Aufrechterhaltung der biologischen Kulturen und Messung der Genexpression in Aphis Nerii: Non-Modellsystem für Pflanzen-Insekten-Interaktionen

Diese Methode beschreibt allgemeine Schritte zur Blattlauszucht und Schritte zur genetischen Analyse von Blattläusen. Diese Methoden können angewendet werden, um Schlüsselfragen in der Evolution und Ökologie von Blattläusen und den molekularen Mechanismen, die der Blattlausbiologie zugrunde liegen, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Allgemeinen auf die meisten Blattlausarten angewendet werden kann und zu relativ geringen Kosten durchgeführt werden kann.

Beginnen Sie damit, eine Standard-Sämlingsschale mit Keimmischung zu füllen und darauf zu achten, dass die Erde die Oberseite der Vertiefungen erreicht. Wenn alle Brunnen gefüllt sind, bohren Sie ein drei Zentimeter tiefes Loch in die Erde jedes Brunnens und legen Sie einen Samen in jedes Loch. Gießen Sie die Zellen, bis die Erde, die die Samen bedeckt, gesättigt ist, und stellen Sie die Schale in ein Gewächshaus, in dem täglich bis jeden zweiten Tag gegossen wird, um eine moderate Bodenfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.

Wenn die Sämlinge ihre ersten vollen Blätter gebildet haben, füllen Sie vier Zoll runde Töpfe mit Blumenerde, bis zu etwa fünf Zentimeter unter ihren Rändern. Schaffen Sie ein Loch in die Erde, das tief genug ist, um den Boden des Topfes zu erreichen, und schöpfen Sie die reifen Sämlinge vorsichtig von Hand, um sie tief in die Löcher in den neuen Töpfen zu setzen. Bedecken Sie dann die Sämlinge mit Erde und gießen Sie die Sämlinge täglich bis jeden zweiten Tag, um eine moderate Bodenfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.

Wenn die Pflanzen mindestens drei bis vier Sätze voller Blätter gebildet haben und mindestens zehn Zentimeter hoch sind, untersuchen Sie die Pflanzen manuell auf unerwünschte Schädlinge und übertragen Sie mit einer Mundpipette vorsichtig eine einzelne auf dem Feld gesammelte adulte Blattlaus auf das Blatt der ersten Pflanze, um eine isoklonale Linie zu erzeugen. Wenn alle Blattläuse übertragen wurden, decken Sie die Pflanzen sicher mit einem speziell angefertigten Becherkäfig ab und setzen Sie die von Blattläusen befallenen Pflanzen in eine kontrollierte Umgebungskammer. Um die Stammpopulationen zu erhalten, verwenden Sie eine Mundpipette, um wöchentlich ein bis drei Nymphen im zweiten oder dritten Stadium und eine erwachsene Blattlaus sicher auf eine neue Pflanze zu übertragen.

Und decken Sie jede Pflanze mit einem neuen Becherkäfig für die Kultur ab, wie gezeigt. Für die DNA-Extraktion aus einer einzelnen adulten Blattlaus legen Sie die Blattlaus in die Nähe des Bodens eines sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens mit flüssigem Stickstoff und zerkleinern Sie die Blattlaus mit einem Stößel. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Lysepuffer in das Mikrozentrifugenröhrchen und mahlen Sie die zerkleinerte Blattlaus weiter, bis die Probe sichtbar zerfallen ist.

Waschen Sie den Stößel mit weiteren 100 Mikrolitern Lysepuffer und inkubieren Sie die gemahlene Blattlaus 30 Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation 14 Mikroliter Aemulor-Kaliumacetat in das Röhrchen geben und zum Mischen invertieren. Nach 30 Minuten auf Eis sammeln Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation und überführen den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, ohne das Pellet zu stören.

Geben Sie 200 Mikroliter kaltes 100-prozentiges Ethanol in molekularer Qualität in den Überstand und drehen Sie das Röhrchen zum Mischen um. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur die gefällte DNA durch Zentrifugation sammeln und das Ethanol mit einer Pipette entfernen. Suspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern kaltem Ethanol mit 70 Prozent molekularer Qualität und schnippen Sie für eine zweite Zentrifugenwäsche.

Und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern frischem, kaltem, 100 Prozent molekularem Ethanol. Legen Sie das Röhrchen nach der dritten Zentrifugation horizontal auf ein Stück Seidenpapier und trocknen Sie es fünf bis zehn Minuten lang an der Luft. Und resuspendieren Sie das DNA-Pellet in 80 Mikrolitern niedrigem Trisedta-Gehalt.

Quantifizieren Sie dann die resuspendierte DNA in einem Spektralphotometer und lagern Sie die verbleibende Probe bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie wie gezeigt bis zu fünf adulte Blattläuse in flüssigem Stickstoff zerkleinert haben, überführen Sie die Probe in einen Abzug und geben Sie 800 Mikroliter Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsreagenz in das Probenröhrchen. Die Probe wird mit einem Stößel homogenisiert und das Homogenat fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Geben Sie anschließend 160 Mikroliter Chloroform in die Probe, gefolgt von 15 Sekunden kräftigem Schütteln mit der Hand. Inkubieren Sie die Probe dann zwei bis drei Minuten lang bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie, um die extrahierte RNA zu sammeln. Um die RNA auszufällen, überführen Sie die wässrige Phase in ein neues RNS-freies Mikrozentrifugenröhrchen, ohne die Zwischenphase zu stören, und fügen Sie der RNA 400 Mikroliter Isopropanol hinzu.

Nach einer zehnminütigen Inkubation bei minus 20 Grad Celsius wird die gefällte RNA durch Zentrifugation gesammelt. Waschen Sie die Probe dann zweimal mit einem Milliliter 75-prozentigem Ethanol in mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser, um die Probe langsam vortexen und zentrifugieren zu lassen, um alle Phenolverunreinigungen zu entfernen. Nach dem zweiten Waschen trocknen Sie das Pellet meist fünf bis zehn Minuten lang an der Luft auf einer sterilen Bank und lösen Sie das RNA-Pellet in 30 Mikrolitern Reinstwasser durch sanftes Pipettieren auf, bevor Sie zehn bis 15 Minuten bei 55 bis 60 Grad Celsius inkubieren.

Die Samen brauchen je nach Jahreszeit etwa zwei bis vier Wochen, um groß genug zu werden, um umgetopft zu werden. Umgetopfte Sämlinge brauchen weitere zwei bis vier Wochen, um auf eine optimale Größe für die Blattlauszucht heranzuwachsen. Adulte Aye-near-ee-eye zeichnen sich durch eine dunkle Cauda aus und können ungeflügelt oder geflügelt sein.

Sich entwickelnde Flügelpolster werden sichtbar, wenn die Nymphen das dritte Stadium erreichen. Ein einzelnes erwachsenes Aye-near-ee-eye ergibt etwa 100 bis 200 Nanogramm pro Mikroliter DNA und 150 bis 300 Nanogramm pro Mikroliter RNA. Die relative Expression eines Kandidatengens unter verschiedenen Behandlungsbedingungen kann dann berechnet werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, Ihre isoklonalen Bestände nicht zu kontaminieren. Denken Sie auch daran, dass die Qualität Ihrer Blattläuse stark von der Qualität Ihrer Pflanzen abhängt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Extraktionen und Sequenzierungstechniken durchgeführt werden, um Fragen zu den molekularen Mechanismen zu beantworten, die der Blattlausbiologie zugrunde liegen.