Name: Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone mit Bioassay-geführte Fraktionierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Charakterisierung von Pheromonen beim Meerneunauge mittels Bioassay-geführter Fraktionierung. Diese Methode verknüpft neue Verbindungen mit Pheromonfunktionen und liefert wertvolle Einblicke in die chemische Ökologie.

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Wir danken der US geologischen Umfrage Hammond Bay biologische Station für die Nutzung ihrer Forschung Einrichtungen und das Personal der US Fish and Wildlife Service und Fischerei und Ozeane Kanada für die Bereitstellung Meer Neunaugen. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der Great Lakes-Fischerei-Kommission Weiming Li und Ke Li unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Fische leben in einer chemischen Welt voller Verbindungen noch identifiziert werden. Bioassay-geführte Fraktionierung bewährt wesentlich zu identifizieren und zu charakterisieren, bioaktive Moleküle, die viele chemische Interaktionen, wie bei Masu-Lachs31, Asiatische Elefanten32und Meer Neunaugen33zu vermitteln, 34,35. Bioassay-geführte Fraktionierung ist ein effektives Vorgehen g...

Pheromone sind spezielle chemische Signale, die von Personen, die ihnen Hilfe bei der Ortung Nahrungsquellen, Erkennung von Raubtieren und Vermittlung von sozialen Interaktionen der Artgenossen1veröffentlicht. Pheromon-Kommunikation bei Insekten wurde gut untersuchte2; die chemische Identifizierung und biologische Funktion der aquatischen Wirbeltieren Pheromone haben jedoch nicht so umfassend untersucht worden. Die Identität und Funktion der Pheromone freigegeben können angewendet werden, um die Wiederherstellung der bedrohten Arten3,4 oder Kontrolle Schädling Arten5,6zu erleichtern. Die Anwendung dieser Techniken erfordern die Isolierung und Charakterisierung von bioaktiven Pheromon-Komponenten.
Pheromon-Identifikation ist ein Zweig der Naturstoffchemie. Fortschritte in der Pheromon-Forschung wurde aufgrund der Beschaffenheit der Pheromon-Moleküle sich teilweise begrenzt. Pheromone sind oft instabil und in kleinen Mengen freigegeben, und nur ein paar Sampling-Techniken existieren, um winzige Mengen von flüchtigen7,8 oder wasserlöslichen Verbindungen9zu erkennen. Ansätze, Pheromone zu identifizieren sind (1) eine gezielte Überprüfung der bekannten Verbindungen, Metabolomik (2) und (3) Bioassay-geführte Fraktionierung. Eine gezielte Überprüfung der bekannten Verbindungen testet im Handel erhältlichen metabolische Nebenprodukte der physiologischen Prozesse, die die Hypothese als Pheromone funktionieren. Dieser Ansatz begrenzt, weil Forscher nur bekannte und verfügbare Verbindungen testen können. Allerdings hat es die erfolgreiche Identifikation von Sexualhormonen in Goldfisch diese Funktion als Pheromone10,11,12geführt. Metabolomik ist ein zweiter Pheromon-Identifikation-Ansatz, der potenzielle niedermolekulare Stoffwechselprodukte innerhalb eines biologischen Systems13unterscheidet. Ein Vergleich der Stoffwechselprofile von zwei Gruppen (d. h., eine aktive im Vergleich zu inaktiven Auszug) ermöglicht die Identifizierung eines möglichen metabolischen Profils aus, der Metabolit gereinigt wird, ist die Struktur aufgeklärt, und die Bioaktivität ist bestätigten14. Additive oder synergistische Wirkungen der komplexen Formulierungen bestimmte Mischungen sind eher mit Metabolomics erkannt werden, weil Metaboliten zusammen anstatt als eine Reihe von Fraktionen13gelten. Doch hängt die Umsetzung der Metabolomik die Verfügbarkeit von synthetischen Referenzen weil die resultierenden Daten nicht die Aufklärung der neuartige Strukturen erleichtern.
Bioassay-geführte Fraktionierung ist ein integrierte, iterativen Ansatz, die zwei Felder umfasst: Chemie und Biologie. Dieser Ansatz nutzt die Ergebnisse der physiologischen und verhaltensbezogenen Bioassays, die Isolierung und Identifizierung von einer aktiven Pheromon-Verbindung führen. Ein grober Extrakt ist fraktioniert durch eine chemische Eigenschaft (d.h., Molekülgröße, Polarität, etc.) und getestet mit Elektro-Olfactogram (EOG) Aufnahmen und/oder in einem Bioassay. Die bioaktiven Komponenten werden heraus durch Wiederholen Sie diese Schritte der Fraktionierung und EOGs bzw. Bioassays gezeigt. Die Strukturen der reinen Wirkstoffe sind durch spektrometrische und spektroskopische Methoden aufgeklärt, die das Molekulargewicht und Strukturinformationen herstellen eine Vorlage der Verbindung synthetisiert werden. Bioassay-geführte Fraktionierung kann nachgeben, diverse Metaboliten und potenziell neuartige Pheromone mit einzigartigen chemischen Skelette, die wahrscheinlich nicht von den biosynthetischen Bahnen vorhergesagt werden.
Hier beschreiben wir die Bioassay-geführte Fraktionierung Protokoll zu isolieren und zu charakterisieren die Bioaktivität der männlichen Meerneunauge Sex Pheromon Verbindungen verwendet. Meerneunauge (Petromyzon Marinus) ist ein ideales vertebrate Modell Pheromon Kommunikation zu studieren, weil diese Fische verlassen sich stark auf die olfaktorische Detektion von chemischen Signale zu vermitteln ihre anadrome Lebensgeschichte, bestehend aus drei Phasen: Larven, Jugendliche und Erwachsene. Meerneunauge Larven bohren sich in das Sediment von Süßwasser-Streams, eine drastische Metamorphose zu unterziehen, und Jugendliche, die an einem See oder Meer, wo sie große Host Fische parasitieren, migrieren verwandeln. Nach dem ablösen von der Host-Fisch, migrieren die Erwachsenen wieder Laich Bäche, geleitet von den wandernden Pheromone freigegeben durch Stream-Resident Larven15,16,17,18,19 . Reife Männer zu den Laichgründen aufsteigen, lassen Sie ein Mehrkomponenten Sex Pheromone um Freunde zu gewinnen, zeitweise Laichen für etwa eine Woche und dann sterben15,20. Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone ist wichtig, weil eine Modulation der Pheromon-Kommunikations-System unter den Optionen als die invasiven Meer Neunaugen in der Laurentian Great Lakes21zu kontrollieren ist.

<table><tbody><tr><td>Hochwertige Standard-Wandkapillaren aus Borosilikatglas mit Filament</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-4</td><td>Aufzeichnungs- und Referenzelektrode (AD 1,5 mm, ID 0,86 mm)</td></tr><tr><td>Pipettenabzieher-Instrument</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>zieht Elektroden für EOGs</td></tr><tr><td>Glasschneider mit Diamantspitze</td><td>Generische</td><td></td><td>geschnittene Elektrodenspitze für EOG</td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td>Odormittelabgaberohr für EOG</td></tr><tr><td>Aufzeichnungselektrodenhalter der E-Serie, gerader Körper mit Ag/AgCl-Pellet für Glaskapillare AD 1,5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>ESP-M15N</td><td>Aufnahmeelektrodenhalter</td></tr><tr><td>Referenzelektrodenhalter der E-Serie mit Griff mit&nbsp; Ag/AgCl Pellet&nbsp; für Glaskapillare AD 1,5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>E45P-F15NH</td><td>Referenzelektrodenhalter</td></tr><tr><td>1 mm</td><td>Pin Warner Instruments</td><td>WC1-10</td><td>zur Überbrückung von Referenz- und Aufzeichnungselektrodenhaltern</td></tr><tr><td>2 mm Pin</td><td>Warner Instruments</td><td>WC2-5</td><td>zur Überbrückung von Referenz- und Aufzeichnungselektrodenhaltern</td></tr><tr><td>Agar Sigma</td><td></td><td>A1296</td><td>Schmelzagar zum Befüllen von Elektroden</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>3M KCl zum Befüllen von Elektroden und Elektrodenhaltern</td></tr><tr><td>Mikropipette Microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td>zum Befüllen von Elektroden und Elektrodenhaltern</td></tr><tr><td>L-Arginin</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td>Positivkontrollodorant für EOG</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Sonderanfertigung</td><td>N/A</td><td>hält Odorstoffe für EOG</td></tr><tr><td>3-Aminobenzoesäure-Ethylester (MS222)</td><td>Syndel USA</td><td>Tricain1G</td><td>EOG Anästhetikum</td></tr><tr><td>Gallamine Triethiodid</td><td>Sigma</td><td>G8134-5G</td><td>EOG paralytische</td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>301025</td><td>zur Verabreichung von paralytischer</td></tr><tr><td>Subkutannadel 26G 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>305115</td><td>zur Verabreichung von paralytischer</td></tr><tr><td>Rollenklemme</td><td>World Precision Instrumente</td><td>14043-20</td><td>zur Einstellung der Flussrate von Anästhetikum in den Mund des Neunauges</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td>zur Vorbereitung von 0,9 % Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>V-förmiger Kunststoffständer als Probentisch</td><td>Sonderanfertigung</td><td>N/A</td><td>hält Neunauge während der EOG</td></tr><tr><td>Kunststofftrog</td><td>Sonderanfertigung</td><td>N/A</td><td>hält V-förmiges Kunststoffstativ während der EOG</td></tr><tr><td>Skalpellklingen - #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>für EOG-Dissektion</td></tr><tr><td>Skalpellgriff - #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>für EOG-Dissektion</td></tr><tr><td>Gerade ultrafeine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>für EOG-Dissektion, Dumont #5SF Pinzette</td></tr><tr><td>Gebogene ultrafeine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-42</td><td>für EOG-Dissektion, Moria MC40B</td></tr> Gerade <tr><td>Pringschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>für EOG-Dissektion</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Discovery V8</td><td>für EOG-Dissektion</td></tr><tr><td>Illuminator-Licht</td><td>Zeiss</td><td>CL 1500 ECO</td><td>für EOG-Dissektion</td></tr><tr><td>Kunststoffschlauch</td><td>Generisch</td><td></td><td>zum Anschluss von rezirkulierendem EOG-Setup und Wasserbädern</td></tr><tr><td>Odoriermittel-Förderschlauch Maßgeschneiderte</td><td>Anfertigung</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>In Leitungsfilter- und Dichtungssatz</td><td>Lee Company</td><td>TCFA1201035A</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatoren</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>zum Positionieren von Elektroden und Odormittelabgabe Kapillarrohr</td></tr><tr><td>Magnetische Haltevorrichtungen</td><td>Kanetec</td><td>MB-K</td><td></td></tr><tr><td>Ventiltreiber</td><td>Arduino</td><td>nach Maß,</td><td>um die Öffnung des Ventils zur Geruchsstimulation zu steuern</td></tr><tr><td>Elektromagnetisches Ventil</td><td>Lee Firma</td><td>LFAA1201618H</td><td>Ventil zur Geruchsstimulation</td></tr><tr><td>NeuroLog AC/DC Verstärker</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL106</td><td>zur Erhöhung der Amplitude des Atmungssignals</td></tr><tr><td>NeuroLog DC Vorverstärker mit Kopfstufe</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL102G</td><td>zur Erhöhung der Amplitude des elektrischen Signals</td></tr><tr><td>Tiefpassfilter 60 Hz</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL125</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>Axon Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Dell Computer (OptiPlex 745) mit Axoscope Datenerfassungssoftware</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>AxoScope Version 10.4</td><td></td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>Sonderanfertigung</td><td>N/A</td><td>Abschirmung gegen elektromagnetisches Rauschen</td></tr><tr><td>Zwei-Auswahl-Labyrinth</td><td>Sonderanfertigung</td><td>N/A</td><td>wasserdichtes Sperrholz in Marinequalität mit Kunststoffauskleidung überzogen</td></tr><tr><td>Müllpumpe</td><td>Honda</td><td>WT30XK4A</td><td>füllt das Labyrinth mit Wasser aus dem nahe gelegenen Fluss</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe mit Schlauch</td><td>Cole Parmer</td><td>Masterflex 07557-00</td><td>zur Verabreichung von Geruchsstoffen im Labyrinth</td></tr><tr><td>Inverter-Generator</td><td>Honda</td><td>EU1000i</td><td>treibt perstaltische Pumpe</td></tr><tr><td>an Entlassungskäfig</td><td>Sonderanfertigung</td><td>N/A</td><td>Wird verwendet, um Neunauge im Labyrinth zu akklimatisieren</td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Generisch</td><td></td><td>wird verwendet, um die Abmessungen des Labyrinths einzudämmen und Wasserturbulenzen mit Mesh-Rollen zu minimieren</td></tr><tr><td>Eimer (5 Gallonen)</td><td>Generisch</td><td></td><td>zum Mischen von Odorstoffen</td></tr><tr><td>Durchflussmesser</td><td>Marsh-McBirney</td><td>Flo-Mate 2000</td><td>zur Messung des Abflusses</td></tr><tr><td>XAD 7 HP Harz</td><td>Dow Chemikalie</td><td>37380-43-1</td><td>zur Extraktion von konditioniertem Wasser&nbsp;</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>zur Extraktion von konditioniertem Wasser</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Yamato</td><td>BM 200</td><td>zur Extraktion von konditioniertem Wasser&nbsp;</td></tr><tr><td>Gefriertrockner</td><td>Labconco</td><td>CentriVap Konzentrator</td><td>für die Extraktion von konditioniertem Wasser</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>CX1050</td><td>für die Isolierung von Fraktionspools</td></tr><tr><td>Kieselgel 70-230 mesh</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>für die Isolierung von Fraktionspools</td></tr><tr><td>Silica gel 230-400 mesh</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>für die Isolierung von Fraktionspools</td></tr><tr><td>Vorbeschichtetes Siliziumdioxid Gel-DC-Platten</td><td>Sigma</td><td>99571</td><td>für die Isolierung von Fraktionspools</td></tr><tr><td>Anisaldehyd</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td>für die Isolierung von Fraktionspools</td></tr><tr><td>Sephadex LH-20</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0090-01</td><td>für die Isolierung von Fraktionspools</td></tr><tr><td>Amberlite XAD 7 HP Harz</td><td>Sigma</td><td>XAD7HP</td><td>für die Extraktion von konditioniertem Wasser</td></tr><tr><td>4 Glassäulen mit einem Fassungsvermögen von 2,5 l</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>5820</td><td>für die Extraktion von konditioniertem Wasser&nbsp;</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>für die Extraktion von konditioniertem Wasser&nbsp;</td></tr><tr><td>TQ-S TOF LC Massenspektrometer (oder gleichwertig)</td><td>Waters Co.</td><td>N/A</td><td>für die Strukturaufklärung</td></tr><tr><td>Binäre HPLC-Pumpe</td><td>Waters Co.</td><td>1525</td><td>für die Isolierung von Fraktionspools/-verbindungen</td></tr><tr><td>Agilent NMR-Spektrometer, 900 MHz (oder gleichwertig)</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>für die Strukturaufklärung</td></tr><tr><td>Rotovap Trocknungssystem</td><td>Büchi</td><td>RII</td><td>für die Extraktion von konditioniertem Wasser&nbsp;</td></tr><tr><td>UV-Lampe (254 nm)</td><td>Spectronics Co.</td><td>ENF-240C</td><td>für die Dünnschichtchromatographie</td></tr></tbody></table>

die identifizierung von meerneunauge pheromone mit bioassay-geführte fraktionierung

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Bioassay-geführte Fraktionierung ist eine iterative Vorgehensweise, die die Ergebnisse der physiologischen und verhaltensbezogenen Bioassays verwendet, um die Isolierung und Identifizierung von einer aktiven Pheromon-Verbindung führen. Diese Methode führte in der erfolgreichen Charakterisierung der chemischen Signale dieser Funktion als Pheromone in einer Vielzahl von Tierarten. Meer Neunaugen setzen auf Geruchssinn, Pheromone zu erkennen, die Verhaltens- oder physiologische Reaktionen zu vermitteln. Wir nutzen dieses Wissen der Biologie der Fische, um Funktionen des vermeintlichen Pheromone zu postulieren und die Isolierung und Identifizierung von aktiven Pheromon-Komponenten führen. Chromatographie wird verwendet, um zu extrahieren, zu konzentrieren und Verbindungen aus dem konditionierten Wasser zu trennen. Elektro-Olfactogram (EOG) Aufnahmen werden durchgeführt, um festzustellen, welche Fraktionen olfaktorische Reaktionen hervorrufen. Zwei-Wahl Labyrinth Verhaltens Assays werden dann verwendet, um festzustellen, ob die duftenden Fraktionen auch verhaltensorientierte aktiv sind und eine Präferenz induzieren. Spektrometrische und spektroskopische Methoden bieten das Molekulargewicht und strukturelle Informationen gerne bei der Strukturaufklärung. Die Bioaktivität der reinen Verbindungen wird mit EOG und Verhaltensstörungen Assays bestätigt. Die Verhaltensreaktionen beobachtet im Labyrinth müssen letztlich in eine Feld-Einstellung, um ihre Funktion in einem natürlichen Bach Einstellung bestätigen überprüft werden. Diese Bioassays eine doppelte Rolle um 1) führen die Fraktionierung Prozess und (2) bestätigen und weiter zu definieren, die Bioaktivität der isolierte Komponenten. Hier berichten wir über die repräsentativen Ergebnisse einer Meerneunauge Pheromon-Identifikation, die exemplarisch für das Dienstprogramm des Bioassay-geführte Fraktionierung Ansatzes. Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone ist besonders wichtig, weil eine Modulation der Pheromon-Kommunikations-System unter den Optionen als invasive Meerneunauge im Laurentian Great Lakes zu kontrollieren ist. Diese Methode kann leicht angepasst werden der chemische Kommunikation in einer breiten Palette von Taxa zu charakterisieren und werfen Licht auf Wasserbasis Chemische Ökologie.

Ein Diagramm einer Zusammenfassung des Protokolls der Bioassay-geführte Fraktionierung beschriebenen Schritte ist in Abbildung 1dargestellt. Das Protokoll erfolgt in Schritten zu isolieren und zu charakterisieren, die Struktur, die olfaktorische Potenz und Verhaltensstörungen Tätigkeitsbereich 5 vermeintliche Meerneunauge Pheromone (Abbildung 2). Mit der Masse spektrometrische und NMR-Daten (Abbildung 3</stro...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu isolieren und zu charakterisieren, Struktur, olfaktorische Potenz und Verhaltensreaktion des vermeintlichen Pheromon Verbindungen der Meer Neunaugen.

Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone mit Bioassay-geführte Fraktionierung

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der chemischen Ökologie zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Pheromonen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie neuartige Verbindungen mit der Pheromonfunktion verknüpft. Um diese Prozedur zu beginnen, setzen Sie 15-30 geschlechtsreife männliche Meerneunaugen in ein Becken, das mit 250 Litern belüftetem Huronseewasser versorgt und bei 16-18 Grad Celsius gehalten wird.Um das konditionierte Wasser durch Festphasenextraktion zu extrahieren, wird es aus dem Tank über das Pumpsystem an die Spitze der Kolonne geleitet. Das Wasser fließt durch ein Bett aus zwei Kilogramm mäßig polarem, polymerem Ionenaustauscherharz, das in einer Reihe von vier Glassäulen mit einem Fassungsvermögen von einem Liter enthalten ist. Entfernen Sie anschließend das organische Lösungsmittel und ernten Sie den Extrakt durch Rotationsverdampfung für fünf Stunden unter reduziertem Druck bei 40 Grad Celsius.Um die Fraktionstümpel zu isolieren, weichen Sie das Kieselgel in der ersten mobilen Phase 30 Minuten lang ein. Übertragen Sie das Gel mit dem Lösungsmittel in eine Glassäule und öffnen Sie das Ventil, um die mobile Phase passieren zu lassen. Anschließend werden die Extrakte gründlich mit Kieselgel vermischt und in die Flüssigkeitschromatographiesäule über dem Kieselgelbett geladen.Eluieren Sie sie mit einem Gradienten von 95 % Chloroform zu Methanol zu 100 % Methanol, was zu einer Gesamtmenge von 2,5 Litern führt, und sammeln Sie dann das Eluent in einzelnen 10-Milliliter-Fläschchen. Führen Sie anschließend das DC-Experiment an vorbeschichteten Kieselgelplatten durch, indem Sie die Probe auf die Startlinie auftragen und die Startlinie der Platte in das sich entwickelnde Lösungsmittel in einem verschlossenen Glastank eintauchen. Nachdem das sich entwickelnde Lösungsmittel die Endlinie erreicht hat, nehmen Sie die Platte aus dem Tank und warten Sie 10 Minuten, bis das Lösungsmittel verdampft ist.Visualisieren Sie die Flecken, zuerst unter UV-Licht bei 254 Nanometern, und färben Sie dann die Platte, indem Sie sie mit einer sauren Methanollösung von 5 % Anisaldehyd mit einem Chromatographie-Sprühgerät besprühen und drei Minuten lang auf 85 Grad Celsius erhitzen. Anschließend wird die Fraktion durch Rotationsverdampfung unter reduziertem Druck bei 40 Grad Celsius für ca. 30 Minuten zu einem Rückstand konzentriert. Um die EOG-Aufzeichnung durchzuführen, füllen Sie die mit Silber-Silberchlorid-Pellets vorgefertigten Kapillarelektroden und die Festkörperelektrodenhalter mit einer Mikropipette mit dreimolarem Kaliumchlorid.Setzen Sie dann die gepolten Elektroden in die Elektrodenhalter ein. Als nächstes werden 100 Milliliter von 10 bis minus fünf molaren L-Arginin in mit Aktivkohle gefiltertem Wasser von einer 10 bis minus zwei molaren L-Arginin-Stammlösung in entionisiertem Wasser in einem Messkolben hergestellt. Bereiten Sie für die Konzentrationsreaktionskurve 10 Milliliter 10-fache Verdünnungen der Fraktionspools vor.Richten Sie nun ein betäubtes Neunauge in einem V-förmigen Ständer aus und wickeln Sie es mit einem nassen Papiertuch ein, um ein Austrocknen zu verhindern. Führen Sie ein Röhrchen mit zirkulierendem, belüftetem Wasser mit 50 Milligramm MS222 pro Liter in die Mundhöhle ein. Stellen Sie die Durchflussmenge ein und stellen Sie sicher, dass das Wasser über die Kiemenöffnungen austritt, um die Kiemen kontinuierlich zu bewässern.Spülen Sie den Odormittelförderschlauch mit gefiltertem Wasser und schließen Sie ihn an das an einem Mikromanipulator montierte Ventil an. Führen Sie als nächstes das Kapillarrohr der Odoriermittelabgabe in die Höhle des Riechepithels ein, um gefiltertes Wasser an das Riechepithel abzugeben und eine Austrocknung zu verhindern, wenn keine Odorierstoffe verabreicht werden. Montieren Sie dann die Aufzeichnungs- und Referenzelektroden an den Mikromanipulatoren.Senken Sie die Referenzelektrode auf die Außenhaut in der Nähe der Nasenlöcher ab. Senken Sie die Aufzeichnungselektrode mit dem stereoskopischen Mikroskop so ab, dass sie die Oberfläche des Riechepithels kaum berührt. Anschließend wird die Aufnahme des Odormittelabgaberohrs aus dem Hintergrund des gefilterten Wassers auf die 10 auf die minus fünf molare L-Arginin-Lösung übertragen.Schalten Sie den Computer, den Verstärker, den Filter und den Digitalisierer ein. Programmieren Sie mithilfe der Ventiltreibersoftware das Verfahren so, dass ein viersekündiger Einzelimpuls des Odoriermittels verabreicht wird, indem Sie das Kontrollkästchen von T1 aktivieren, T auf vier Sekunden einstellen und das Kontrollkästchen von aktivieren T2.In die Datenerfassungssoftware den Erfassungsmodus auf ein Hochgeschwindigkeitsoszilloskop einstellen. Klicken Sie auf das Play-Symbol und dann im Ventiltreiber auf Start, um den Odormittelimpuls auszulösen.Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Blindkontrolle, des L-Arginins und dann der Odormittel von niedrigen bis zu hohen Konzentrationen mit einer zweiminütigen Spülung mit gefiltertem Wasser zwischen den Anwendungen. Um verhaltensaktive Fraktionen zu identifizieren, akklimatisieren Sie das geschlechtsreife Weibchen des Meerneunauges fünf Minuten lang im Freilassungskäfig im Labyrinth. Lassen Sie das Meerneunauge frei und notieren Sie die kumulierte Zeit, die das Neunauge 10 Minuten lang in dem Versuchs- und Kontrollkanal verbringt, der jeweils Flusswasser enthält.Als nächstes wenden Sie den Testreiz an den zufällig zugewiesenen Versuchskanal im Fahrzeug an den Steuerkanal an, indem Sie Schlauchpumpen mit konstanten Raten von 200 Millilitern pro Minute für fünf Minuten verwenden, dann wenden Sie den Testreiz für weitere 10 Minuten im Fahrzeug an und zeichnen Sie die kumulative Zeitspanne auf, die das Neunauge in den Versuchs- und Kontrollkanälen verbringt. Bei diesem Verfahren werden die aktiven Fraktionen mit einer Sephadex LH-20-Säule mit Hilfe einer Sephadex LH-20-Säule weiter in Verbindungen aufgereinigt. Bereiten Sie die Probe in 0,5 Millilitern der ersten mobilen Phase vor, laden Sie sie in die Chloroform-Methanol-Säule und dann in die Methanolsäule und eluieren Sie die aktiven Fraktionen, um die Verbindung zu erhalten.Löse und verdünne die gereinigte Verbindung in der ersten mobilen Phase der HPLC, um eine 10-Mikroliter-Lösung von etwa einem Mikrogramm pro Milliliter zu bilden. Übertragen Sie anschließend die Probenlösung in die HPLC-Fläschchen und setzen Sie sie in den Autosampler der HPLC ein. Injizieren Sie die Probe in die Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie und zeichnen Sie die hochauflösenden Spektren der Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie mit einem Chromatographie-Massenspektrometer auf.Die Probe wird vollständig in den ausgewählten deuterierten Lösungsmitteln gelöst, um eine Lösung mit einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 Milligramm pro Milliliter zu bilden. Übertragen Sie die Probenlösung in ein NMR-Röhrchen, um die 1D- und 2D-NMR-Spektren auf einem 900-Megahertz-NMR-Spektrometer aufzuzeichnen. Hier ist ein 600-Megahertz-NMR-Spektrometer zu sehen.Fünf neue mutmaßliche Meerneunauge-Pheromone wurden identifiziert und ihre Strukturen mit spektrometrischen und spektroskopischen Methoden aufgeklärt. Diese mutmaßlichen Pheromone stimulierten das olfaktorische Epithel des adulten Meerneunauges und wiesen niedrige Nachweisschwellen in Elektro-Olfaktogramm-Aufzeichnungen auf. In den Verhaltensassays mit zwei Auswahlmöglichkeiten wurden weibliche Meerneunaugen von Petromyzone A, Petromyzene A und Petromyzene B angezogen und von Petromyzone C abgestoßen.Beim Versuch dieses interdisziplinären Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die chemischen und biologischen Experimente zu koordinieren, um dieses iterative Protokoll durchzuführen.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Röntgenkristallographie und Derivatisierungsreaktionen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Stereochemie der Verbindungen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern aus dem Bereich der Naturstoffe und der Neuroethologie den Weg, die plausible Biosynthese und biologische Funktion der Pheromone in Wasserorganismen wie dem Meerneunauge zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Chloroform äußerst gefährlich sein kann und dass beim Umgang mit diesem Reagenz immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Arbeiten in der Chemikalienhaube, das Tragen von Handschuhen und eine Schutzbrille.

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Forschung

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Verfahren schnell Bildschirm Wirtspflanze flüchtigen Stoffe durch Messung der elektrophysiologische Reaktion von erwachsenen Nabel orangeworm...

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