Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone mit Bioassay-geführte Fraktionierung

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der chemischen Ökologie zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Pheromonen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie neuartige Verbindungen mit der Pheromonfunktion verknüpft. Um diese Prozedur zu beginnen, setzen Sie 15-30 geschlechtsreife männliche Meerneunaugen in ein Becken, das mit 250 Litern belüftetem Huronseewasser versorgt und bei 16-18 Grad Celsius gehalten wird.

Um das konditionierte Wasser durch Festphasenextraktion zu extrahieren, wird es aus dem Tank über das Pumpsystem an die Spitze der Kolonne geleitet. Das Wasser fließt durch ein Bett aus zwei Kilogramm mäßig polarem, polymerem Ionenaustauscherharz, das in einer Reihe von vier Glassäulen mit einem Fassungsvermögen von einem Liter enthalten ist. Entfernen Sie anschließend das organische Lösungsmittel und ernten Sie den Extrakt durch Rotationsverdampfung für fünf Stunden unter reduziertem Druck bei 40 Grad Celsius.

Um die Fraktionstümpel zu isolieren, weichen Sie das Kieselgel in der ersten mobilen Phase 30 Minuten lang ein. Übertragen Sie das Gel mit dem Lösungsmittel in eine Glassäule und öffnen Sie das Ventil, um die mobile Phase passieren zu lassen. Anschließend werden die Extrakte gründlich mit Kieselgel vermischt und in die Flüssigkeitschromatographiesäule über dem Kieselgelbett geladen.

Eluieren Sie sie mit einem Gradienten von 95 % Chloroform zu Methanol zu 100 % Methanol, was zu einer Gesamtmenge von 2,5 Litern führt, und sammeln Sie dann das Eluent in einzelnen 10-Milliliter-Fläschchen. Führen Sie anschließend das DC-Experiment an vorbeschichteten Kieselgelplatten durch, indem Sie die Probe auf die Startlinie auftragen und die Startlinie der Platte in das sich entwickelnde Lösungsmittel in einem verschlossenen Glastank eintauchen. Nachdem das sich entwickelnde Lösungsmittel die Endlinie erreicht hat, nehmen Sie die Platte aus dem Tank und warten Sie 10 Minuten, bis das Lösungsmittel verdampft ist.

Visualisieren Sie die Flecken, zuerst unter UV-Licht bei 254 Nanometern, und färben Sie dann die Platte, indem Sie sie mit einer sauren Methanollösung von 5 % Anisaldehyd mit einem Chromatographie-Sprühgerät besprühen und drei Minuten lang auf 85 Grad Celsius erhitzen. Anschließend wird die Fraktion durch Rotationsverdampfung unter reduziertem Druck bei 40 Grad Celsius für ca. 30 Minuten zu einem Rückstand konzentriert. Um die EOG-Aufzeichnung durchzuführen, füllen Sie die mit Silber-Silberchlorid-Pellets vorgefertigten Kapillarelektroden und die Festkörperelektrodenhalter mit einer Mikropipette mit dreimolarem Kaliumchlorid.

Setzen Sie dann die gepolten Elektroden in die Elektrodenhalter ein. Als nächstes werden 100 Milliliter von 10 bis minus fünf molaren L-Arginin in mit Aktivkohle gefiltertem Wasser von einer 10 bis minus zwei molaren L-Arginin-Stammlösung in entionisiertem Wasser in einem Messkolben hergestellt. Bereiten Sie für die Konzentrationsreaktionskurve 10 Milliliter 10-fache Verdünnungen der Fraktionspools vor.

Richten Sie nun ein betäubtes Neunauge in einem V-förmigen Ständer aus und wickeln Sie es mit einem nassen Papiertuch ein, um ein Austrocknen zu verhindern. Führen Sie ein Röhrchen mit zirkulierendem, belüftetem Wasser mit 50 Milligramm MS222 pro Liter in die Mundhöhle ein. Stellen Sie die Durchflussmenge ein und stellen Sie sicher, dass das Wasser über die Kiemenöffnungen austritt, um die Kiemen kontinuierlich zu bewässern.

Spülen Sie den Odormittelförderschlauch mit gefiltertem Wasser und schließen Sie ihn an das an einem Mikromanipulator montierte Ventil an. Führen Sie als nächstes das Kapillarrohr der Odoriermittelabgabe in die Höhle des Riechepithels ein, um gefiltertes Wasser an das Riechepithel abzugeben und eine Austrocknung zu verhindern, wenn keine Odorierstoffe verabreicht werden. Montieren Sie dann die Aufzeichnungs- und Referenzelektroden an den Mikromanipulatoren.

Senken Sie die Referenzelektrode auf die Außenhaut in der Nähe der Nasenlöcher ab. Senken Sie die Aufzeichnungselektrode mit dem stereoskopischen Mikroskop so ab, dass sie die Oberfläche des Riechepithels kaum berührt. Anschließend wird die Aufnahme des Odormittelabgaberohrs aus dem Hintergrund des gefilterten Wassers auf die 10 auf die minus fünf molare L-Arginin-Lösung übertragen.

Schalten Sie den Computer, den Verstärker, den Filter und den Digitalisierer ein. Programmieren Sie mithilfe der Ventiltreibersoftware das Verfahren so, dass ein viersekündiger Einzelimpuls des Odoriermittels verabreicht wird, indem Sie das Kontrollkästchen von T1 aktivieren, T auf vier Sekunden einstellen und das Kontrollkästchen von aktivieren T2.In die Datenerfassungssoftware den Erfassungsmodus auf ein Hochgeschwindigkeitsoszilloskop einstellen. Klicken Sie auf das Play-Symbol und dann im Ventiltreiber auf Start, um den Odormittelimpuls auszulösen.

Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Blindkontrolle, des L-Arginins und dann der Odormittel von niedrigen bis zu hohen Konzentrationen mit einer zweiminütigen Spülung mit gefiltertem Wasser zwischen den Anwendungen. Um verhaltensaktive Fraktionen zu identifizieren, akklimatisieren Sie das geschlechtsreife Weibchen des Meerneunauges fünf Minuten lang im Freilassungskäfig im Labyrinth. Lassen Sie das Meerneunauge frei und notieren Sie die kumulierte Zeit, die das Neunauge 10 Minuten lang in dem Versuchs- und Kontrollkanal verbringt, der jeweils Flusswasser enthält.

Als nächstes wenden Sie den Testreiz an den zufällig zugewiesenen Versuchskanal im Fahrzeug an den Steuerkanal an, indem Sie Schlauchpumpen mit konstanten Raten von 200 Millilitern pro Minute für fünf Minuten verwenden, dann wenden Sie den Testreiz für weitere 10 Minuten im Fahrzeug an und zeichnen Sie die kumulative Zeitspanne auf, die das Neunauge in den Versuchs- und Kontrollkanälen verbringt. Bei diesem Verfahren werden die aktiven Fraktionen mit einer Sephadex LH-20-Säule mit Hilfe einer Sephadex LH-20-Säule weiter in Verbindungen aufgereinigt. Bereiten Sie die Probe in 0,5 Millilitern der ersten mobilen Phase vor, laden Sie sie in die Chloroform-Methanol-Säule und dann in die Methanolsäule und eluieren Sie die aktiven Fraktionen, um die Verbindung zu erhalten.

Löse und verdünne die gereinigte Verbindung in der ersten mobilen Phase der HPLC, um eine 10-Mikroliter-Lösung von etwa einem Mikrogramm pro Milliliter zu bilden. Übertragen Sie anschließend die Probenlösung in die HPLC-Fläschchen und setzen Sie sie in den Autosampler der HPLC ein. Injizieren Sie die Probe in die Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie und zeichnen Sie die hochauflösenden Spektren der Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie mit einem Chromatographie-Massenspektrometer auf.

Die Probe wird vollständig in den ausgewählten deuterierten Lösungsmitteln gelöst, um eine Lösung mit einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 Milligramm pro Milliliter zu bilden. Übertragen Sie die Probenlösung in ein NMR-Röhrchen, um die 1D- und 2D-NMR-Spektren auf einem 900-Megahertz-NMR-Spektrometer aufzuzeichnen. Hier ist ein 600-Megahertz-NMR-Spektrometer zu sehen.

Fünf neue mutmaßliche Meerneunauge-Pheromone wurden identifiziert und ihre Strukturen mit spektrometrischen und spektroskopischen Methoden aufgeklärt. Diese mutmaßlichen Pheromone stimulierten das olfaktorische Epithel des adulten Meerneunauges und wiesen niedrige Nachweisschwellen in Elektro-Olfaktogramm-Aufzeichnungen auf. In den Verhaltensassays mit zwei Auswahlmöglichkeiten wurden weibliche Meerneunaugen von Petromyzone A, Petromyzene A und Petromyzene B angezogen und von Petromyzone C abgestoßen.Beim Versuch dieses interdisziplinären Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die chemischen und biologischen Experimente zu koordinieren, um dieses iterative Protokoll durchzuführen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Röntgenkristallographie und Derivatisierungsreaktionen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Stereochemie der Verbindungen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern aus dem Bereich der Naturstoffe und der Neuroethologie den Weg, die plausible Biosynthese und biologische Funktion der Pheromone in Wasserorganismen wie dem Meerneunauge zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Chloroform äußerst gefährlich sein kann und dass beim Umgang mit diesem Reagenz immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Arbeiten in der Chemikalienhaube, das Tragen von Handschuhen und eine Schutzbrille.