Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Diese Methode kann als diagnostisches Werkzeug für Krebs verwendet werden, um die zirkulierende Tumor-DNA zu analysieren. Diese Technik hinterfragt mehrere genetische Veränderungen in Regionen von Clustermutationen in einer einzigen Reaktion. Dies hilft, wertvolle Patientenproben zu speichern.

Diese Methode kann Einblicke in die Tumorbelastung ihres Mutationsprofils geben. Es kann nun auch auf eine molekulare Analyse als Alternative zu qPCR angewendet werden, um eine absolute Quantifizierung von Nukleinsäure-Zielsequenzen zu erhalten. Sammeln Sie Blutproben in 7-Milliliter EDTA-Röhren.

Zwei Röhren werden empfohlen, um etwa vier Milliliter Plasma zu sammeln. Zentrifuge die Blutproben für 10 Minuten bei 820-facher Schwerkraft innerhalb von drei Stunden nach der Blutentnahme, um rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Plasma zu trennen. Die Zeit zwischen der Probenahme und der Zentrifugation ist entscheidend, um hochwertige, T-Zell-freie DNA zu erhalten, die nicht mit DNA kontaminiert ist, die aus weißen Blutkörperchen freigesetzt wird.

Verwenden Sie nach der Zentrifugation eine serologische Pipette, um den Überstand zu sammeln, ohne die weiße Blutkörperchenschicht zu berühren. Etwa zwei Milliliter Plasma werden in der Regel pro EDTA-Röhre zurückgewonnen. Nach der Übertragung der Plasmen auf zwei Milliliter-Röhren zentrieren Sie die Aliquots bei 16.000-facher Schwerkraft für 10 Minuten bei 15 Grad Celsius, um Zellablagerungen zu entfernen.

Sammeln Sie das Plasma sorgfältig, ohne das Pellet zu stören und in zwei Milliliter kryogene Röhren zu übertragen. Bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis es nötig ist. Beginnen Sie mit 400 Mikroliter Proteinase K zu einer 50-Milliliter-Röhre.

Fügen Sie dann vier Milliliter Plasma und 3,2 Milliliter ACL-Lysepuffer hinzu, der ein Mikrogramm Träger-RNA aus dem Extraktionskit enthält. Schließen Sie das Rohr und mischen Sie es, indem Sie 30 Sekunden lang wirbeln, um eine homogene Lösung zu erhalten. Dann bei 60 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren.

Nach der Inkubation 7,2 Milliliter Puffer ACB in das Lysat geben, um die Bindung der zirkulierenden Nukleinsäuren an die Kieselsäuremembran zu optimieren. Mischen Sie durch Wirbel für 15 bis 30 Sekunden. Dann inkubieren Sie die Röhre für fünf Minuten auf Eis.

Befestigen Sie die Säule und den 20-Milliliter-Extender an der Vakuumpumpe. Schließen Sie die nicht verwendeten Abschnitte, um Vakuumaspiration zu ermöglichen. Nach einer kurzen Zentrifugierung des Rohres, führen Sie das Gemisch vorsichtig in den Rohrverlängerer ein.

Schalten Sie dann die Vakuumpumpe ein und lassen Sie das Lysat vollständig durch die Säulen ziehen. Entfernen und entsorgen Sie den Rohrverlängerer. Als Nächstes wenden Sie 600 Mikroliter Puffer ACW1 auf die Spalte an.

Wenn Puffer ACW1 durch die Spalte gezogen hat, fügen Sie 750 Mikroliter ACW2-Puffer hinzu und schließlich 750 Mikroliter 96 bis 100% Ethanol. Legen Sie die Säule dann drei Minuten lang mit voller Geschwindigkeit in ein sauberes Zwei-Milliliter-Sammelrohr und eine Zentrifuge, um Ethanol zu eliminieren. Nachdem Sie die Säule in ein neues Zwei-Milliliter-Sammelrohr gestellt haben, öffnen Sie den Deckel und bebrüten dann bei 56 Grad Celsius für 10 Minuten, um die Membran vollständig zu trocknen.

Legen Sie die Säule nach der Inkubation in ein sauberes 1,5 Milliliter-Bindungsrohr. 36 Mikroliter RNase-freies Wasser mit 0,04%Natriumazid vorsichtig auftragen. Schließen Sie dann den Deckel und bebrüten bei Raumtemperatur drei Minuten lang.

Zentrifugieren Sie wieder mit voller Geschwindigkeit für eine Minute, um die Nukleinsäuren zu elute. Dann bei negativen 20 Grad Celsius lagern, bis nötig. Beginnen Sie mit dem Auftauen und Ausgleichen der Reaktionskomponenten auf Raumtemperatur in einer sauberen PCR-Haube.

Bereiten Sie dann eine 20-fache Mischung aus Primern und Sonden in RNase und Dnase-freiem destilliertem Wasser mit jeder Grundierung bei 18 Mikromolarkonzentration und jeder Sonde mit fünf Mikromolarkonzentration vor. Für alle einzelnen PCR-Reaktionen bereiten Sie einen Probenmix vor, indem Sie 10 Mikroliter des zweifachen ddPCR Supermix, einen Mikroliter mit 20-fachen Primern und Sonden und bis zu 10 Nanogramm der DNA-Probe in 20 Mikroliter destilliertem Wasser kombinieren. Wirbeln Sie das Reaktionsgemisch gründlich, um Homogenität zu gewährleisten.

Und kurz Zentrifuge, um Inhalt an der Unterseite des Rohres vor dem Dosieren zu sammeln. Setzen Sie die ddPCR-Patrone in den Halter ein und laden Sie 20 Mikroliter Probenreaktionsmischung in die mittleren Brunnen der Patrone für die Tröpfchenerzeugung. Fügen Sie 70 Mikroliter Tröpfchengeneratoröl in die unteren Brunnen.

Setzen Sie die Patrone mit einer Dichtung in den Tröpfchengenerator ein. Tröpfchen werden in den oberen Brunnen der Patrone hergestellt. Langsam und schonend 40 Mikroliter der Tröpfchen aus den Kartuschen absaugen und in eine 96-Well-PCR-Platte geben.

Versiegeln Sie die endgültige PCR-Platte mit Aluminiumfolie mit einem Plattenversiegeler unmittelbar nach dem Übertragen von Tröpfchen, um Verdunstung zu vermeiden. Kurz zentrifugieren Sie die Platte, um Denkinhalt an der Unterseite der Brunnen zu sammeln. Führen Sie eine herkömmliche PCR-Verstärkung auf einem thermischen Cycler aus.

Wenn der Lauf abgeschlossen ist, zentrieren Sie die Platte kurz, um den Inhalt an der Unterseite der Brunnen zu sammeln. Verwenden Sie nach der PCR-Verstärkung den Tröpfchenleser, um PCR-positive und PCR-negative Tröpfchen gemäß den Anweisungen des Herstellers zu zählen. Im Folgenden finden Sie repräsentative Ergebnisse, die während der Optimierungsschritte des Drop-off-ddPCR-Assays erzielt wurden.

Dieses Bild zeigt den Nachweis von mutierter DNA und Wild-DNA in einer Reaktion, die 100% mutierte DNA, 5% mutierte DNA und 100% Wilde-DNA enthält. Dieses Bild zeigt Beispiele von Plasmaproben, die mit den KRAS- und EGFR-Drop-off-ddPCR-Assays analysiert wurden, die den Nachweis von Einzelnukleotid und Mehrfachsubstitutionen in Exon zwei von KRAS und eine Deletion in EGFR exon 19 zeigen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, bei jedem Schritt sorgfältig mit einer besonderen Aufmerksamkeit bei der Tröpfchengenerierung vorzugehen, was ein kritischer Schritt dieser Methode ist.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik forschern und Klinikern auf dem Gebiet der Krebsforschung den Weg zur Optimierung der Tumormutationsanalyse mittels flüssiger Biopsie.