Photometrische Bestimmung des Cyanobakteriums Synechocystis Phycobiliprotein Inhalt

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, den Gehalt an Phycobiliproteinen im Modell-Cyanobakterium Synechocystis mit Hilfe einer spektrophotometrischen Methode quantitativ zu bestimmen. Phycobiliproteine sind wasserlösliche Pigment-Protein-Komplexe, die Hauptbestandteile der lichtsammelnden Antennen in prokaryotischen Cyanobakterien und mehreren Gruppen eukaryotischer Algen darstellen. Da sie die wichtigsten lichtsammelnden Komplexe sind, stellen Phycobiliproteine einen der entscheidenden Faktoren dar, die die Produktivität von Algen und Cyanobakterien bestimmen.

Synechocystis ist ein Modell-Cyanobakterium, das in Hunderten von Laboratorien weltweit eingesetzt wird. Synechocystis enthält zwei Phycobiliproteine, Phycocyanin und Allophycocyanin. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, effiziente und zuverlässige Methode zur quantitativen Bestimmung beider Phycobiliproteine in diesem Schimmelpilzstamm.

Wir haben verschiedene Methoden, die Extraktion von Phycobiliproteinen und die spektrophotometrische Quantifizierung, verglichen. Die Quantifizierungsmethode muss für jeden einzelnen Stamm getestet werden, da die Absorptionsspektren von Phycobiliproteinen zwischen verschiedenen Stämmen variieren können. Zu Beginn der Extraktion von Phycobiliproteinen wird ein Milliliter Cyanobakterienkultur in ein Safe-Lock-Röhrchen überführt.

Wenn Sie sich entscheiden, das Trockengewicht der Proben zu bestimmen, wiegen Sie die leeren Röhrchen vor der Kulturprobenahme. Achten Sie darauf, dass die Kultur nicht sedimentiert ist. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 15.000 g bei Labortemperatur.

Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Stellen Sie die Proben in den Gefrierschrank.

Bewahren Sie die Proben für die Langzeitlagerung bei 80 Grad Celsius auf. Dies ist notwendig, um den Abbau von Phycobiliproteinen zu verhindern. Sobald die Proben eingefroren sind, geben Sie sie in den Gefriertrockner.

Sobald die Gefriertrocknung begonnen hat, überprüfen Sie die Temperatur und den Druck am Gefriertrockner. Die Temperatur muss unter 60 Grad Celsius liegen und der Druck muss etwa einen Hektar Pascal betragen. Trocknen Sie die Proben über Nacht.

Nach Beendigung des Gefriertrocknungszyklus schließen Sie die Rohre so schnell wie möglich, um eine erneute Aufnahme von Wasser aus der Luft zu verhindern. Geben Sie vier Stück mit zwei Milliliter Glasperlen in jedes Probenröhrchen. Homogenisieren Sie die Proben mit den Glasperlen für 15 Sekunden.

Die ordnungsgemäß homogenisierte Probe wird über die gesamte Innenfläche der Safe-Lock-Röhrchen verteilt. Nach der Homogenisierung der Zellen wird den Proben ein Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung zugesetzt, um die Phycobiliproteine zu extrahieren. Der optimale pH-Wert des PBS liegt bei etwa 7,4.

Mischen Sie die Zellen mit dem PBS für fünf Sekunden auf dem Homogenisator. Dies gewährleistet eine optimale Probenmischung für eine effiziente Extraktion von Phycobiliproteinen. Nach dem Mischen sind die Proben grünlich.

Bewahren Sie die Proben 60 Minuten lang auf Eis auf, um die effizienteste Extraktion von Phycobiliproteinen zu gewährleisten. Nach der Extraktion zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 15.000 g und vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation hat der Überstand eine cyanblaue Farbe.

Kalibrieren Sie vor der spektrophotometrischen Messung das Spektralphotometer mit dem PBS als Rohling. Sobald das Spektralphotometer kalibriert ist, verwerfen Sie PBS aus einer Spektralphotometerküvette und pipettieren Sie den Überstand mit extrahierten Phycobiliproteinen anstelle des verworfenen Puffers. Für die Phycocyanin- und Allophycocyanin-Quantifizierung wird der Überstand mit extrahierten Phycobiliproteinen bei 615, 652 und 720 Nanometern gemessen.

Wie im Text beschrieben, gibt es mehrere Gleichungen für die Quantifizierung von Phycobilisomen, die in der Literatur bekannt sind. Es wurde festgestellt, dass die in diesem Protokoll verwendete Gleichung die Phycocyanin- und Allophycocyanin-Konzentrationen am besten mit den Pigmenten und Punkten korreliert. Kritische Schritte des Protokolls sind die Homogenisierung und Extraktion der Zellen, die sowohl eine hohe Ausbeute als auch eine hohe Spezifität bieten sollten.

Wir haben verschiedene Extraktionsverfahren getestet, wie z. B. den Zellaufschluss durch Beschallung, die Homogenisierung mit Zirkonoxidkügelchen oder das Einfrieren von Zellverbindungen. Die Methode aus diesem Protokoll lieferte die höchste Ausbeute an Phycobilisomen. Da bereits eine geringe Kontamination des Proteinextrakts durch Chlorophyll zu einer Überschätzung des Phycobiliproteingehalts führen kann, ist es notwendig, jegliche Chlorophyllextraktion aus den Zellen zu vermeiden.

Wir haben Chlorophyll im Rohextrakt nachgewiesen und dann die Beschallung zur Zellaufspaltung eingesetzt. Mit sich wiederholenden Ultraschallzyklen stieg die Chlorophyllkonzentration an. Die Homogenisierungszeit wurde auf 15 Sekunden optimiert.

Die Homogenisierung sowohl für fünf Sekunden als auch für 20 Sekunden führte zu etwas geringeren Ausbeuten. Die Zugabe von Natrium- oder Kaliumchlorid zum PBS-Puffer oder zu Wasser erhöhte die Extraktionseffizienz der Phycobiliproteine nicht, genau wie die Extraktion in Natriumacetatpuffer. Die Extraktionszeit der Phycobiliproteine wurde auf 60 Minuten optimiert, da sich die Konzentration der Phycobiliproteine nach 120 und sogar 240 Minuten nicht signifikant veränderte.

Stellen Sie sicher, dass die Extinktion bei 615, 652 und 720 Nanometern in den nahen Absorptionsbereich des Spektralphotometers passt. Das in diesem Protokoll verwendete Spektralphotometer zeigt den nahen Absorptionsbereich zwischen 0,1 und drei. Wir haben mehrere Gleichungen zur spektrophotometrischen Quantifizierung von Phycobiliproteinen verglichen, die aus der Literatur bekannt sind.

Die Gleichung von Bennett und Bogorad lieferte die beste Rekonstruktion sowohl des Phycocyanin- als auch des Allophycocyanin-Gehalts in den Pigmentstandards mit bekannten Proteinkonzentrationen. Die Unterschiede zwischen den einzelnen Gleichungen hängen mit Variationen in den Extinktionskoeffizienten der Phycobiliproteine des jeweiligen Organismus zusammen. Die Verwendung von Streptomycinsulfat führte nicht zu einer Reduktion von Chlorophyll A in Proben, bei denen Ultraschall angewendet oder vermieden wurde.

Als repräsentative Daten haben wir den Gehalt an Phycobiliproteinen in Synechocystis-Zellen bestimmt. Der Gehalt an Phycobiliproteinen nahm bei zunehmendem Licht ab. Das Protokoll wurde entwickelt, um den Zeit- und Geräteaufwand für die schriftliche Pigmentanalyse, die in jedem Standard-Live-Science-Labor durchgeführt werden kann, zu minimieren.

Darüber hinaus enthält das Protokoll zwei weitere Schritte, wie z. B. die Gefriertrocknung des Zellpellets und die Extraktion von Proteinen. Die Gesamtarbeitszeit für die Quantifizierung der Phycobilisomen beträgt nicht länger als zwei Stunden.