Name: Photometrische Bestimmung des Cyanobakteriums Synechocystis Phycobiliprotein Inhalt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Erfahren Sie die photometrische Bestimmung von Phycobiliproteinen im Cyanobakterium Synechocystis. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Phycocyanin und Allophycocyanin für Produktivitätsstudien.

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Das Protokoll wurde von einer früheren Veröffentlichung11angenommen. T. Z. D. ch. und J. Č. wurden gefördert durch das Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik im Rahmen des nationalen Programms Nachhaltigkeit ich (NPU ich), Nummer LO1415 zu gewähren. J. Č. wurde auch von GA CR, Grant-Nummer 18-24397S unterstützt. Zugang zu Instrumenten und anderen Einrichtungen wurde von der Tschechischen Forschungsinfrastruktur für Systembiologie C4SYS unterstützt (Projekt keine LM2015055). M. A. S. wurde durch einen Zuschuss aus der russischen Science Foundation [Nr. 14-14-00904] unterstützt.

(1) Cyanobakterien Anbau

<ol><li>Synechocystis Zellen im Erlenmeyerkolben oder in Photobioreaktoren10,19 in gepufferten BG11 Medium20 einen pH-Wert von &lt; 10 (z. B.mit 17 mM HEPES10) weiterhin zu pflegen. Hinweis: Standard Anbaubedingungen erfordern einen kontrollierten Temperatur (30 ° C, die optimale Temperatur ist in der Regel 35 ° C)21, Beleuchtung (in der Regel ein weißes Licht mit einer Intensität bis zu 800 µmol [Photonen] / [m2·s])21und ein CO 2 Lieferung (in der 400-mL-Flachbildschirm-Photobioreaktor ist das Wachstum Sättigung CO2 -Konzentration 1.700 ppm)21.</li>
	<li>Um die Kultur-Dichte zu bestimmen, Messen Sie die Kultur optische Dichte spektralphotometrisch bei 730 nm (OD730) mit einer Küvette mit einer Schichtdicke von 1 cm. Alternativ zählen die Zellen unter dem Mikroskop mit einer Hemocytometer oder einer automatisierten Zelle Zähler.</li>
</ol>2. Proben-Vorbereitung
<ol><li>Arbeiten Sie unter niedrigen Bestrahlungsstärke, Phycobiliprotein Abbau zu verhindern.</li>
	<li>3 x 1 mL Suspension Kultur zu Safe-Lock Tubes zu ernten. Verwenden Sie Triplicates für die Schätzung von technischen Fehlern bei der Messung. Um die Kultur-Probenahme unter sterilen Bedingungen durchzuführen, Ernten Sie die Zellen in einer laminaren Kapuze und folgen Sie die richtigen Arbeits- und Praktiken.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen im Labor Temperatur 5 min. Achten Sie auf die ausgewogene Zentrifuge Rotor 15.000 X g . Verwerfen Sie nach Zentrifugation die Überstände. Achten Sie darauf, nicht zu stören das Pellet.</li>
	<li>Setzen Sie die Proben in einer Tiefkühltruhe. Halten Sie für die langfristige Lagerung die Proben bei-80 ° C. Dies ist notwendig, Phycobiliprotein Abbau zu verhindern. Für kurzfristige Lagerung ist-20 ° C ausreichend.</li>
	<li>Gefriertrocknen Sie die Proben über Nacht. Für einen richtigen Gefriertrocknung Prozess halten die Temperatur des Kondensators Einfrieren-Trockner unter-60 ° C und der Druck in der Freeze-Trockner Kammer ca. 1 hPa.</li>
	<li>Schließen Sie nach Beendigung des Gefriertrocknung Zyklus den Schlauch so bald wie möglich auf die Resorption von Wasser aus der Luft zu verhindern.</li>
</ol>3. Handy-Homogenisierung und Pigmente Extraktion
<ol><li>Jede Probenröhrchen vier Stücke von Glasperlen (mit einem Durchmesser von 2 mm) hinzu und schließen Sie die Rohre. Hinweis: Wenn der Deckel der Safe-Lock-Röhre zur Homogenisierung zu dünn ist, kann es während der Homogenisierung zu brechen; Daher sind nur Safe-Lock Röhren mit starken Deckeln für dieses Protokoll empfohlen.</li>
	<li>Homogenisieren der Proben mit den Glasperlen für 15 s auf einem Homogenisator bei Labor-Temperatur. Hinweis: Eine richtig homogenisierte Probe breitet sich über die ganze innere Fläche der Safe-Lock-Röhren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL PBS-Puffer (pH-Wert 7,4), bis 4 ° C, um die Proben um Phycobiliproteins extrahieren vorgekühlt. Hinweis: Halten Sie von diesem Schritt auf die Proben auf Eis, um den Abbau der extrahierten Proteine zu verhindern. Dies ist kritisch.</li>
	<li>Mischen Sie die Proben mit PBS für 5 s auf den Homogenisator bei Labor-Temperatur. Hinweis: Nach dem Mischen sind die Proben grünlich.</li>
	<li>Nach dem Mischen, halten Sie den Proben auf Eis für 60 min. Abdeckung das Eisbad mit einem Deckel zu Pigmenten Abbau zu verhindern.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie nach 60 min Phycobiliprotein Extraktion die Proben bei 15.000 X g bei 4 ° C für 5 min. Achten Sie darauf, die Zentrifuge Rotor richtig auszugleichen. Hinweis: Nach der Zentrifugation des Überstands hat eine Cyan blaue Farbe.</li>
</ol>4. Phycobiliprotein Quantifizierung
<ol><li>Kalibrieren Sie bevor die photometrische Messung Spektralphotometer zur Grundlinie mit PBS-Puffer als Rohling.</li>
	<li>Nach der Kalibrierung Spektralphotometer verwerfen die PBS von einem Spektrofotometer Küvetten und pipette des Überstands mit extrahierten Phycobiliproteins statt mit dem ausrangierten Puffer.</li>
	<li>Quantifizierung die Phycobiliprotein Konzentration spektrophotometrisch, mit einer Spaltbreite von 0,5 nm.<ol>
<li>Messen Sie die Absorption von Phycocyanobilins in Phycocyanin und Allophycocyanin gegen die PBS-Puffer leer bei 615 nm (ein615) und 652 nm (eine652), bzw., und Messen Sie die Absorption der zelltrümmer bei 720 nm (A720).</li>
		<li>Berechnen Sie die Konzentration von Phycocyanin und Allophycocyanin nach den Gleichungen (1) und (2) von Bennett und Bogorad12: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq2.jpg"> Hinweis: Eine615, eine652und ein720 sollte auf den Bereich der linearen Absorption des Spektralphotometers passen. Falls notwendig, verdünnen Sie die Probe mit PBS-Puffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Neuberechnung der Pigmentkonzentration in die original-Samples. Die Pigmentkonzentration in der Probe entspricht direkt mit den Ergebnissen der Gleichungen (1) und (2) bei 1 mL Kultur und 1 mL des Puffers Extraktion für die Analyse verwendet werden. Bei der Verwendung von unterschiedlichen Mengen von Cyanobakterien Proben und/oder PBS-Puffer, sollte die endgültige Pigmentkonzentration gemäß Gleichung (3) berechnet werden: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq3.jpg">(3) Hinweis: Im Falle einer Normalisierung Phycobiliprotein Inhalte pro Zelle Trockengewicht, die endgültige Pigmentkonzentration berechnet werden soll nach Gleichung (4)<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq4.jpg"> (4)</li>
</ol>5. Ermittlung der Zelle Trockengewicht (Optional)
<ol><li>Analysenwaagen belasten Sie drei Safe-Lock-Leerhülsen. Achtung: Es ist wichtig, dass die Safe-Lock-Rohre trocken sind. Trocknen Sie bei Lagerung der Rohre in einer feuchten Umgebung die Rohre für mehrere Stunden in eine Gefriertrocknungsanlage vor dem wiegen sie. Manipulieren Sie die Rohre vorsichtig und nur mit puderfreien Handschuhen, jeglichen Kontakt zwischen dem Material und der Forscher Finger zu vermeiden. Halten Sie alle Inhaber und Zentrifugieren Sie sauber, um die Übertragung von Material an den Rohren zu vermeiden.</li>
	<li>Probe 1 x 15 mL Kultur Suspension für 15 mL konische Rohr.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Kultur-Suspension in den 15 mL konische Röhrchen bei 4.000 X g bei Labor Temperatur 10 min. Gleichgewicht der Zentrifuge Rotor mit drei zusätzlichen 15 mL konische Röhrchen, jedes mit 15 mL Wasser. Verwerfen Sie nach Zentrifugation 12 mL des Überstands.</li>
	<li>Aufschwemmen der Pellets im restlichen überstand und 3 x 1 mL des Gemisches auf drei 1,5 mL-Safe-Lock-Röhren mit einer Pipette übertragen. Für den Fall, dass einige Reste des Geschosses in der 15 mL konische Röhre bleiben, fügen Sie 1,5 mL entionisiertem Wasser zum konischem Rohr, Wirbel oder schütteln das Rohr auf die verbleibenden Aufschwemmen pellet und transfer 3 x 0,5 mL des Gemisches an den drei 1,5 mL-Safe-Lock-Rohren (bereits Containi hinzu 3 x 1 mL des Pellet-ng) mit einer Pipette. Hinweis: Aufteilung der Pellets über drei 1,5 mL-Safe-Lock-Rohre wird die Schätzung eines technischen Fehlers der Trockengewicht Messung ermöglichen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den Zellen in 1,5 mL-Safe-Lock-Röhren bei 15.000 X g bei Labor Temperatur 5 min. Balance des Zentrifuge Rotors mit einem zusätzlichen 1,5 mL Safe-Lock-Rohr, das enthält 1 mL Wasser. Verwerfen Sie nach der Zentrifugation die Überstände.</li>
	<li>Legen Sie die Proben in den Gefrierschrank. Halten Sie für die langfristige Lagerung die Proben bei-80 ° C; für die kurzfristige Speicherung ist-20 ° C ausreichend.</li>
	<li>Gefriertrocknen Sie die Proben über Nacht. Für einen richtigen Gefriertrocknung Prozess halten die Temperatur der Freeze Trockner Kondensator unter-90 ° C und der Druck in der Freeze-Trockner Kammer ca. 1 hPa.</li>
	<li>Schließen Sie nach Gefriertrocknung die Rohre und Analysenwaagen belasten Sie Proben. Hinweis: Der Trockengewicht Wert kann für die Normalisierung des Phycobiliprotein Inhalts pro Zelle Trockengewicht verwendet werden.</li>
</ol>

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</ol>

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Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, schnelle und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der Phycobiliprotein Inhalt in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Verschiedene Methoden der Zelle Homogenisierung, Proteingewinnung und Phycocyanin und Allophycocyanin Quantifizierung werden verglichen und das endgültige Protokoll stellt eine Kombination der optimalen Schritte jedes einzelnen Verfahrens. Als repräsentative Daten wurde der Inhalt des Phycobiliproteins in Synechocystis Zellen unter E...

fPhycobiliproteins sind wasserlösliche Pigment-Protein-komplexe, die Hauptkomponenten des Licht-ernten Antennen in prokaryotic Cyanobacteria (Cyanophyta) und mehrere eukaryotischen Taxa (Glaucophyta, Rhodophyta darstellen , und Cryptophyta)1. Sie kommen hauptsächlich als supramolekulare komplexe Phycobilisomes genannt und sie hängen in der Regel an die Oberfläche der photosynthetischen Membranen auf der Stromale Seite, mit Ausnahme von Cryptophyta, wo die Phycobiliproteins, in lokalisiert sind der Thylakoidmembran Lumen2. Vier Arten von Phycobiliproteins wurden auf dem neuesten Stand: die Kern-Allophycocyanin und die peripheren Phycocyanin, Phycoerythrin und Phycoerythrocyanin1. Als die wichtigsten lichtsammelkomplexe repräsentieren Phycobilisomes eines der entscheidenden Faktoren der Algen und Cyanobakterien massenkulturen Produktivität. Es wurde nachgewiesen, dass diese Phycobilisomes Abschneiden Biomasse Akkumulation unter starkem Licht3verbessern kann. Auf der anderen Seite führte unter bescheidenen oder niedrigen Bestrahlungsstärke, die Antenne Abschneiden Wachstumsraten und Biomasse Akkumulation Reduktion3,4. Phycobiliproteins dienen im Handel als Lebensmittel-Farbstoffe, Pharma und Lebensmittel-Zusatzstoffe in der kosmetischen Industrie sowie Fluoreszenz Sonden mit Anwendungen in der Durchflusszytometrie, fluoreszierende Immunoassays und Fluoreszenz-Mikroskopie-5.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die quantitative Bestimmung der Phycobiliproteins in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Cyanobakterien sind die frühesten sauerstoffhaltige photosynthetischen Autotrophe; Sie haben die Biosphäre der Erde für mehr als 2,4 Milliarden Jahren6gebildet. Sie spielen eine entscheidende Rolle im globalen biogeochemischen Kreisläufe von Stickstoff, Kohlenstoff, Sauerstoff und anderen Elementen. Unter den Cyanobakterien, eine einzellige Sorte Synechocystis eine Alleinstellung gewonnen, da war es die erste Cyanobakterium mit dem gesamten Genom sequenziert7,8, ist es natürlich umwandelbar durch exogene DNA-9, und Es führt stabil und relativ schnelles Wachstum10,11. In Synechocystis, die Kernkomponente Antenne Allophycocyanin, die integraler Membranproteine zugeordnet ist und die beigefügten Phycocyanin befindet sich an der Thylakoidmembran Membran Peripherie.
Mehrere Methoden zur Phycobiliprotein Extraktion und Quantifizierung werden in diesem Protokoll verglichen. Die endgültige Extraktionsverfahren wurde erfolgreich Synechocystissowie andere Cyanobakterien Stämme, einschließlich Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira eingesetzt. SP., und Nostoc SP., und es wurde auch erfolgreich auf Rotalgen Porphyridium Cruentumangewendet. Daher kann die Methode entwickelt, die in diesem Protokoll als eine universelle Methode für die Extraktion von Phycobiliprotein betrachtet werden. Obwohl einige der getesteten Extraktionsmethoden Gesamtprotein Ertragssteigerungen geführt, die hier beschrieben Extraktionsverfahren vorausgesetzt ergibt sich die höchste Phycobiliprotein zusammen mit dem niedrigsten Inhalt von Chlorophyll ein Rückstand in der Phycobiliprotein zu extrahieren. Reduzierung des Gehalts an Chlorophyll ein war entscheidend für die richtige Phycocyanin und Allophycocyanin spektralfotometrische Quantifizierung.
Die Phycobiliprotein Absorptionsspektren können variieren erheblich zwischen den verschiedenen Algen und Cyanobakterien Arten12,13,14,15,16,17 und sogar unter mehrere Stämme von einem einzigen Cyanobakterien Gattung18. Daher sind die spezifischen Wellenlängen und Absorption Koeffizienten zur Bestimmung von Phycocyanin und Allophycocyanin in Synechocystis verwendet nicht allgemein anwendbar auf andere Stämme. Darüber hinaus bietet Synechocystis keine Phycoerythrin und Phycoerythrocyanin, die in einigen anderen Algen und Cyanobakterien gefunden werden können. Für die Zwecke der Bestimmung der Phycobiliproteins Stämme als Synechocystisempfiehlt es sich, die photometrische Gleichungen für jede Belastung individuell zu bewerten.
Obwohl das Protokoll länger zweistufig (über Nacht von der zellulären Pellets und 1 Stunde Proteingewinnung Gefriertrocknung) enthält, ist die gesamte Arbeitszeit für die Quantifizierung der Phycobiliproteins nicht länger als 2 Stunden.

<table><tbody><tr><td>PCC 6803</td><td>Institut Pasteur, Paris, Frankreich</td><td>6803</td><td>Cyanobakterienstamm</td></tr><tr><td>Roti-CELL PBS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>9143.1</td><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock-Röhrchen&nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburk, Deutschland</td><td>30120086</td><td>Safe-Lock Röhrchen 1,5 ml</td></tr><tr><td>VWR 80-Platz Aufbewahrungssystem</td><td>VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA</td><td>30128-282</td><td>Halterung für Safe-Lock Röhrchen&nbsp;</td></tr><tr><td>RAININ 100 & micro; L -1000 &Mikro; l&nbsp;</td><td>Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA</td><td>17014382</td><td>Pipette</td></tr><tr><td>GP-LTS-A-1000&micro; L-/F-768/8</td><td>Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA</td><td>30389272</td><td>Pipettenspitzen</td></tr><tr><td>Rotina 420R</td><td>Hettich, Kirchlengern, Deutschland</td><td>4701</td><td>Kühlzentrifuge für 1,5 ml Safe-Lock-Röhrchen und 15 ml konische Zentrifugenröhrchen</td></tr><tr><td>LCexv 4010</td><td>Liebherr, Bulle, Schweiz</td><td>9005382197172</td><td>Kühl- und Gefrierschrank -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Revco ExF -86°; C Aufrechter Ultratiefkühlschrank</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>EXF24086V&nbsp;</td><td>Gefrierschrank -80&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>CoolSafe</td><td>LaboGene, Liller&oslash; d, Dänemark</td><td>7.001.000.615</td><td>Gefriertrockner&nbsp;</td></tr><tr><td>UV-2600</td><td>Shimadzu, Kyoto, Japan</td><td>UV-2600</td><td>Spektralphotometer&nbsp;</td></tr><tr><td>Hellma Absorptionsküvetten, semi Micro</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>Z600288&nbsp;</td><td>VIS/UV-VIS Semi-Mikroküvetten 0,75-1,5 ml, Spektralbereich 200-2500 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Silamat S6</td><td>Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein</td><td>602286WU</td><td>Homogenisator&nbsp;</td></tr><tr><td>Festglasperlen</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>Z273627</td><td>Glasperlen mit dem Durchmesser 2&nbsp; mm</td></tr><tr><td>CPA225D-0CE</td><td>Sartorius AG, G&ouml; ttingen, Deutschland</td><td>SECURA225D-1OBR</td><td>Analysenwaagen</td></tr><tr><td>C-Phycocyanin von Spirulina sp.&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>P2172</td><td>Phycocyanin Standard</td></tr><tr><td>Allophycocyanin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>A7472</td><td>Allophycocyanin Standard</td></tr><tr><td>Bicinchoninsäure Kit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>BCA1, B9643</td><td>Komplettkit für die Bestimmung von Gesamtproteinen</td></tr><tr><td>AlgaeTron&nbsp;</td><td>Photon System Instruments Ltd., Dr&aacute; sov, Tschechische Republik</td><td>AG 130-ECO&nbsp;</td><td>Kultivierungskammer für E.-Kolben, mit steuerbarem Licht und Atmosphäre</td></tr><tr><td>Photobioreaktor</td><td>Photon System Instruments Ltd., Dr&aacute; sov, Tschechische Republik</td><td>FMT-150</td><td>Kultivierungsanlage für Cyanobakterien und Algen mit vollständig kontrollierbarer Umgebung</td></tr><tr><td>Cellometer&nbsp;</td><td>Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA</td><td>Auto M10</td><td>Zellzähler</td></tr><tr><td>Corning 15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>CLS430791&nbsp;</td><td>15 ml Zentrifugenröhrchen für die Probenahme mit trockenem Gewicht</td></tr><tr><td>Herasafe KS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>51024579</td><td>Laminar-Strömungshaube</td></tr></tbody></table>

photometrische bestimmung des cyanobakteriums synechocystis phycobiliprotein inhalt

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Dies ist ein einfaches Protokoll für die quantitative Bestimmung der Phycobiliprotein Inhalt in das Modell cyanobakteriums Synechocystis. Phycobiliproteins sind die wichtigsten Komponenten des Phycobilisomes, das großen Licht-ernten Antennen in Cyanobakterien und einige Algen Taxa. Die Phycobilisomes Synechocystis enthalten zwei Phycobiliproteins: Phycocyanin und Allophycocyanin. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, effiziente, und zuverlässige Methode zur quantitativen Bestimmung von Phycocyanin und Allophycocyanin in diesem Modell Cyanobakterium. Wir haben mehrere Methoden der Phycobiliprotein Extraktion und spektralphotometrische Quantifikation verglichen. Extraktionsverfahren wie in diesem Protokoll beschrieben wurde auch erfolgreich auf andere Cyanobakterien Stämme wie Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., angewendet. und Nostoc SP., Rotalgen Porphyridium Cruentum. Jedoch die vom Aussterben bedroht-Koeffizienten der spezifischen Phycobiliproteins aus verschiedenen Taxa können unterschiedlich sein und es empfiehlt daher, die photometrische Quantifizierungsmethode für jede einzelne Belastung individuell zu validieren. Das Protokoll erfordert nur geringen Zeitaufwand und kann in jedem standard Life-Science-Labor durchgeführt werden, da es nur standard-Ausrüstung erfordert.

Für die erste Methode Tests Synechocystis wurde angebaut als Batch-Kulturen im Erlenmeyerkolben auf einen Shaker in BG11 Anbau mittleren20 (ergänzt mit 17 mM HEPES) bei 25 ° C, unter ein warmweißes Licht mit einer Intensität von 50 µmol (Photonen) / (m 2·s) und mit 1 % CO2 in der Kultivierung Atmosphäre. Während des Anbaus der Kulturen wurden zu Safe-Lock Tubes abgetastet und zentrifugiert (15.000 X g bei Labor Temperatur für...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Phycobiliprotein Inhalt in cyanobakteriums Synechocystis eine photometrische Methode quantitativ zu bestimmen. Extraktionsverfahren wurde auch erfolgreich auf andere Cyanobakterien und Algen Stämme angewendet; jedoch aufgrund von Variationen in Pigment Absorptionsspektren ist es notwendig, die photometrische Gleichungen für jede Belastung individuell zu testen.

Photometrische Bestimmung des Cyanobakteriums Synechocystis Phycobiliprotein Inhalt

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, den Gehalt an Phycobiliproteinen im Modell-Cyanobakterium Synechocystis mit Hilfe einer spektrophotometrischen Methode quantitativ zu bestimmen. Phycobiliproteine sind wasserlösliche Pigment-Protein-Komplexe, die Hauptbestandteile der lichtsammelnden Antennen in prokaryotischen Cyanobakterien und mehreren Gruppen eukaryotischer Algen darstellen. Da sie die wichtigsten lichtsammelnden Komplexe sind, stellen Phycobiliproteine einen der entscheidenden Faktoren dar, die die Produktivität von Algen und Cyanobakterien bestimmen.Synechocystis ist ein Modell-Cyanobakterium, das in Hunderten von Laboratorien weltweit eingesetzt wird. Synechocystis enthält zwei Phycobiliproteine, Phycocyanin und Allophycocyanin. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, effiziente und zuverlässige Methode zur quantitativen Bestimmung beider Phycobiliproteine in diesem Schimmelpilzstamm.Wir haben verschiedene Methoden, die Extraktion von Phycobiliproteinen und die spektrophotometrische Quantifizierung, verglichen. Die Quantifizierungsmethode muss für jeden einzelnen Stamm getestet werden, da die Absorptionsspektren von Phycobiliproteinen zwischen verschiedenen Stämmen variieren können. Zu Beginn der Extraktion von Phycobiliproteinen wird ein Milliliter Cyanobakterienkultur in ein Safe-Lock-Röhrchen überführt.Wenn Sie sich entscheiden, das Trockengewicht der Proben zu bestimmen, wiegen Sie die leeren Röhrchen vor der Kulturprobenahme. Achten Sie darauf, dass die Kultur nicht sedimentiert ist. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 15.000 g bei Labortemperatur.Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Stellen Sie die Proben in den Gefrierschrank.Bewahren Sie die Proben für die Langzeitlagerung bei 80 Grad Celsius auf. Dies ist notwendig, um den Abbau von Phycobiliproteinen zu verhindern. Sobald die Proben eingefroren sind, geben Sie sie in den Gefriertrockner.Sobald die Gefriertrocknung begonnen hat, überprüfen Sie die Temperatur und den Druck am Gefriertrockner. Die Temperatur muss unter 60 Grad Celsius liegen und der Druck muss etwa einen Hektar Pascal betragen. Trocknen Sie die Proben über Nacht.Nach Beendigung des Gefriertrocknungszyklus schließen Sie die Rohre so schnell wie möglich, um eine erneute Aufnahme von Wasser aus der Luft zu verhindern. Geben Sie vier Stück mit zwei Milliliter Glasperlen in jedes Probenröhrchen. Homogenisieren Sie die Proben mit den Glasperlen für 15 Sekunden.Die ordnungsgemäß homogenisierte Probe wird über die gesamte Innenfläche der Safe-Lock-Röhrchen verteilt. Nach der Homogenisierung der Zellen wird den Proben ein Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung zugesetzt, um die Phycobiliproteine zu extrahieren. Der optimale pH-Wert des PBS liegt bei etwa 7,4.Mischen Sie die Zellen mit dem PBS für fünf Sekunden auf dem Homogenisator. Dies gewährleistet eine optimale Probenmischung für eine effiziente Extraktion von Phycobiliproteinen. Nach dem Mischen sind die Proben grünlich.Bewahren Sie die Proben 60 Minuten lang auf Eis auf, um die effizienteste Extraktion von Phycobiliproteinen zu gewährleisten. Nach der Extraktion zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 15.000 g und vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation hat der Überstand eine cyanblaue Farbe.Kalibrieren Sie vor der spektrophotometrischen Messung das Spektralphotometer mit dem PBS als Rohling. Sobald das Spektralphotometer kalibriert ist, verwerfen Sie PBS aus einer Spektralphotometerküvette und pipettieren Sie den Überstand mit extrahierten Phycobiliproteinen anstelle des verworfenen Puffers. Für die Phycocyanin- und Allophycocyanin-Quantifizierung wird der Überstand mit extrahierten Phycobiliproteinen bei 615, 652 und 720 Nanometern gemessen.Wie im Text beschrieben, gibt es mehrere Gleichungen für die Quantifizierung von Phycobilisomen, die in der Literatur bekannt sind. Es wurde festgestellt, dass die in diesem Protokoll verwendete Gleichung die Phycocyanin- und Allophycocyanin-Konzentrationen am besten mit den Pigmenten und Punkten korreliert. Kritische Schritte des Protokolls sind die Homogenisierung und Extraktion der Zellen, die sowohl eine hohe Ausbeute als auch eine hohe Spezifität bieten sollten.Wir haben verschiedene Extraktionsverfahren getestet, wie z. B. den Zellaufschluss durch Beschallung, die Homogenisierung mit Zirkonoxidkügelchen oder das Einfrieren von Zellverbindungen. Die Methode aus diesem Protokoll lieferte die höchste Ausbeute an Phycobilisomen. Da bereits eine geringe Kontamination des Proteinextrakts durch Chlorophyll zu einer Überschätzung des Phycobiliproteingehalts führen kann, ist es notwendig, jegliche Chlorophyllextraktion aus den Zellen zu vermeiden.Wir haben Chlorophyll im Rohextrakt nachgewiesen und dann die Beschallung zur Zellaufspaltung eingesetzt. Mit sich wiederholenden Ultraschallzyklen stieg die Chlorophyllkonzentration an. Die Homogenisierungszeit wurde auf 15 Sekunden optimiert.Die Homogenisierung sowohl für fünf Sekunden als auch für 20 Sekunden führte zu etwas geringeren Ausbeuten. Die Zugabe von Natrium- oder Kaliumchlorid zum PBS-Puffer oder zu Wasser erhöhte die Extraktionseffizienz der Phycobiliproteine nicht, genau wie die Extraktion in Natriumacetatpuffer. Die Extraktionszeit der Phycobiliproteine wurde auf 60 Minuten optimiert, da sich die Konzentration der Phycobiliproteine nach 120 und sogar 240 Minuten nicht signifikant veränderte.Stellen Sie sicher, dass die Extinktion bei 615, 652 und 720 Nanometern in den nahen Absorptionsbereich des Spektralphotometers passt. Das in diesem Protokoll verwendete Spektralphotometer zeigt den nahen Absorptionsbereich zwischen 0,1 und drei. Wir haben mehrere Gleichungen zur spektrophotometrischen Quantifizierung von Phycobiliproteinen verglichen, die aus der Literatur bekannt sind.Die Gleichung von Bennett und Bogorad lieferte die beste Rekonstruktion sowohl des Phycocyanin- als auch des Allophycocyanin-Gehalts in den Pigmentstandards mit bekannten Proteinkonzentrationen. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Gleichungen hängen mit Variationen in den Extinktionskoeffizienten der Phycobiliproteine des jeweiligen Organismus zusammen. Die Verwendung von Streptomycinsulfat führte nicht zu einer Reduktion von Chlorophyll A in Proben, bei denen Ultraschall angewendet oder vermieden wurde.Als repräsentative Daten haben wir den Gehalt an Phycobiliproteinen in Synechocystis-Zellen bestimmt. Der Gehalt an Phycobiliproteinen nahm bei zunehmendem Licht ab. Das Protokoll wurde entwickelt, um den Zeit- und Geräteaufwand für die schriftliche Pigmentanalyse, die in jedem Standard-Live-Science-Labor durchgeführt werden kann, zu minimieren.Darüber hinaus enthält das Protokoll zwei weitere Schritte, wie z. B. die Gefriertrocknung des Zellpellets und die Extraktion von Proteinen. Die Gesamtarbeitszeit für die Quantifizierung der Phycobilisomen beträgt nicht länger als zwei Stunden.

spectrophotometric-determination-phycobiliprotein-content

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Quelle: Weber, N. et. al., Natürliche Transformation, Proteinexpression und Kryokonservierung des filamentösen Cyanobakteriums Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt einen fokussierten LED-basierten Assay zur Untersuchung von Phototaxis in filamentösen Cyanobakterien. Die Bakterien wandern in Richtung der Lichtquelle und bilden eine dichte Anhäufung im beleuchteten Zentrum, die durch eine Pixelintensitätsanalyse des aufgenommenen Bildes visualisiert und quantifiziert wird.

Phototaxis-Assay von filamentösen Cyanobakterien mittels fokussierter Lichtbeleuchtung

Quelle: Jiang, H., Ho, M. Isolierung und Charakterisierung von intaktem Phycobilisom in Cyanobakterien. J. Vis. Exp.(2021).Dieses Video zeigt das Verfahren zur Kultivierung von Cyanobakterien zur Gewinnung von Biomasse durch Züchtung von Zellen unter kontinuierlicher Beleuchtung mit Kohlendioxidzufuhr und nährstoffreichen Bedingungen, gefolgt von der Ernte durch Zentrifugation.

Vorbereitung der Cyanobakterienkultur für die Biomasseproduktion

Quelle: Zhan, Y., et al. Photobleaching ermöglicht eine Superauflösungsbildgebung des FtsZ-Rings im Cyanobacterium prochlorococcus. J. Vis. Exp. (2018).Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Photobleachung von Pigmenten in cyanobakteriellen Zellen unter Verwendung von Xenonlicht unter kalten Bedingungen, um die Fluoreszenzbildgebung wachstumsregulierender Proteine zu verbessern.

Photobleaching cyanobakterieller Pigmente zur Bildgebung wachstumsregulierender Proteine

Hier stellen wir einen zuverlässigen und einfachen Assay vor, um den Glykogengehalt in Cyanobakterienzellen zu messen. Das Verfahren beinhaltet die Ausfällung, die selektierbare Depolymerisation und den Nachweis von Glukoseresten. Diese Methode eignet sich sowohl für Wildtyp- als auch für gentechnisch veränderte Stämme und kann das metabolische Engineering von Cyanobakterien erleichtern.

Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien

Hier beschreiben wir eine Immunofluoreszenz-Methode, um die Autofluoreszenz der Cyanobakterien zu reduzieren. Nach Immunofluoreszenz wird stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie verwendet, um dreidimensionale Höchstauflösung Bilder der Cyanobakterien FtsZ Ring zu erhalten.

Immunofluoreszenz ermöglicht Höchstauflösung Bildgebung des FtsZ Ring in Cyanobacterium Prochlorococcus

Hier werden Protokolle zur Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und zur Isolierung ihrer Exoproteome beschrieben. Beide Verfahren verkörpern wichtige Schritte zur Gewinnung von Polymeren oder Proteinen mit hohen Reinheitsgraden, die für weitere Analysen oder Anwendungen verwendet werden können. Sie können auch einfach an die spezifischen Benutzerbedürfnisse angepasst werden.

Blick nach außen: Isolierung von cyanobakteriellen freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Isolierung von Phycobilisomen aus Cyanobakterien durch Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten. Die Fraktionen intakter Phycobilisomen werden durch 77K-Fluoreszenzemissionsspektrum und SDS-PAGE-Analyse bestätigt. Die resultierenden Phycobilisom-Fraktionen eignen sich für die negative Färbung von TEM und die massenspektrometrische Analyse.

Isolierung und Charakterisierung intakter Phycobilisomen in Cyanobakterien

Das vorliegende Protokoll beschreibt die schrittweise Autofluoreszenz-Bildgebung und Bewertung von Phycobiliprotein-Veränderungen in Rotalgen auf der Grundlage einer Spektralanalyse. Dies ist eine markierungsfreie und zerstörungsfreie Methode, um die zelluläre Anpassung an extreme Lebensräume zu bewerten, wenn nur knappes Material verfügbar ist und Zellen unter Laborbedingungen langsam oder gar nicht wachsen.

Autofluoreszenz-Bildgebung zur Bewertung der Rotalgenphysiologie

Die Adsorption von Peptiden an Kunststoffwaren während herkömmlicher spitzenbasierter serieller Verdünnungen kann die Wirksamkeitsbestimmung erheblich beeinflussen und das Verständnis der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen verwirren, die für die Leitstrukturidentifizierung und Leitstrukturoptimierungsphasen der Wirkstoffforschung verwendet werden. Hier werden Verfahren zur automatisierten akustischen berührungslosen seriellen Verdünnung von Peptidproben beschrieben.

Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

Peptid-Konkurrenz-Assays sind weit verbreitet in einer Vielzahl von molekularen und immunologischen Experimenten verwendet. Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode für einen in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay und die damit verbundenen Validierungsverfahren, die nützlich sein können, um spezifische Phosphorylierungsstellen zu finden.

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Erfahren Sie die photometrische Bestimmung von Phycobiliproteinen im Cyanobakterium Synechocystis. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Phycocyanin und Allophycocyanin für Produktivitätsstudien.

Photometrische Bestimmung des Cyanobakteriums Synechocystis Phycobiliprotein Inhalt

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