Name: Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Lernen Sie einen optischen Test zur Analyse des synaptischen Vesikel-Recyclings in kultivierten Neuronen. Diese Methode nutzt Transfektion und Immunfluoreszenz zur Untersuchung präsynaptischer Proteine.

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Wir danken Irmgard Weiss für kompetente technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der DFG über des Exzellenzclusters für Mikroskopie im Nanometerbereich und molekulare Physiologie des Gehirns (CNMPB, B1-7, T.D) unterstützt.

Keine Studien mit lebenden Tieren wurden durchgeführt. Experimente mit euthanasierten Tiere, um die Zelle zu erhalten, die Kulturen von den lokalen Tierschutz Behörden (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) unter der Zustimmung genehmigt wurden Nummer T10/30. Die Experimente wurden mit der genehmigten Protokolle geführt.
1. primäre Hippocampal Zellkultur
<ol><li>Bereiten Sie die dissoziierten Zellkultur der Ratte Hippocampus am embryonalen Tag 1916,17. Die Zellen auf 12 mm Deckgläsern beschichtet mit Polyethyleneimine (PEI) in 24 Wohlen Teller bei einer Dichte von 50.000-60.000 Zellen/Well-Platte. Überprüfen Sie die Dichte mit einer Zelle zählen Industrie- und Phase Kontrast-Optik.</li>
	<li>Kultur der Neuronen für 3 Tage (Tag in Vitro (DIV) 3) in einer 24-Well-Platte im Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
	<li>Bewerten Sie die Deckgläsern für Indikatoren für die Zellgesundheit mit übertragenen Lichtmikroskopie (z. B. Phase Kontrast-Optik bei einer Vergrößerung von 10-20 X). Überprüfen Sie, ob die folgenden Indikatoren für eine gute Gesundheit: eine klare Phase Kontrast Halo, Neuriten ohne Perlen Strukturen und keine Soma clustering oder Neuriten zu bündeln.</li>
</ol>(2) transfection
Hinweis: Das folgende Protokoll bezieht sich auf eine Doppel-Transfektion für 3 Brunnen. Allerdings funktioniert das Protokoll am besten Beträge für 4 Brunnen ausreichend vorbereitet sind.
<ol><li>In einen Erlenmeyerkolben 500 mL Transfektion Puffer (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM Na2HPO4, 15 mM Glukose, 42 mM HEPES) vorzubereiten.<ol>
<li>8,0 g NaCl, 0,37 g KCl 0,095 g Na2HPO4, 1,35 g Glukose und 5,0 g HEPES in 400 mL destilliertem Wasser in einen Erlenmeyerkolben auflösen.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 6,95 mit 1 M NaOH mit dem pH-Meter.</li>
		<li>Stellen Sie die Lautstärke mit destilliertem Wasser auf 500 mL, und überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Meter.</li>
		<li>Machen Sie 20-30 mL-aliquoten Transfektion Puffer mit den folgenden pH-Werten durch pipettieren 1 M NaOH auf die Transfektion Puffer: 6.96 6,97, 6,98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7,05, 7.06, 7,07, 7.08, 7.09, 7.11. Hinweis: Der pH-Wert des Puffers Transfektion ist entscheidend für die Wirksamkeit der Transfektion.</li>
		<li>Um die Transfektion Puffer führt die höchste Zahl von transfizierten Zellen zu testen, testen Sie jede pH-Wert von 6.96 bis 7.11. Verwenden Sie die Transfektion in 2.2-2.11 und eine validierte Plasmid mit dem Ausdruck GFP beschriebene Methode. Bestimmen Sie die Anzahl von transfizierten Zellen pro Deckglas für jeden Transfektion Puffer pH Wert zu beurteilen welche Puffer am besten funktioniert.</li>
		<li>Aliquoten der Puffer mit dem höchsten Wirkungsgrad der Transfektion in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen Einfrieren und lagern die Rohre bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wärmen Sie reduzierte Serum Medium, Zellkulturmedium und destilliertem Wasser auf 37 ° C im Wasserbad vor.</li>
	<li>Bereiten Sie die Transfektion Mischung in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Arbeiten Sie unter der Laminar-Flow-Haube, sterile Arbeitsbedingungen zu gewährleisten.<ol>
<li>Mix 7,5 µL 2 M-Kalzium-Chlorid mit 4 µg pro Endotoxin-freie DNA (Synaptophysin-mOrange und mGFP/GLP-Rogdi). Fügen Sie Wasser zu einem Gesamtvolumen von 60 mL in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu erreichen.</li>
		<li>60 mL Transfektion Puffer zur Mischung hinzugeben. Um die besten Ergebnisse zu erhalten, fügen Sie die Transfektion Puffer tropfenweise beim Schütteln der DNA-Mix vorsichtig auf den Wirbel.</li>
		<li>20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Vermeiden Sie schütteln die Inkubation Röhre während der Inkubationszeit indem man das Rohr neben der Laminar-Flow-Haube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie unter der Haube Laminar-Flow Zellkulturmedium ("konditionierten Medium") aus den Brunnen mit einer 1000 mL pipettieren zu und speichern Sie es in einem separaten Behälter im Inkubator.</li>
	<li>Jedes gut 500 mL reduzierte Serum Medium hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 bis 20-minütigen Inkubationszeit (Schritt 2.3.3) vorbei ist.</li>
	<li>Geben Sie 30 mL Transfektion Mischung in jede Vertiefung durch pipettieren einige Tropfen hinzu. Entsorgen Sie die Rückstände an der Unterseite des Rohres.</li>
	<li>Nachdem alle Brunnen mit Transfektion Mix geliefert wurden, schütteln Sie vorsichtig 24-Well-Platte um die Verteilung der Transfektion Mischung in das Medium zu gewährleisten.</li>
	<li>60 Minuten bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren Sie Brunnen.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie den Transfektion Mix und waschen Sie es dreimal mit Zellkulturmedium. Fügen Sie 1 mL Zellkulturmedium in jede Vertiefung und inkubieren sie für 30 Sekunden bei RT. entfernen Sie 750 mL des Mediums und fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu. Wiederholen Sie dies dreimal. Hinweis: Die Waschschritt ist von entscheidender Bedeutung. Halten Sie die Zeit, die jeweils gut kein Medium im Mindestfall (i.e., entfernen und Ersetzen von Brunnen von Brunnen) und fügen Sie das waschmedium sanft.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie der Zellkulturmedium und 450 mL des konditionierten Medium gut-durch-Brunnens.</li>
	<li>Lassen Sie die Reifen in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 DIV 10 Neuronen.</li>
</ol>(3) Stimulation und Syt1 Aufnahme
Hinweis: Das folgende Protokoll gilt die Aufnahme für 3 Brunnen. Passen Sie für die Depolarisation beliebig vieler Brunnen die Mengen entsprechend an.
<ol><li>50 mL 10 X Depolarisation Puffer (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM Glukose, 200 mM HEPES, pH 7,4) in einen Erlenmeyerkolben vorzubereiten. Hinweis: Depolarisation Puffer kann für mehrere Wochen bei 4 ° C gehalten werden. Wenn eine Lösung nicht depolarisierende auch verwendet wird, bereiten Sie ein 10 X Tyrode Lösung bestehend aus 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM Glukose, 200 mM HEPES pH 7.4 um vergleichen Stimulation induzierte recycling mit spontanen das Recycling. Fügen Sie nach Verdünnung auf 1 X 1 µM von Tetrodotoxin vor Gebrauch, Aktionspotential Generation zu blockieren.<ol>
<li>1,87 g NaCl, KCl, MgCl2-6 H20 0,1 g, 0,15 g CaCl2-2 H2O und 3,0 g Glukose-1 H2O und 2,38 g HEPES in 50 mL destilliertem Wasser in einen Erlenmeyerkolben 2,61 g auflösen. Passen Sie den pH mit NaOH und Sterilfilter die Lösung. Verdünnen Sie den Puffer 01:10 in destilliertem Wasser, 1 X Konzentration zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixierung nach Stimulation 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer (pH 7,4) vorbereiten.<ol>
<li>Für 500 mL 4 % PFA in 1 X PBS, lösen Sie 20 g Paraformaldehyd in 450 mL destilliertem H2O. Hinweis: Die Heizlösung können beschleunigen, auflösen, aber nicht die Lösung über 70 ° C erhitzen, wie die PFA zerfallen kann. Achtung: PFA ist toxisch, potentiell krebserzeugend und teratogen. Tragen Sie Handschuhe bei der Arbeit mit PFA, arbeiten unter dem Abzug und Verschlucken zu vermeiden.</li>
		<li>Lassen Sie die Lösung abkühlen, RT und 50 mL 10 X PBS-Stammlösung. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit NaOH/HCl mit dem pH-Meter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorwärmen von 1 x Depolarisation Puffer 600 mL und 10 mL Zellkulturmedium auf 37 ° C im Wasserbad.</li>
	<li>1 x Depolarisation Puffer und Vortex 1 mL der Maus Anti-Syt1 Antikörper (Klon 604.2) für 10 Sekunden hinzufügen.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie der Zellkulturmedium aus den Zellen. Fügen Sie 200 mL des Depolarisation-Antikörper-Mix, jeweils gut und 5 Minuten bei 37 ° C und 5 % CO2 im Inkubator inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie den Depolarisation-Antikörper-Mix und waschen Sie es dreimal mit Zellkulturmedium. Fügen Sie 1 mL Zellkulturmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 30 Sekunden bei RT. entfernen Sie 750 mL des Mediums und fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu. Wiederholen Sie dreimal.</li>
	<li>Entfernen und verwerfen die Zellkulturmedium und 300 mL 4 % PFA mit 1 X PBS-Puffer. 20 Minuten bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Drei Mal für jeweils 5 Minuten mit 1 X PBS waschen. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>(4) Immunocytochemistry
<ol><li>50 mL blockierende Puffer vorzubereiten. Hinweis: Puffer blockiert kann bei-20 ° C mehrere Monate aufbewahrt werden.<ol>
<li>2,5 g Saccharose und 1 g Rinderserumalbumin (BSA) in 5 mL 10 X PBS-Stammlösung auflösen. 1,5 mL Waschmittel Stammlösung 10 % zugeben. Rühren Sie die Lösung, bis alle Komponenten ordnungsgemäß aufgelöst haben und fügen Sie destilliertes H2O, bis hin zu einem Endvolumen von 50 mL. Aliquoten die Lösung und die Aliquote zur Aufbewahrung einfrieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdünnen Sie die sekundären, Fluorophor-gekoppelten Antikörper (gegen die primäre Syt1-Antikörper-Arten) in 200 mL blockierende Puffer in jede Vertiefung bei einer Verdünnung von 1: 1000.</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie 1 X PBS aus gut mit jeweils einem deckgläschen.</li>
	<li>200 mL Puffer-Antikörper Mischung in jede Vertiefung zu blockieren und 60 Minuten bei RT inkubieren Achtung: Da der Sekundärantikörper lichtempfindlich sind, müssen alle Schritte vorwärts in der Dunkelheit durchgeführt werden.</li>
	<li>Waschen Sie nach der Inkubation der Zellen drei Mal für 5 Minuten mit 1 mL 1 X PBS.</li>
	<li>Einbetten der Deckgläsern auf Objektträger mit dem Einbetten von Medium.<ol>
<li>Tropfen Sie einen 7 mL Medium auf dem Objektträger einbetten. Entfernen Sie das Deckglas aus 24-Well-Platte mit einer Spritze anheben und mit der Pinzette greifen. Achtung: Zellen an der Oberfläche das Deckglas sind leicht beschädigt, so dass Zange mit Sorgfalt behandelt werden muss.</li>
		<li>Tauchen Sie das Deckglas in destilliertem Wasser auf die PBS zu entfernen und durch berühren einer Kante auf einem weichen Tuch trocknen.</li>
		<li>Drehen Sie das Deckglas auf das Einbetten von mittleren Tröpfchen, so dass die Oberfläche der Zellen tragen den Mikroskop-Objektträger, damit Einbettung der Zellen in das einbettende Medium steht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Folien unter der Haube für 1-2 Std. trocknen lassen (decken, um Lichteinfall zu vermeiden) und speichern sie in einer Mikroskop-Folie-Box bei 4 ° C. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>(5) mikroskopische Analyse
<ol><li>Nachdem die Deckgläsern trocken, legen Sie sie unter dem Mikroskop Objektive und Kamera.</li>
	<li>Passen Sie die Belichtungszeit für jeden Kanal, sodass einige Pixel überbelichtet sind, um maximale Verteilung der Grauwerte zu gewährleisten. Hinweis: Während die Belichtungszeit zwischen den Kanälen variieren kann, sollte es für einen Kanal zur Vergleichbarkeit zwischen den Deckgläsern konstant sein.</li>
	<li>Multi-Channel-Bilder für 10 Regionen von Interesse (ROIs) pro Deckglas zu erwerben. Überprüfen Sie, dass der ROI enthält axonalen Prozesse von transfizierten Neuron durch Prüfung GLP-Fluoreszenz, die punktförmige sein sollte.</li>
</ol>6. statistische Analyse
<ol><li>Exportieren Sie die Bilder als .tif-Dateien. Laden Sie die Bilder in OpenView18 , indem Sie auf Datei | Last-Image-Datei.</li>
	<li>Wählen Sie das Synaptophysin-mOrange Bild als Kanal 1, Rogdi-GLP/mGFP Bild als 2-Kanal und Alexa647 fluoreszenzbild als Kanal 3.</li>
	<li>Schwelle des ROIs.<ol>
<li>Klicken Sie auf Analyse | Ort-Bereich über Puncta. Wählen Sie Schwelle und Delta Intensität Werte, so dass bei der Sichtprüfung, diffuse Fluoreszenz ausgeschlossen wird, so dass nur punktförmige Signale in das Bild des Kanals 1 (für Synaptophysin-mOrange Fluoreszenz). Halten Sie die gleiche Schwelle für alle Bilder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie diese ROIs auf den entsprechenden Kanal 2 (GLP-Rogdi/mGFP Fluoreszenz) und 3 (Syt1-Fluoreszenz) der einzelnen Deckglas Bereiche durch Klicken auf jetzt ausführen. Hinweis: Der ROIs sollte nur berücksichtigt werden, wenn die Zelle doppelt transfiziert. Bei dieser Methode sollte mOrange und GFP-Fluoreszenz deutlich sichtbar sein.</li>
	<li>Sichern Sie die Daten in die Analyse-Log-Editor, indem Sie auf Log-Daten.</li>
	<li>Öffnen Sie den Analyse-Log-Editor unter der Registerkarte " Windows " und kopieren Sie die Werte für jeden Kanal. Die Werte für die separate Kanäle in ein Arbeitsblatt einfügen.</li>
	<li>Bestimmen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität des Syt1-Kanals Rois in beide Transfektion Bedingungen (GFP-Rogdi und mGFP).</li>
	<li>Gelten Sie entsprechende statistische Tests wie der Student t-Test signifikante Unterschiede feststellen.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Es gibt drei Tests routinemäßig zur synaptischen Vesikel (SV) recycling zu studieren. Die ersten beiden umfassen die Verwendung von einem) fluoreszierende Styryl Farbstoffe wie FM1-43 (die in Membranen zu integrieren, sind in den Organellen während Endozytose aufgenommen und werden nach Exozytose freigesetzt); und b) eindringmittel getaggt rekombinante SV-Proteine (die bei Überexpression, in die proteinhaltige recycling Maschinen integrieren). Wenn die angehängte Fluorophore ihre Fluoreszenz je nach pH-Wert ändern, diene...

Studium der synaptischen Vesikel recycling ist wichtig bei der Bestimmung, wie präsynaptischen Eigenschaften, während Synaptische Plastizität oder in Reaktion auf die Störung der synaptischen Funktion verändern. Antikörper-Aufnahme bietet Studium Synaptotagmin-1 (Syt1) eine Methode zur Messung der Menge von recycling-SV. Syt1 ist ein SV-assoziierten Protein, das wirkt wie ein Ca2 + Sensor und ist notwendig für steht Freisetzung von Neurotransmitter-1,-2. Es ist ein transmembranen Protein mit einer C-terminalen cytoplasmatischen Domäne außerhalb der SV und eine N-terminale luminalen Domäne innerhalb der SV3. Bei Exozytose wird das externe Medium die luminalen Domäne der Syt1 ausgesetzt. Um diese externen Medium fügen wir Antikörper gegen die cytoplasmatischen Domäne, die während der Endozytose internalisiert wird. Diese Antikörper können man entweder mit Fluorophore oder Immunostained mit Sekundärantikörper4,5,6,7Pre konjugiert. Der Fluoreszenzintensität von der daraus resultierenden Immunosignal ist proportional zur Menge des SV recycling. Dieser Ansatz lässt sich bestimmen, konstitutiven und Depolarisation-induzierte SV recycling6,8.
Syt1 Aufnahme Assays können nach Virus-vermittelte Gentransfer auf praktisch alle Zellen in der Schale oder spärlich Transfektion von einer kleinen Anzahl von Zellen durchgeführt werden. Unsere Methode verbindet den Assay mit spärlich Doppel Transfektion von primären hippocampal Neuronen mit Calcium-Phosphat-9. Wir verwenden eine rekombinante Marker Protein bekannt zu akkumulieren bei Presynapses, eindringmittel tagged Synaptophysin zu lokalisieren präsynaptischen Klemmen und overexpress unser Protein des Interesses, Rogdi. Dies ermöglicht es uns testen ob Rogdi Ziele funktionale Synapsen und wirkt sich auf SV recycling. Das Gen Kodierung Rogdi wurde ursprünglich in einem Bildschirm für Drosophila-Mutanten zeichnet sich durch Gedächtnisstörungen10identifiziert. Mutationen im Rogdi-Gen verursachen beim Menschen eine seltene und verheerende Krankheit namens Kohlschütter-Tönz-Syndrom. Patienten leiden unter Zahnschmelz Fehlbildungen, sind Epilepsie und psychomotorische Verzögerungen; jedoch blieb die subzelluläre Lokalisation des genprodukts schwer fassbaren11. Somit bot die Syt1 Aufnahme Assay wichtige Beweismittel für die Lokalisierung von GFP-markierten Rogdi auf funktionale Synapsen9.
Diese Aufnahme-Technik hat mehrere Vorteile. Erstens kann SV recycling sowohl in Echtzeit durchführen live imaging7,12, und nach Fixierung6,9 beobachtet werden durch Messung der Fluoreszenzintensität des Syt1 Fluoreszenz Label. Darüber hinaus wurden mehrere Syt1 Antikörper Varianten entwickelt. Es gibt unmarkierten, die mit einem sekundären Antikörper nach einem standard Immunostaining Protokoll nach Fixierung beschriftet werden können, und Pre-konjugierten Varianten mit einem Fluoreszenz-Label bereits angebracht. Schließlich ist die Antikörper-basierten Fluoreszenz vorteilhaft durch die große Auswahl an handelsüblichen Sekundär- oder konjugierte Farbstoffe, die verwendet werden können.
Bei der Festsetzung und Immunostaining Neuronen, es ist auch möglich, für zusätzliche Proteine zu beflecken und ns1 Analysen durchführen. Dies kann helfen, festzustellen, wo sie sich in Bezug auf recycling SVs befinden. Die Intensität der Fluoreszenz-Label ist direktes Maß für die Höhe der SV-recycling. Darüber hinaus kennzeichnen die Antikörper selektiv Syt1-haltigen Strukturen, was hohe Spezifität und wenig Hintergrund-Fluoreszenz-4. Verschiedenen Protokolle können auch verwendet werden, z. B. Depolarisation Puffer oder elektrische Stimulation Protokolle9,12,13,14. Jedoch kann basalen SV recycling ohne Stimulierung der neuronalen Kulturen15gemessen werden.
Unsere Methode befasst sich speziell mit Syt1 Antikörper Aufnahme in Doppel-transfizierten Neuronen mit Sekundärantikörper Immunolabeling nach der Fixierung. Allerdings verweisen wir auf alle routinemäßig verwendeten Varianten des Tests in unserer Diskussion um Zuschauer geben die Möglichkeit, das Protokoll auf spezifischen Bedürfnisse anzupassen.

<table><tbody><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030-50g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306-100g</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Invitrogen</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>8.03456.0100</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti Maus Alexa 647</td><td>Jackson-Immunoresearch</td><td>715605151</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24 Well</td><td>Fisher Scientific</td><td>087721H</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen (50 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td>227261</tr><tr><td>FBS superior</td><td>BiochromAG</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Merck</td><td>1.083.421.000</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell 150 (Inkubator)</td><td>ThermoElectron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500g</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Honeywell</td><td>M0250-500g</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>10144633CF</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mowiol4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioFroxx</td><td>1394KG001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BioFroxx</td><td>5155KG001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OpenView Experiment Analysis Application</td><td>Kostenlose Software, siehe Kommentare</td><td></td><td>geschrieben von Noam E. Ziv, Technion &ndash; Israel Institute of Technology, Haifa, Israel</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Roche</td><td>11666789001</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Sicherheitshaube</td><td>ThermoElectron</td><td></td><td>Serien-Nr. 40649111</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>neoFroxx</td><td>1104kg001</td><td></td></tr><tr><td>Synaptotagmin1 Synaptische</td><td>Systeme</td><td>105311</td><td>Maus monoklonal; Klon 604.2</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1.086.031.000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3&nbsp;</td><td>IKA</td><td>3340001</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>GFL</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Observer. Z1&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein optischer test zum synaptischen vesicle recycling in kultivierten neuronen überexprimiert präsynaptischen proteine

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Bei aktiven präsynaptischen nervenausgänge unterziehen synaptischen Vesikel Zyklen von Exo und Endozytose. Beim recycling, der luminalen Domänen des SV transmembranen Proteine an der Zelloberfläche ausgesetzt. Eines dieser Proteine ist Synaptotagmin-1 (Syt1). Ein Antikörper gegen der luminalen Domäne der Syt1, einmal hinzugefügt, um dem Kulturmedium wird während des Exo-endocytotic Zyklus aufgegriffen. Diese Aufnahme ist proportional zur Menge des SV recycling und durch Immunfluoreszenz quantifiziert werden kann. Hier verbinden wir Syt1 Antikörper Aufnahme mit doppelten Transfektion von kultivierten hippocampal Neuronen. Dies ermöglicht uns (1) lokalisieren präsynaptischen Websites basierend auf Ausdruck der rekombinanten präsynaptischen Marker Synaptophysin, (2) bestimmen ihre Funktionalität mit Syt1 Aufnahme und (3) charakterisieren das Zielen und Wirkungen eines Proteins des Interesses, GFP-Rogdi.

Ein erwartetes Ergebnis dieses Ansatzes ist ca. 50 Doppel-transfizierten Neuronen pro Deckglas bei einer Dichte von 50.000 Neuronen pro Bohrloch Auffinden. Das Axon jedes Neuron wird voraussichtlich mehrere Hotspots fluoreszent markiert Synaptophysin Akkumulation, Angabe Cluster OfSVs zeigen. Funktionale präsynaptischen Standorten colocalizes das rekombinante Synaptophysin Signal mit punktförmige Syt1 Fluoreszenz. Verwenden doppelte Transfektion, ist GLP-Rogdi als das Protein des Interess...

Wir beschreiben einen optischen Test zur synaptischen Vesikel (SV) recycling in kultivierten Neuronen. Kombinieren dieses Protokoll mit doppelten Transfektion einer präsynaptischen Marker und Protein des Interesses zum Ausdruck bringen kann wir finden präsynaptischen Websites, deren synaptischen Vesikel Recyclingkapazität, und bestimmen die Rolle des Proteins des Interesses.

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sehr einfach ist, nur Standardausrüstung erfordert und vom Hauptvorteil der Antikörper profitiert, nämlich ihrer Spezifität. Das Protokoll wurde ursprünglich von Michela Matteoli und Kollegen eingeführt und hat sich als sehr effektiv erwiesen. Ich habe damit getestet, ob ein bestimmtes Protein Cordocti an aktive Synapsen gebunden ist.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie primäre Hippocampuszellen auf Deckgläsern in einer 24-Well-Platte für drei Tage kultivieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Das serumreduzierte Medium, das Zellkulturmedium und das destillierte Wasser im Wasserbad auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Um sterile Arbeitsbedingungen zu gewährleisten, wird die Transfektionsmischung unter der Laminar-Flow-Haube in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt.Mischen Sie zunächst 7,5 Mikroliter zweimolares Calciumchlorid mit vier Mikrogramm jeder endotoxinfreien DNA. Fügen Sie Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 60 Mikrolitern in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu erreichen. Fügen Sie nun 60 Mikroliter Transfektionspuffer hinzu.Um die besten Ergebnisse zu erzielen, fügen Sie den Transfektionspuffer tropfenweise hinzu, während Sie das DNA-Gemisch vorsichtig auf dem Wirbel schütteln. Inkubieren Sie die resultierende Transfektionsmischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Vermeiden Sie es, das Röhrchen während der Inkubationszeit zu schütteln.Entnehmen Sie unter der Laminar-Flow-Haube das Zellkulturmedium mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette aus den Vertiefungen, lagern Sie es in einem separaten Behälter und geben Sie sofort 500 Mikroliter reduziertes Serummedium in jede Vertiefung. Lagern Sie das konditionierte Medium im Inkubator. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, bis die 20-minütige Inkubationszeit für die Transfektionsmischung abgelaufen ist.Geben Sie dann 30 Mikroliter Transfektionsmischung in jede Vertiefung, indem Sie mehrere Tropfen pipettieren. Entsorgen Sie die Rückstände am Boden des Röhrchens. Nachdem alle Vertiefungen mit der Transfektionsmischung versorgt wurden, schütteln Sie die 24-Well-Platte vorsichtig, um die Verteilung der Transfektionsmischung im Medium sicherzustellen.Inkubieren Sie nun die Vertiefungen für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% CO2. Nach der Inkubation die Transfektionsmischung entfernen, entsorgen und die Zellen dreimal mit Zellkulturmedium waschen. Der Waschschritt ist entscheidend.Minimieren Sie die Zeit, in der jede Vertiefung kein Medium hat, indem Sie Vertiefung für Vertiefung entfernen und ersetzen. Achten Sie auch darauf, das Medium vorsichtig hinzuzufügen. Um die Zellen zu waschen, geben Sie je einen Milliliter Zellkulturmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur.Entfernen Sie dann 750 Mikroliter Medium und fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu. Nachdem Sie diesen Vorgang dreimal wiederholt haben, entfernen und verwerfen Sie das Zellkulturmedium und fügen Sie 450 Mikroliter des konditionierten Mediums Welle für Well hinzu. Lassen Sie nun die Neuronen im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5%CO2 zu DIV 10 reifen.600 Mikroliter 1X Depolarisationspuffer und 10 Milliliter Zellkulturmedium im Wasserbad auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Geben Sie einen Mikroliter Maus-Anti-Syt1-Antikörper in den 1X-Depolarisationspuffer und wirbeln Sie ihn 10 Sekunden lang ein. Nachdem Sie das Zellkulturmedium aus den Zellen entfernt und verworfen haben, geben Sie 200 Mikroliter der Depolarisations-Antikörpermischung in jede Vertiefung.Inkubieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 im Inkubator. Entfernen und entsorgen Sie die Depolarisations-Antikörpermischung und waschen Sie die Zellen dreimal mit Zellkulturmedium. Geben Sie einen Milliliter Zellkulturmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur.Entfernen Sie dann 750 Mikroliter Medium und fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. Entfernen und entsorgen Sie anschließend das Zellkulturmedium und fügen Sie 300 Mikroliter 4%PFA in 1X PBS hinzu.Zum Schluss 20 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren, bevor Sie dreimal für jeweils fünf Minuten mit 1X PBS waschen. Verdünnen Sie den sekundären Fluorophor-gekoppelten Antikörper in 200 Mikrolitern Blockierungspuffer für jede Vertiefung in einer Verdünnung von eins bis 1.000. Entfernen und entsorgen Sie das 1X PBS aus jeder Vertiefung, die Deckgläser mit den kultivierten Neuronen enthält.Geben Sie 200 Mikroliter Blockierungspuffer-Antikörpermischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal fünf Minuten lang mit einem Milliliter 1X PBS. Geben Sie anschließend einen sieben Mikroliter großen Tropfen Einbettungsmedium auf den Objektträger.Entfernen Sie das Deckglas von der 24-Well-Platte, indem Sie es mit einer Kanüle anheben und mit einer Pinzette greifen. Tauchen Sie das Deckglas in destilliertes Wasser, um das PBS zu entfernen, und trocknen Sie es vorsichtig, indem Sie eine Kante mit einem weichen Tuch berühren. Drehen Sie das Deckglas auf das Tröpfchen des Einbettmediums, so dass die Oberfläche, die die Zellen trägt, dem Objektträger zugewandt ist, wodurch die Zellen in das Einbettungsmedium eingebettet werden.Lassen Sie die Objektträger ein bis zwei Stunden unter der Haube trocknen und decken Sie sie ab, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Lagern Sie die getrockneten Objektträger in einer Objektträgerbox bei vier Grad Celsius. Nach der Immunmarkierung des Syt1-Antikörpers mit einem fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper wird schließlich das Ausmaß der Syt1-Aufnahme anhand des Immunsignals quantifiziert.Die punktuelle Immunfluoreszenz zeigt Stellen der Syt1-Aufnahme im Sichtfeld an. Diese Stellen enthalten also synaptische Vesikel, die während des Experiments recycelt wurden. Die Synaptophysin-mOrange-Fluoreszenz zeigt eine Anhäufung von synaptischen Vesikeln im Axon eines transfizierten Neurons an.Die GFP-Rogdi-Fluoreszenz deutet auf Ansammlungen von Rogdi im Axon des transfizierten Neurons hin. Dieser Teil des Experiments zeigt eine ausgedehnte Kolokalisation von GFP-Rogdi und Synaptophysin-mOrange, was darauf hindeutet, dass sich GFP-Rogdi an präsynaptischen Stellen innerhalb des Axons ansammelt. Das Overlay zeigt, welche der Koakkumulationen von GFP-Rogdi und Synaptophysin-mOrange mit den Stellen der Syt1-Antikörperaufnahme kolokalisieren.Die durch Pfeile markierten Stellen stellen Ansammlungen von rekombinantem Rogdi und rekombinantem Synaptophysin an funktionellen Synapsen dar. Das Protokoll stellt einen technisch einfachen Weg dar, um das Ausmaß des synaptischen Restrecyclings zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Molekular- und Zellforschung zu beantworten, z. B. wo präsynaptische Nervenendigungen in einem Axon eines bestimmten Neurons zugeordnet sind und ob sich an diesen Enden ein rekombinantes oder endogenes Protein von Interesse ansammelt.Nach ihrer Entwicklung wurde diese Technik auf vielfältige Weise eingesetzt, um das synaptische Vesikelrecycling in präsynaptischen Terminals zu überwachen. Zum Beispiel kann es verwendet werden, um das synaptische Vesikelrecycling in Neuronen nach Überexpression auf adaptiven Proteinen sowie in Neuronen zu bestimmen, die von Tieren oder aus Stammzellen gewonnen wurden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt, wie zu Synapse Anzahl sowohl in dissoziierten neuronalen Kultur und in Hirnschnitten mittels Immunzytochemie quantifizieren. Mit Fach-spezifische Antikörper, label wir präsynaptischen Terminals sowie Standorte der postsynaptischen Spezialisierung. Wir definieren Synapsen als Punkte der Kolokalisation zwischen den Signalen, die von dieser Marker erzeugt.

Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify

Dieser Bericht zeigt eine Technik zur mechanischen Isolation von einzelnen Neuronen lebensfähig halten befestigt präsynaptischen boutons. Vibrodissociated Neuronen haben die Vorteile der schnellen Produktion, ausgezeichnete pharmakologische Kontrolle und verbesserten Raum-Klemme, ohne Einfluss von benachbarten Zellen. Diese Methode kann für die Bildgebung der synaptischen Elementen und Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet werden.

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Vorbereitung kultivierter Neuronen für die optische Analyse von recycelten synaptischen Vesikeln

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DetectSyn ist ein unvoreingenommener, schneller fluoreszierender Assay, der Veränderungen der relativen Synapsenzahl (prä- und postsynaptisches Engagement) über Behandlungen oder Krankheitszustände hinweg misst. Diese Technik verwendet eine Proximity-Ligationstechnik, die sowohl in kultivierten Neuronen als auch in festem Gewebe eingesetzt werden kann.

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