Name: Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Lernen Sie die Drop-off-ddPCR-Methode zur gleichzeitigen Detektion mehrerer Mutationen in ctDNA aus Flüssigbiopsien. Diese Technik ermöglicht die hochsensitive Analyse von Tumorlast und Mutationsprofilen in der Krebsdiagnostik.

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Diese Arbeit wurde vom Institut Curie SiRIC (Grant Inka-DGOS-4654) unterstützt. Die Autoren möchte auch Caroline Hego für ihre Verdienste um das Video zu danken.

<ol><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li>
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<li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA%3A+a+cancer+diagnostic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li>
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<li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li>
<li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li>
<li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddpcr%3A+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li>
</ol>

Mehrere Autoren sind Erfinder von zwei Patentanmeldungen (EP17305920.5, EP18305277.8) im Zusammenhang mit CtDNA Erkennung benannt.

Um eine effiziente Drop-off-DdPCR-Assay zu entwerfen, Optimierung ist entscheidend, und das Protokoll muss sorgfältig beachtet werden. Jede Kombination von Primer und Sonden hat eine einzigartige Effizienz der PCR-Reaktion. So hat eine einzelne Probe sorgfältig auf Kontrollproben überprüft werden, bevor Sie auf wertvolle Proben verwendet wird. Optimierung und Validierung sind wichtig zur Zertifizierung Peak Signalerkennung und Spezifität und Sensitivität zu beurteilen. Wie im Protokoll beschrieben, können potenziell alle...

Tausende von somatischen Mutationen, die im Zusammenhang mit Krebsentstehung wurden berichtet1. Unter diesen sind einige prädiktive Marker für die Wirksamkeit der gezielten Therapie 2,3 und genetisches screening dieser Mutationen ist jetzt klinischen Routine. Tröpfchen-Digitaltechnik-PCR (DdPCR) verwendet werden, um das Vorhandensein oder das Fehlen von Mutationen mit hoher Erkennungsgenauigkeit zu überwachen und ist sehr kompatibel mit nicht-invasiven flüssigen Biopsien4,5. Aktuelle DdPCR Assays sind jedoch in erster Linie Mutationen bekannt a-priorizu erkennen. Dies schränkt die Verwendung von DdPCR als ein Discovery-Tool die Mutation ist nicht bekannt. In der Tat konkurriert in der konventionellen DdPCR Design, eine Hydrolyse-Sonde erkennt das Wildtyp Allel (WT-Sonde) mit einer speziellen Sonde erkennen die mutierten Allels (MUT-Sonde) (Abbildung 1A). Sonde mit höherer Affinität zur Vorlage hybridisiert und veröffentlicht seine Fluorophor, unter Angabe der Art des entsprechenden Allels. Die Fluoreszenz Daten für jedes Tröpfchen können in einem Streudiagramm repräsentieren die Fluoreszenz emittiert durch den WT und MUT Sonden in verschiedenen Dimensionen visualisiert werden. Eine schematische Darstellung der ein typisches Ergebnis für einen herkömmlichen DdPCR-Assay ist in Figur 1Apräsentiert. In diesem Beispiel entspricht die Blaue Wolke Tröpfchen mit WT Allele identifiziert durch die WT-Sonde, während die rote Wolke Tröpfchen entspricht in der MUT-Allel verstärkt und durch die MUT-Sonde identifiziert. Abhängig von der Menge der DNA in der Reaktion geladen können doppelte positive Tröpfchen mit WT und MUT Amplifikate (grüne Wolke) angezeigt werden. Die helle graue Wolke entspricht leer Tröpfchen.
Da die meisten Plattformen für den Nachweis von einer begrenzten Anzahl von Fluorophore (in der Regel 2, aber bis zu 5) ermöglichen, ist Durchsatz von konventionellen DdPCR begrenzt. Daher erfordert die Ausrichtung auf Regionen mit mehreren angrenzenden Mutationen Design von technisch anspruchsvollen multiplex DdPCR Assays oder die Verwendung von mehreren Reaktionen auf jede Mutation parallel. Die Drop-off-DdPCR-Strategie, überwindet diese Einschränkung, da es möglicherweise genetische Veränderung innerhalb einer Zielregion mit einer einzigartigen WT Hydrolyse Sonden erkennen kann. Die erste Sonde (Sonde 1) Abdeckungen ist eine nicht-Variablen Sequenz, angrenzend an die Zielregion und die zweite Sonde (Sonde 2) Ergänzend zu der WT-Sequenz der Zielregion wo Mutationen sind zu erwarten (Abbildung 1 b). Während die erste Sonde den Gesamtbetrag der amplifiable Moleküle in der Reaktion quantifiziert, diskriminiert die zweite Sonde WT und MUT Allele durch suboptimale Hybridisierung auf mutierte Sequenzen. Fühler 2 kann mehrere Arten von Mutationen in der Ziel-Region (einzelne oder mehrere Nukleotid Substitutionen, löschen, etc.)-6identifizieren. Wie bei konventionellen DdPCR entspricht die helle graue Wolke Tröpfchen enthalten keine DNA-Moleküle. Es ist wichtig, daran zu erinnern, dass bei dieser Art des Tests, optimale Trennung von WT und MUT Wolken abhängig von der Menge der DNA geladen in der Reaktion ist, da Tröpfchen mit WT und MUT Ziel Allele von Tröpfchen enthalten nur das WT nicht zu unterscheiden Form. Dieser Test erfordert daher, dass die meisten Tropfen nicht mehr als eine Kopie des Gens gezielte enthalten.

<table><tbody><tr><td>K2EDTA-Röhrchen (Farbcode: lavendel)</td><td>BD</td><td>367863</td><td>EDTA-Röhrchen werden zur Entnahme einer Vollblut- oder EDTA-Plasmaprobe verwendet</td></tr><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manuelles Protokoll)</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>Für die Isolierung von frei zirkulierender DNA aus menschlichem Plasma</td></tr><tr><td>QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automatisiertes Protokoll)</td><td>Qiagen</td><td>937556</td><td>Für die Isolierung von frei zirkulierender DNA aus menschlichem Plasma</td></tr><tr><td>QIAsymphony SP System</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>voll integriertes und automatisiertes System für die Aufreinigung von cfDNA, DNA oder RNA</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Für die gleichzeitige Aufreinigung von bis zu 24 cfDNAs</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>Das Qubit Fluorometer ist ein Tisch-Fluorometer für die Quantifizierung von DNA</td></tr><tr><td>QX100 oder QX200 Reader</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003 bzw. 186-4003</td><td>Das Lesegerät misst die Fluoreszenzintensität jedes Tröpfchens und erkennt die Größe und Form, wenn Tröpfchen den Detektor</td></tr><tr><td>passieren QX100 oder QX200 Tröpfchengenerator</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002 bzw. 186-4002 Instrument</td><td>zur Tröpfchenerzeugung</td></tr><tr><td>C1000 Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Modulare Thermocycler-Plattform, bestehend aus C1000 Touch Thermocycler-Chassis, 96-Well-Schnellreaktionsmodul,</td></tr><tr><td>Plattenversiegelung</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1&trade; PCR-Plattenversiegeler</td></tr><tr><td>DG8 Kartuschenhalter</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>Positioniert und hält die DG8-Kartusche im Gerät für die Tröpfchenerzeugung</td></tr><tr><td>Tropfchengeneratorkartuschen und Dichtungen</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>Mikrofluidik DG8 Kartusche zum Mischen von Probe und Öl zur Erzeugung von Tröpfchen; DG8-Dichtungen dichten die Kartusche ab, um eine Verdunstung zu verhindern und den für die Tröpfchenbildung erforderlichen Druck auszuüben</td></tr><tr><td>PCR-Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td><td>ddPCR-Supermix für Sonden (kein dUTP)</td></tr><tr><td>PCR-Platten mit 96 Well</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>96-Well-Platten mit halbem Rand</td></tr><tr><td>Foliensiegel</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td><td>Durchstechbare Folien-Heißsiegel</td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Oil</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3004</td><td>Öl für die</td></tr><tr><td>Tröpfchenerzeugung Öl für Sonden</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>Öl für die Tröpfchenerzeugung</td></tr><tr><td>DNA loBind Tube 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td>Eppendorf LoBind Röhrchen maximieren die Probenrückgewinnung durch signifikante Reduzierung der Probenbindung Multiplex</td></tr><tr><td>I cfDNA Referenzstandard Set</td><td>HORIZON</td><td>HD780</td><td>Die Multiplex I cfDNA-Referenzstandards sind hochgradig charakterisierte, biologisch relevante Referenzmaterialien, die zur Bewertung der Leistung von cfDNA-Assays zum Nachweis somatischer Mutationen verwendet werden</td></tr><tr><td>QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Der HS-Assay ist hochselektiv für doppelsträngige DNA (dsDNA) gegenüber RNA und so konzipiert, dass er für anfängliche Probenkonzentrationen von 10 pg/&micro; L bis 100 ng/&micro; L</td></tr><tr><td>Qubit Analyseröhrchen</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td>Qubit Analyseröhrchen sind 500 & Mikro; L dünnwandige Polypropylen-Röhrchen für die Verwendung mit dem Qubit Fluorometer</td></tr></tbody></table>

einzelne tropfen digitale polymerase-kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen nachweis von mutationen im hotspot-regionen

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digitale Polymerase-Kettenreaktion (DdPCR) ist eine hochempfindliche quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methode basiert auf Probe Fraktionierung in Tausende von nanogrösse Wasser-in-Öl-individuelle Reaktionen. Vor kurzem, ist eines der genauesten und sensible Instrumente für zirkulierenden Tumor DNA (CtDNA) Erkennung DdPCR geworden. Die wesentlichen Einschränkungen der standard DdPCR-Technik gehört die begrenzte Anzahl von Mutationen, die pro Reaktion gezeigt werden kann als spezifische Hydrolyse Sonden erkennen jede mögliche Allele Version erforderlich sind. Eine alternative Methode, die Drop-off-DdPCR erhöht den Durchsatz, da es nur ein einzelnes Paar von Sonden erfordert zu erkennen und zu quantifizieren, potenziell alle genetische Veränderungen in der gezielten Region. Drop-off-DdPCR zeigt vergleichbare Sensitivität zu konventionellen DdPCR Assays mit dem Vorteil eine größere Anzahl von Mutationen in einer einzelnen Reaktion zu erkennen. Es ist kostengünstig, schont wertvolle Probenmaterial und kann auch als ein Discovery-Tool verwendet werden, wenn Mutationen kein-prioribekannt sind.

In einem Proof-of-Concept-Studie wurden KRAS Exon 2 Mutationen (Codon 12 und 13) und EGFR Exon 19 Löschungen in FFPE Gewebe und Plasma-Proben von Krebspatienten mit der Drop-off DdPCR Strategie6untersucht.
Die KRAS -Drop-off-Sonde verhört einen 16 bp-Region umfasst mehrere Mutationen im Exon 2 des KRAS -Gens, die mehr als 95 % der bekannten KRAS -Mutationen in ...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Diese Methode kann als diagnostisches Werkzeug für Krebs verwendet werden, um die zirkulierende Tumor-DNA zu analysieren. Diese Technik hinterfragt mehrere genetische Veränderungen in Regionen von Clustermutationen in einer einzigen Reaktion. Dies hilft, wertvolle Patientenproben zu speichern.Diese Methode kann Einblicke in die Tumorbelastung ihres Mutationsprofils geben. Es kann nun auch auf eine molekulare Analyse als Alternative zu qPCR angewendet werden, um eine absolute Quantifizierung von Nukleinsäure-Zielsequenzen zu erhalten. Sammeln Sie Blutproben in 7-Milliliter EDTA-Röhren.Zwei Röhren werden empfohlen, um etwa vier Milliliter Plasma zu sammeln. Zentrifuge die Blutproben für 10 Minuten bei 820-facher Schwerkraft innerhalb von drei Stunden nach der Blutentnahme, um rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Plasma zu trennen. Die Zeit zwischen der Probenahme und der Zentrifugation ist entscheidend, um hochwertige, T-Zell-freie DNA zu erhalten, die nicht mit DNA kontaminiert ist, die aus weißen Blutkörperchen freigesetzt wird.Verwenden Sie nach der Zentrifugation eine serologische Pipette, um den Überstand zu sammeln, ohne die weiße Blutkörperchenschicht zu berühren. Etwa zwei Milliliter Plasma werden in der Regel pro EDTA-Röhre zurückgewonnen. Nach der Übertragung der Plasmen auf zwei Milliliter-Röhren zentrieren Sie die Aliquots bei 16.000-facher Schwerkraft für 10 Minuten bei 15 Grad Celsius, um Zellablagerungen zu entfernen.Sammeln Sie das Plasma sorgfältig, ohne das Pellet zu stören und in zwei Milliliter kryogene Röhren zu übertragen. Bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis es nötig ist. Beginnen Sie mit 400 Mikroliter Proteinase K zu einer 50-Milliliter-Röhre.Fügen Sie dann vier Milliliter Plasma und 3,2 Milliliter ACL-Lysepuffer hinzu, der ein Mikrogramm Träger-RNA aus dem Extraktionskit enthält. Schließen Sie das Rohr und mischen Sie es, indem Sie 30 Sekunden lang wirbeln, um eine homogene Lösung zu erhalten. Dann bei 60 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren.Nach der Inkubation 7,2 Milliliter Puffer ACB in das Lysat geben, um die Bindung der zirkulierenden Nukleinsäuren an die Kieselsäuremembran zu optimieren. Mischen Sie durch Wirbel für 15 bis 30 Sekunden. Dann inkubieren Sie die Röhre für fünf Minuten auf Eis.Befestigen Sie die Säule und den 20-Milliliter-Extender an der Vakuumpumpe. Schließen Sie die nicht verwendeten Abschnitte, um Vakuumaspiration zu ermöglichen. Nach einer kurzen Zentrifugierung des Rohres, führen Sie das Gemisch vorsichtig in den Rohrverlängerer ein.Schalten Sie dann die Vakuumpumpe ein und lassen Sie das Lysat vollständig durch die Säulen ziehen. Entfernen und entsorgen Sie den Rohrverlängerer. Als Nächstes wenden Sie 600 Mikroliter Puffer ACW1 auf die Spalte an.Wenn Puffer ACW1 durch die Spalte gezogen hat, fügen Sie 750 Mikroliter ACW2-Puffer hinzu und schließlich 750 Mikroliter 96 bis 100% Ethanol. Legen Sie die Säule dann drei Minuten lang mit voller Geschwindigkeit in ein sauberes Zwei-Milliliter-Sammelrohr und eine Zentrifuge, um Ethanol zu eliminieren. Nachdem Sie die Säule in ein neues Zwei-Milliliter-Sammelrohr gestellt haben, öffnen Sie den Deckel und bebrüten dann bei 56 Grad Celsius für 10 Minuten, um die Membran vollständig zu trocknen.Legen Sie die Säule nach der Inkubation in ein sauberes 1,5 Milliliter-Bindungsrohr. 36 Mikroliter RNase-freies Wasser mit 0,04%Natriumazid vorsichtig auftragen. Schließen Sie dann den Deckel und bebrüten bei Raumtemperatur drei Minuten lang.Zentrifugieren Sie wieder mit voller Geschwindigkeit für eine Minute, um die Nukleinsäuren zu elute. Dann bei negativen 20 Grad Celsius lagern, bis nötig. Beginnen Sie mit dem Auftauen und Ausgleichen der Reaktionskomponenten auf Raumtemperatur in einer sauberen PCR-Haube.Bereiten Sie dann eine 20-fache Mischung aus Primern und Sonden in RNase und Dnase-freiem destilliertem Wasser mit jeder Grundierung bei 18 Mikromolarkonzentration und jeder Sonde mit fünf Mikromolarkonzentration vor. Für alle einzelnen PCR-Reaktionen bereiten Sie einen Probenmix vor, indem Sie 10 Mikroliter des zweifachen ddPCR Supermix, einen Mikroliter mit 20-fachen Primern und Sonden und bis zu 10 Nanogramm der DNA-Probe in 20 Mikroliter destilliertem Wasser kombinieren. Wirbeln Sie das Reaktionsgemisch gründlich, um Homogenität zu gewährleisten.Und kurz Zentrifuge, um Inhalt an der Unterseite des Rohres vor dem Dosieren zu sammeln. Setzen Sie die ddPCR-Patrone in den Halter ein und laden Sie 20 Mikroliter Probenreaktionsmischung in die mittleren Brunnen der Patrone für die Tröpfchenerzeugung. Fügen Sie 70 Mikroliter Tröpfchengeneratoröl in die unteren Brunnen.Setzen Sie die Patrone mit einer Dichtung in den Tröpfchengenerator ein. Tröpfchen werden in den oberen Brunnen der Patrone hergestellt. Langsam und schonend 40 Mikroliter der Tröpfchen aus den Kartuschen absaugen und in eine 96-Well-PCR-Platte geben.Versiegeln Sie die endgültige PCR-Platte mit Aluminiumfolie mit einem Plattenversiegeler unmittelbar nach dem Übertragen von Tröpfchen, um Verdunstung zu vermeiden. Kurz zentrifugieren Sie die Platte, um Denkinhalt an der Unterseite der Brunnen zu sammeln. Führen Sie eine herkömmliche PCR-Verstärkung auf einem thermischen Cycler aus.Wenn der Lauf abgeschlossen ist, zentrieren Sie die Platte kurz, um den Inhalt an der Unterseite der Brunnen zu sammeln. Verwenden Sie nach der PCR-Verstärkung den Tröpfchenleser, um PCR-positive und PCR-negative Tröpfchen gemäß den Anweisungen des Herstellers zu zählen. Im Folgenden finden Sie repräsentative Ergebnisse, die während der Optimierungsschritte des Drop-off-ddPCR-Assays erzielt wurden.Dieses Bild zeigt den Nachweis von mutierter DNA und Wild-DNA in einer Reaktion, die 100% mutierte DNA, 5% mutierte DNA und 100% Wilde-DNA enthält. Dieses Bild zeigt Beispiele von Plasmaproben, die mit den KRAS- und EGFR-Drop-off-ddPCR-Assays analysiert wurden, die den Nachweis von Einzelnukleotid und Mehrfachsubstitutionen in Exon zwei von KRAS und eine Deletion in EGFR exon 19 zeigen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, bei jedem Schritt sorgfältig mit einer besonderen Aufmerksamkeit bei der Tröpfchengenerierung vorzugehen, was ein kritischer Schritt dieser Methode ist.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik forschern und Klinikern auf dem Gebiet der Krebsforschung den Weg zur Optimierung der Tumormutationsanalyse mittels flüssiger Biopsie.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

In diesem Video präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Erzeugung von emulgierten Nanotröpfchen zum Nachweis von Zielnukleinsäuren durch digitale Polymerase-Kettenreaktion oder dPCR.

Tröpfchen-Digitalpolymerase-Kettenreaktion: Eine Methode zur Erzeugung von Nanotröpfchen-PCR-Reaktionen zum Nachweis seltener Tumormutationen

Dieses Video zeigt die Rolle der digitalen Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion bei der Identifizierung von Indel-Mutationen in einer DNA-Probe. Die hohe Präzision und Empfindlichkeit der ddPCR ermöglicht einen genauen und konsistenten Nachweis seltener Mutationen, die in einer Probe vorhanden sind, selbst bei geringen Konzentrationen. Es kann Indel-Mutationen in verschiedenen Regionen des Genoms identifizieren und quantifizieren und liefert wertvolle Einblicke in die Mechanismen der Mutation und...

Digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion zum Nachweis von Indel-Mutationen in Zielgenen

In diesem Video demonstrieren wir die Duplex-Digital-PCR (ddPCR)-Technik — eine Modifikation der traditionellen PCR-Technik, die nützlich ist, um zwei verschiedene genetische Marker gleichzeitig zu detektieren. Eine einzelne PCR-Reaktion wird in nanolitergroße emulgierte Tröpfchen aufgeteilt, die unabhängig voneinander amplifiziert werden, und der Nachweis verschiedenfarbiger Fluoreszenzamplifikationssignale aus der Tröpfchenfraktion wird verwendet, um die Anfangskonzentration der Zielsequenzen...

Digitale Duplex-PCR zur gleichzeitigen Quantifizierung dualer genetischer Marker

In diesem Video beschreiben wir eine hochauflösende Schmelz-PCR-Technik zur Bestimmung des Längenpolymorphismus von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Sequenzlängen, basierend auf einer Schmelztemperaturanalyse.

Hochauflösende Schmelz-PCR zur Bestimmung von Sequenzvariationen in mutierten DNA-Sequenzen

Dieses Video demonstriert die Nützlichkeit der digitalen PCR in einem Chip-in-a-Tube-Format für den Nachweis von Einzelnukleotidvariationen in DNA-Proben. Eine einzelne PCR-Reaktion wird in Kammern aufgeteilt, die als unabhängige PCR-Reaktionen fungieren, und die Detektion von Fluoreszenzsignalen von den amplifizierten Zielen in den Kammern wird verwendet, um die Häufigkeit des varianten Allels in der Probe zu berechnen.

Chip-in-a-Tube-basierte digitale PCR zur Quantifizierung von Einzelnukleotidvarianten

Die Wildtyp-Blocking-PCR mit anschließender direkter Sequenzierung bietet eine hochempfindliche Methode zum Nachweis von niederfrequenten somatischen Mutationen in einer Vielzahl von Probentypen.

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Dieses Protokoll bietet die Schritte von der DNA-Extraktion bis zum Versuchsaufbau für die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR), einschließlich der Analyse zur Identifizierung und Quantifizierung von nicht-homologen End-Joining-Ereignissen (NHEJ) an Zielorten nach gRNA-induzierter Cas9-Spaltung und DNA-Reparatur. Andere Anwendungen dieser Methode umfassen Anwendungen wie den Polymorphismus-Nachweis und die Verifizierung von Gen-Editing-Varianten.

Digital-Droplet PCR zum Nachweis von Indel-Mutationen in gentechnisch veränderten Anopheline-Mückenpopulationen

In diesem Artikel wird die Anwendung einer niederfrequenten Nachweismethode vorgestellt, die auf der Sanger-Sequenzierung beim angioimmunoblastischen Lymphom basiert. Schaffen Sie eine Grundlage für die Anwendung dieser Methode auf andere Krankheiten.

Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

Eine verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP-Verfahren zur Genotypisierung Kugelfisch-Spezies durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie beschrieben. Eine Umkehrphasen-Silica-Monolith Säule wird zur Trennung verdaut Amplikons eingesetzt. Dieses Verfahren kann die monoisotopisch Massen von Oligonukleotiden aufzuklären, die zur Identifizierung Basenzusammensetzung nützlich ist.

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

Lernen Sie die Drop-off-ddPCR-Methode zur gleichzeitigen Detektion mehrerer Mutationen in ctDNA aus Flüssigbiopsien. Diese Technik ermöglicht die hochsensitive Analyse von Tumorlast und Mutationsprofilen in der Krebsdiagnostik.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen (Video) | JoVE Journal

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

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