Name: Aufrechterhaltung der biologischen Kulturen und Messung der Genexpression in Aphis Nerii: Non-Modellsystem für Pflanzen-Insekten-Interaktionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung von Aphis nerii und die Messung der Genexpression für Pflanzen-Insekten-Interaktionen. Diese kostengünstigen Methoden ermöglichen Forschern molekulare Analysen in vivo.

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Wir möchten danken Michelle Moon (Vanderbilt University) für Unterstützung mit der Fotografie. Vanderbilt University zur Verfügung gestellt ist, PA und SSLB von DGE-1445197 unterstützt.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Es ist lang erkannt worden, dass die Aposematic A. Nerii Einblicke in die Muster und Mechanismen der Resistenz gegen Pflanze Verteidigung und vor allem chemische Bindung18,37bieten kann. Eine Reihe von genomischer Ressourcen sind vor kurzem entstanden, A. Nerii10, bieten neue Möglichkeiten für ökologische und funktionelle Genomik Studien, die A. Nerii als Modell verwenden. Wir skizzieren die grundlegenden Protoko...

Blattläuse sind kleine, hemimetabolous Insekten, die auf unterschiedlichen Pflanzenfamilien weltweit zu kolonisieren. Sie sind charakteristisch für verschiedene Funktionen, insbesondere ihre komplexen Lebenszyklen mit zyklische Parthenogenese und diskrete Polyphenisms und ihre obligatorische ernährungsphysiologischen Symbiosen mit Bakterien oder Hefen Endosymbionts, die Nährstoffversorgung fehlt Ihre Ernährung der Pflanze SAP-1. Während die meisten Blattläuse Host Pflanze Spezialisten, einige allgemeine Arten sind wichtige Pflanzenschädlinge zuzufügen beträchtlichen wirtschaftlichen Schaden auf Pflanzen entweder direkt oder über die Krankheitserreger und Viren sie Vektor-2. Die Veröffentlichung des ersten Blattlaus-Genoms im Jahr 2010 die Erbse Blattlaus Acyrthosiphon Pisum3, markiert einen wichtigen Meilenstein in der Erforschung der Biologie der Blattlaus, weil es die genomischen Ressourcen für Adressierung Fragen rund um des Insekts zur Verfügung gestellt Anpassungen an den pflanzenfressenden Lebensstil, einschließlich derer, die zu einer besseren Kontrolle Strategien4führen könnte. Seit dieser Zeit haben zusätzliche genomische Ressourcen mit der Veröffentlichung von einer kommentierten Genom für die Sojabohne Blattlaus Aphis Glycine5und öffentlich verfügbare gesamte Genom Ressourcen für eine weitere drei-Blattlaus-Arten (Myzus angesammelt. Cerasi (schwarze Kirsche Blattlaus), Myzus Persicae (Pfirsich-Kartoffel-Blattlaus), Rhopalosiphum Padi (Vogel-Kirsche-Oat Blattlaus)6. Wertvolle de Novo transkriptomischen Ressourcen stehen zur Verfügung sowie für eine Reihe von anderen blattlausarten (e.g.,Aphis Gossypii (Baumwolle Blattlaus)7, Sitobion Avenae (Korn Blattlaus)8, Cinara Pinitabulaeformis (Kiefer Blattlaus)9, Aphis Nerii (Wolfsmilch-Oleander Blattlaus)10).
Auch unternommen dauerhafte Beiträge zu unserem Verständnis von der Pflanzen-Insekten-Interaktionen und die Ökologie des Lebens die Blattläuse auf Pflanzen11. Ein Bereich wo Blattläuse besonders wichtige Beiträge geleistet haben, ist in unserem Verständnis der chemischen Ökologie von der Gastgeber-Pflanze-Interaktionen. Pflanzenfressenden Insekten zum Ausdruck bringen vielfältige Anpassungen profitieren für Überwindung Pflanze Verteidigung, und einige sogar pflanzlichen Abwehrmechanismen für eigene kooptieren12,13,14. Beispielsweise ist die Wolfsmilch-Oleander-Blattlaus Aphis Nerii, ein helles Gelb, invasive Blattlaus gefunden in gemäßigten und tropischen Regionen der Welt, die Pflanzen in der Familie Wolfsmilch (Lobelia) besiedelt. Pflanzen in der Familie Lobelia entstanden diverse Chemische Abwehr, einschließlich milchige Latex und Herzglykoside bekannt als Cardenolides, die Binden des kation Trägers Na, K-ATPase und wirksame Abschreckung Generalist Pflanzenfresser15, 16. Wolfsmilch Spezialisten express verschiedene Modi des Widerstands gegen die Cardenolides und einige selektiv oder passiv ansammeln oder Cardenolides in ihren Geweben zu ändern, als ein Mittel, um Raub zu verhindern oder für andere Leistungen-17. A. Nerii wird gedacht, um Cardenolides auf diese Weise absondern, obwohl die Mechanismen und funktionale Vorteile unklar10,18 bleiben.
Angesichts der genomischen Mittel zur hand, bietet A. Nerii ein ausgezeichnetes experimentelles Modell für die Untersuchung der molekularen und genetischen Mechanismen die Chemo-ökologische Wechselwirkungen zwischen toxischen Wirtspflanzen und ihrer fachlichen Pflanzenfresser. Es ist erwähnenswert, dass, während einige der frühesten Studien der A. Nerii konzentrierte sich auf Sequestrierung von Cardenolides19, seit dieser Zeit Studien von A. Nerii Einblicke in eine breite Palette von evolutionären und ökologische Fragen zur Verfügung gestellt haben, einschließlich der genetischen Struktur von invasiven Insekten20 und das Zusammenspiel zwischen Bottom-Up- und Top-Down-Verordnung über die Pflanzenfresser Dichte21. A. Nerii ist somit ein guter Kandidat als ein experimentelles Modell für eine besonders breite Palette von Studien über das Insekt-Pflanze-Interaktionen. Kritisch für den Erfolg jeder Studie mit A. Nerii ist die sorgfältige Kultur der Blattlaus Bevölkerungen, die die Kultur der Pflanzen umfasst die Blattläuse abhängen, sowie eine effiziente Erzeugung von qualitativ hochwertigen - Omic Daten. Unser Ziel ist es, den Leser durch beide führen. Nachstehend beschriebenen sind Methoden für die Erzeugung und die Wartung der Anlage und Blattlaus Kulturen im Gewächshaus und Labor, DNA und RNA Extraktionen, Mikrosatelliten-Analyse, de Novo Transkriptom Montage und Annotation, Transkriptom differentielle Expressionsanalyse und qPCR rufsakademie ausgedrückt differentiell Gene. Während diese Methoden für A. Neriigeschrieben werden, können die allgemeinen Methoden der Kultivierung, Extraktion und Analyse verschiedener blattlausarten erweitern.

<table><tbody><tr><td>Sun Gro Fafard Keimmischung</td><td>Hummert International</td><td>10-0952-2</td><td></td></tr><tr><td>Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix</td><td>Hummert International</td><td>10-0951-2</td><td></td></tr><tr><td>2" x 4" Runder Standardtopf</td><td>Anderson Töpfe</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA-Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0701</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>15596026</tr><tr><td>SuperScript&reg; III Erststrang-Synthesekit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4367659</td><td></td></tr></tbody></table>

aufrechterhaltung der biologischen kulturen und messung der genexpression in aphis nerii: non-modellsystem für pflanzen-insekten-interaktionen

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Blattläuse sind hervorragende experimentelle Modelle für eine Vielzahl von biologischen Fragestellungen, die die Entwicklung von Symbiosen und die Entwicklung der Polyphenisms bis hin zu Fragen des Insekts Interaktionen mit ihren Wirtspflanzen. Genomische Ressourcen stehen für verschiedene blattlausarten und mit Fortschritten in der Next Generation Sequencing, transkriptomischen Studien sind auf nicht-Modellorganismen, die Genome fehlt ausgedehnt wird. Darüber hinaus können Blattlaus Kulturen gesammelt aus dem Feld und im Labor für den Einsatz in organismal und molekularbiologische Experimente, die Lücke zwischen ökologischen und genetischen Studien aufgezogen. Endlich viele Blattläuse sind im Labor auf ihre bevorzugten Wirtspflanzen im ewigen, Marbled Lebenszyklen ermöglicht Vergleiche asexually reproduzieren Genotypen pflegbar. Aphis Nerii, Wolfsmilch-Oleander-Blattlaus, bietet ein solches Modell um Insekt Interaktionen mit giftigen Pflanzen mit organismal und molekulare Experimente zu untersuchen. Methoden für die Erzeugung und die Wartung der Anlage und Blattlaus Kulturen in das Gewächshaus und Labor, DNA- und RNA-Extraktion, Mikrosatelliten-Analyse, de Novo Transkriptom Montage- und Annotation, Transkriptom differentielle expression Analyse, qPCR Überprüfung der differentiell exprimierten Genen beschrieben und hier diskutiert.

Kulturen zu Pflanzen: Samen dauert etwa zwei bis vier Wochen, je nach Jahreszeit, um groß genug, um wieder vergossen (Abb. 1A). Neu eingetopften Pflanzen dauert weitere zwei bis vier Wochen auf eine optimale Größe für Blattlaus Kulturen (Abbildung 1B) wachsen.
Blattlaus Kulturen: Erwachsenen A. Neri...

Die Blattlaus Aphis Nerii kolonisiert auf stark verteidigte Pflanzen in der Familie Definitionen (Apocyanaceae) und bietet zahlreiche Möglichkeiten, Pflanzen-Insekten-Interaktionen zu untersuchen. Hier stellen wir eine Reihe von Protokollen für die Wartung von Anlagen und Blattlaus, Kulturen, und die Erzeugung und Analyse von molekularen und Omic - Daten für A. Nerii.

Aufrechterhaltung der biologischen Kulturen und Messung der Genexpression in Aphis Nerii: Non-Modellsystem für Pflanzen-Insekten-Interaktionen

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Diese Methode beschreibt allgemeine Schritte zur Blattlauszucht und Schritte zur genetischen Analyse von Blattläusen. Diese Methoden können angewendet werden, um Schlüsselfragen in der Evolution und Ökologie von Blattläusen und den molekularen Mechanismen, die der Blattlausbiologie zugrunde liegen, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Allgemeinen auf die meisten Blattlausarten angewendet werden kann und zu relativ geringen Kosten durchgeführt werden kann.Beginnen Sie damit, eine Standard-Sämlingsschale mit Keimmischung zu füllen und darauf zu achten, dass die Erde die Oberseite der Vertiefungen erreicht. Wenn alle Brunnen gefüllt sind, bohren Sie ein drei Zentimeter tiefes Loch in die Erde jedes Brunnens und legen Sie einen Samen in jedes Loch. Gießen Sie die Zellen, bis die Erde, die die Samen bedeckt, gesättigt ist, und stellen Sie die Schale in ein Gewächshaus, in dem täglich bis jeden zweiten Tag gegossen wird, um eine moderate Bodenfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.Wenn die Sämlinge ihre ersten vollen Blätter gebildet haben, füllen Sie vier Zoll runde Töpfe mit Blumenerde, bis zu etwa fünf Zentimeter unter ihren Rändern. Schaffen Sie ein Loc

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Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) ist ein wirksames Instrument zur mRNA-Spiegel in verschiedenen Insekten-Geweben und Entwicklungsstadien zu diagnostizieren. In diesem Bericht zeigen wir die Verwendung von qRT-PCR, um festzustellen mRNA-Spiegel in verschiedenen Larvenstadien Geweben und Entwicklungsstadien der invasiven Insektenarten, Smaragd Asche borer.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Mittels quantitativer Real Time-PCR

Quelle: Rufián, J. S. et al. Einzelzellanalyse der Expression von Pseudomonas syringae-Genen im Pflanzengewebe. J. Vis. Exp. (2022).Dieses Video demonstriert eine Methode zur Analyse der Genexpression in pflanzenextrahierten, pathogenen Bakterien auf Einzelzellniveau mit einem fluoreszierend markierten Transkriptionsfaktor. Konfokale Bildgebung zeigt Heterogenität in der Expression von Virulenzgenen und hebt die funktionelle Vielfalt innerhalb einer klonalen bakteriellen Population hervor.

Einzelzellanalyse der Genexpression aus pflanzenextrahierenden Krankheitserregern

Dieses Video zeigt eine Methode zur Etablierung eines Mycobacterium bovis-Infektionsmodells in den Larven der Großen Wachsmotte, Galleria mellonella. Ein biolumineszierender Stamm von Mycobacterium bovis BCG wird in die Hämolymphe der Larve injiziert, um eine Infektion zu etablieren, und die Biolumineszenz wird in vordefinierten Intervallen gemessen, um den Fortschritt der Infektion zu untersuchen.

Eine Technik zur Etablierung eines bakteriellen Infektionsmodells in Insektenlarven

Die Quantifizierung des Erregerwachstums ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung verschiedener Immunantworten von Arabidopsis thaliana (im Folgenden: Arabidopsis). Das hier beschriebene Verfahren stellt einen optimierten Spritzeninfiltrationsassay zur Quantifizierung der Pseudomonas syringae pv dar. Maculicola ES4326-Wachstum in adulten Arabidopsis-Blättern.

Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Es wird ein Protokoll der Ganzbett-Immunfärbung an Blattlausembryonen vorgestellt, in dem kritische Bedingungen für die Verringerung der Hintergrundfärbung und die Erhöhung der Gewebepermeabilität behandelt werden. Diese Bedingungen wurden speziell für den effektiven Nachweis der Proteinexpression im embryonalen Gewebe von Blattläusen entwickelt.

Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

Hier präsentieren wir Protokolle für die Aufzucht eines intermediären Keimkäfers, Dermestes maculatus (D. maculatus) im Labor. Wir teilen auch Protokolle für embryonale und elterliche RNAi und Methoden zur Analyse embryonaler Phänotypen, um die Genfunktion bei dieser Spezies zu untersuchen.

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer, Dermestes maculatus

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für die Analyse von Kalziumsignale in Pflanzen durch die Fütterung von hemipteran Insekten wie Blattläuse generiert. Arabidopsis Thaliana verwandelt mit der GFP-Kalzium-Biosensor GCaMP3 erlauben die Echtzeit- in-Vivo Bildgebung von Kalzium Dynamik mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.

In Echtzeit In Vivo Aufnahme von Arabidopsis Kalziumsignale während der Fütterung mit einer fluoreszierenden Biosensor Insekt

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Aufzeichnen der absteigenden elektrische Aktivität von Drosophila Melanogaster Zentralnervensystems ermöglichen kostengünstige und praktische Erprobung von pharmakologischen Wirkstoffen, Genmutationen neuronaler Proteine, und/oder die Rolle der unerforschten physiologischen Wege.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

Die vorgestellte Methode schafft natürliches Pflanzenfresser schädigendes Pflanzengewebe durch die Anwendung von Manduca sexta Larven auf abgetrennte Blätter von Kartoffeln. Das Pflanzengewebe wird auf die Expression von sechs Transkriptionsfaktor-Homologen geprüft, die an frühen Reaktionen auf Insektenkraut beteiligt sind.

Freistehende Leaf Assays zur Vereinfachung der Genexpressionsstudien in Kartoffeln während des Befalls durch Kauen Voninsekt Manduca sexta

Hier charakterisieren wir zelluläre proteotoxische Stressreaktionen in der Nematode C. elegans, indem wir die Aktivierung fluoreszierender Transkriptionsreporter messen und die Empfindlichkeit gegenüber physiologischem Stress beobachten.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Dieses Papier beschreibt grundlegende Methoden zur Standardisierung wichtiger Faktoren wie Dichte, Futterverfügbarkeit, Hydratationsquelle und Umweltkontrollen für die langfristige Aufzucht von Laborkulturen der essbaren Grille Gryllus bimaculatus.

Erhaltung von Laborkulturen von Gryllus bimaculatus, einem vielseitigen Orthopteran-Modell für die Insektenzucht und die Physiologie wirbelloser Tiere

Lernen Sie die Kultivierung von Aphis nerii und die Messung der Genexpression für Pflanzen-Insekten-Interaktionen. Diese kostengünstigen Methoden ermöglichen Forschern molekulare Analysen in vivo.

Aufrechterhaltung der biologischen Kulturen und Messung der Genexpression in Aphis Nerii: Non-Modellsystem für Pflanzen-Insekten-Interaktionen (Video) | JoVE Journal

Aufrechterhaltung der biologischen Kulturen und Messung der Genexpression in Aphis Nerii: Non-Modellsystem für Pflanzen-Insekten-Interaktionen

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