizieren wir aggregierte Proteingehalt und Profil in der Drosophila -Optik-Lappen mit Leuchtstoff-Tags Mutant Huntingtin-Proteine; und zweitens bewerten wir Autophagie-Lysosomen Flussmittel in Drosophila visuellen Systems mit ratiometrischen basierende Quantifizierung der fluoreszierenden Tandem Reporter der Autophagie. Wichtig ist, enthält das Protokoll hier skizzierten einen semi-automatischen Segmentierung Schritt um sicherzustellen, dass alle fluoreszierende Strukturen analysiert werden, um Selektionsbias zu minimieren und Auflösung der subtilen Vergleiche zu erhöhen. Dieser Ansatz für die Analyse von anderen biologischen Zellstrukturen erweitert werden kann und Prozesse verwickelt in Neurodegeneration, wie proteinhaltige Puncta (Stress-Granulat und synaptischen komplexe), sowie Membrane-springen Fächer (Mitochondrien und Menschenhandel membranvesikel). Diese Methode bietet eine standardisierte, noch anpassbar Referenz für Bildanalyse und Quantifizierung, und könnte Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit über das Feld erleichtern, und letztlich mechanistisches Verständnis der Neurodegeneration verbessern.

Quantifizierung der Anzahl, Fläche und Intensität der Gewebekulturen tagged mutierten Htt-Aggregate in der Drosophila -Optik-Lappen
Fehlgefaltete Proteinaggregation in das zentrale Nervensystem eine Drosophila -Modell der Huntington-Krankheit, RFP-Tags Mutant untersuchen menschliche Htt mit einem nicht-pathologischen (FH-RFP-hHttQ15) oder pathologische Erweiterung ( UAS-RFP-hHttQ138) und Membran ...

Wir haben einen einfachen und anpassungsfähigen Workflow zur Fluoreszenz-Imaging-basierte zellbiologischen Studien Proteinaggregation und selbstverdauende Fluss in das zentrale Nervensystem der Drosophila -Modelle von quantitativen Daten entlocken entwickelt. Neurodegeneration.

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Wir haben diese Methode entwickelt, um quantitative Daten aus fluoreszenzbasierten Bildgebungsstudien zu extrahieren, um komplexe und dynamische zellbiologische Prozesse in Drosophila-Modellen der Neurodegeneration zu extrahieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist der anpassungsfähige, halbautomatische Bildanalyse-Workflow zur Minimierung von Selektionsverzerrungen, zur Maximierung der Abtastleistung und zur Erzielung von Reproduzierbarkeit im gesamten Feld. Dieser Ansatz kann für die Analyse anderer proteinhaltiger Punktzahlen und membrangebundener Kompartimente erweitert werden, die an der Neurodegeneration beteiligt sind, was letztendlich unser mechanistisches Verständnis von neurodegenerativen Erkrankungen verbessern wird.Um die Lamina während der Dissektion unter einem Stereomikroskop intakt zu halten, schieben Sie zwei Pinzetten unter die Netzhaut und reißen Sie vorsichtig durch die Mitte des Auges, um die Netzhaut zu entfernen. Halten Sie die Pinzette parallel zur Laminaoberfläche, um das verbleibende Netzhautgewebe, das an der Lamina haftet, zu entfernen. Präparieren Sie drei bis fünf Gehirne für jede Gruppe und übertragen Sie die Gehirne für 15 Minuten bei Raumtemperatur

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Der limitierende Faktor in der Verwendung der...

Single Drosophila Ommatidium Dissection und Imaging

Dieses Video zeigt die Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in genetisch veränderten Drosophila-Gehirnen. Das Gehirn wird fixiert, gewaschen und mit einem Antifading-Mittel behandelt, bevor es montiert wird. Die Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen und quantifiziert, um die Übertragung mutierter Proteinaggregate zu beobachten.

Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in gentechnisch veränderten Drosophila-Gehirnen

Drosophila ist weithin als ein Modellsystem verwendet , Neurodegeneration zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, mit dem Degeneration, wie durch Vakuolenbildung im Gehirn bestimmt wird, kann quantifiziert werden. Es minimiert auch die Auswirkungen aufgrund der Versuchsdurchführung durch die Verarbeitung und sectioning Kontroll- und Versuchs Fliegen wie eine Probe.

Massen Histologie zu Quantifizieren Neurodegenerative Erkrankungen in<em&gt; Drosophila</em

Hier zeigen wir , wie die Anzahl und die räumliche Verteilung der synaptischen aktiven Zonen in Drosophila melanogaster Photorezeptoren zu quantifizieren, markiert mit einem genetisch molekularen Marker codiert und deren Modulation nach längerer Einwirkung von Licht.

Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Beweise sammeln, unterstützt die Idee, dass Pathogene Protein-Aggregate im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen verteilt zwischen den Zellen mit Prion-ähnliche Eigenschaften. Hier beschreiben wir eine Methode, die ermöglicht die Visualisierung von Zelle zu Zelle ausbreiten von Prion-ähnlichen Aggregaten im Modellorganismus Drosophila Melanogaster.

Überwachung von Zelle zu Zelle Übertragung von Prion-wie Protein-Aggregate in Drosophila Melanogaster

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, das dorsale Längsmuskelgewebe (DLM) zu sezieren, um die strukturelle Integrität von NEUROmuskulären DLM-Knoten (NMJs) in neurodegenerativen Krankheitsmodellen mit Drosophila melanogasterzu bewerten.

Visualisierung der synaptischen Degeneration bei erwachsenen Drosophila in Verbindung mit Neurodegeneration

Hier werden nicht-invasive Methoden zur Lokalisation von Photorezeptormembranproteinen und zur Beurteilung der Netzhautdegeneration im Drosophila-Facettenauge mittels eGFP-Fluoreszenz beschrieben.

Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen

Diese Studie stellt ein vereinfachtes Protokoll für die Gewebeaufbereitung vor, das Enthauptung, Fixierung, Kryosektion, Fluoreszenzfärbung, Immunfärbung und Bildgebung umfasst und auf konfokale und Multiphotonen-Bildgebung erweitert werden kann. Die Methode behält eine Wirksamkeit bei, die mit komplexen Dissektionen vergleichbar ist, ohne dass fortgeschrittene motorische Fähigkeiten erforderlich sind. Die quantitative Bildanalyse bietet ein umfangreiches Untersuchungspotenzial.

Direkte Kryosektion von Drosophila-Köpfen zur verbesserten Fluoreszenzfärbung und Immunfärbung des Gehirns

Wir haben ein Computer-Programm, um neuronale Morphologie Analyse entwickelt. In Kombination mit zwei bestehenden Open-Source-Analyse-Tools, führt unser Programm Sholl Analyse und bestimmt die Anzahl der Neuriten, Verzweigungspunkte, und Neuriten Tipps. Die Analysen werden, so dass lokale Änderungen in Neuriten Morphologie beobachtet werden durchgeführt.

Automatisierte Sholl Analyse digitalisierter neuronale Morphologie bei Multiple Scales

Lernen Sie eine halbautomatisierte Bildanalysemethode zur quantitativen Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila mit ImageJ. Diese Technik minimiert Selektionsbias und maximiert die Reproduzierbarkeit bei der Proteinaggregatquantifizierung.

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ (Video) | JoVE Journal

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

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