Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen
16. November 2018
Dieses Protokoll beschreibt der Transienten Gentechnik zahnmedizinische Stammzellen aus der menschlichen zahnmedizinische Follikel extrahiert. Die angewandte nicht-viralen Modifikation Strategie kann eine Grundlage für die Verbesserung der therapeutischen Stammzellen Produkte geworden.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Regenerativen Medizin zu beantworten, wie z. B. wo ein menschlicher Zahnfollikel Stammzellen gentechnisch verändert werden könnte, um ihre therapeutischen Eigenschaften zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Stammzellen durch die Einführung von microRNA ohne die Gefahr einer stabilen Genomintegration modifiziert werden können. Beginnen Sie das Verfahren zur enzymatischen Verdauung der beiden Follikel, durch Vorerwärmung auf Raumtemperatur, menschliche Zahnfollikel Stammzelle oder hDFSC Kulturmedium und PBSPSG-Lösung.
Thaw ein aliquot jede von Collagenase Typ I und Dispase II Aktienlösungen. Bereiten Sie eine Verdauungslösung vor, indem Sie 500 Mikroliter der Lagerlösung Kollagenase Typ I und 500 Mikroliter der Dispase II-Lagerlösung auf 4 Milliliter Basal Medium mit 1% Antibiotika enthalten. Um eine Kontamination der Standorte während der menschlichen Zahnfollikel-Stammzellisolation zu vermeiden, müssen Waschpuffer und verwendete Kulturmedien Antibiotika enthalten.
Legen Sie einen extrahierten Zahnfollikel in eine sterile Petrischale. Fügen Sie 10 Milliliter PBSPSG-Lösung hinzu, um das extrahierte Gewebe zu waschen. Aspirieren und entsorgen Sie die Lösung und fügen Sie frische PBSPSG-Lösung hinzu, um die Wäsche zu wiederholen.
Mit einem sterilen Skalpell zerkleinern Sie den extrahierten Follikel in Stücke, wenn etwa 1 mal 1 Millimeter. Das Hackfleisch und die PBSPSG-Lösung aus der Petrischale in ein 50-Milliliter-Konzentrigerohr geben, die Petrischale mit 10 Milliliter PBSPSG-Lösung waschen und in ein und dasselbe Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 353 x g bei Raumtemperatur für zehn Minuten.
5 Milliliter Verdauungslösung in das palettenGewebe geben, die Lösung und das Gewebe vorsichtig mischen, die Mischung bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 in einem Schüttelinkubator für zwei Stunden inkubieren. Nach zwei Stunden zentrifugieren Sie die verdaute Zelle und Gewebesuspension bei 353 g für zehn Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie die erhaltene Palette in 6 MilliliterHDSC-Kulturmedium wieder auf.
Säen Sie die Zellsuspension in einem 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben, und brüten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Nach der Zellernte und Charakterisierung von HDFSC ist wie im Textprotokoll beschrieben, Samen hDFSCs in einer 24 Well-Zell-Kulturplatte. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 und 20% Sauerstoff für 24 Stunden.
Am folgenden Tag 40 Picomole von microRNA in 66,7 Mikroliter reduziertem Serummedium verdünnen und die Lösung wirbeln. Verdünnen Sie 0,67 Mikroliter kationisches Lipid-basiertes Transfektionsreagenz in 66,7 Mikroliter reduziertem Serummedium, Wirbel der Lösung und inkubieren Bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach fünf Minuten die vorverdünnte microRNA in das vorverdünnte Transfektionsreagenz geben, die Lösung mischen und bei Raumtemperatur 15 Minuten brüten.
Als nächstes fügen Sie die vorbereiteten Transfektionskomplexitäten tropfenweise direkt zum Kulturmedium auf Zellen hinzu. Mischen Sie sanft, indem Sie die 24 Brunnenzellkulturplatte hin und her schaukeln. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden.
24 Stunden nach der Transfektion den Überstand der Proben in den jeweiligen 15 Milliliter-Konifugenrohren sammeln. Waschen Sie die Zellen mit 1 Milliliter PBS und übertragen Sie die PBS in das jeweilige Zentrifugenrohr. Fügen Sie 500 Mikroliter Tropf und EDTA in die Zellen, und brüten die 24 Brunnenplatte bei 37 Grad Celsius, für 3 Minuten.
Beenden Sie die Trypsinisierung, indem Sie 1 Milliliter Zellkulturmedium für die Zellen hinzufügen und die Lösung in das jeweilige Zentrifugenrohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g und 4 Grad Celsius für zehn Minuten. Von hier aus halten Sie die Zellen und Reagenzien auf Eis, sofern nicht anders angegeben.
Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter Neinen Desstrich wieder auf und übertragen Sie die Zelllösung in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 0,5 Milliliter Amin-Reaktivfarbstoff zu jeder Probe hinzu, um zwischen lebenden und abgestorbenen Zellen zu unterscheiden. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, und brüten bei 4 Grad Celsius für zehn Minuten.
Fügen Sie 1 Milliliter PBS zu den Zellen hinzu, und Zentrifuge bei 300g und 4 Grad Celsius für zehn Minuten Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter PBS wieder auf, fügen Sie 33 Mikroliter Paraformaldehyd hinzu und mischen Sie die Lösungen, speichern Sie die Proben bei 4 Grad Celsius, geschützt vor Licht, bis zytometrische Messungen durch den Fluss. Übertragen Sie die Proben in Röhren, die für zytometrische Durchflussmessungen geeignet sind, und führen Sie die Durchflusszytometrie mithilfe der im Textprotokoll beschriebenen Gating-Strategie durch. Die isolierten menschlichen Zahnfollikelstammzellen zeigten alle für die Definition mesenchymaler Stromalzellen beschriebenen Eigenschaften, Zellen waren kunststoffhaft und zeigten eine Glasfaser-ähnliche Morphologie unter Standardkulturbedingungen.
Die zytometrische Analyse des Flusses ergab, dass hDFSCs ein Panel mit bestimmten Oberflächenantigenen exprimiert haben, einschließlich CD29, CD44, CD73, CD90 und CD105. Während CD45 und CD117 fehlten. Die adipogenen, osteogenen und chondrogenen Differenzierungspotenziale von Zellen unter spezifischen In-Vitro-Kulturbedingungen wurden durch Immunfärbung, ein Fettsäure-Bindendes Protein für:Osteocalcin und Aggrecan, bestätigt.
Die Gating-Strategie für die Quantifizierung der Zytotoxizität und Cy3 markiert microRNA Aufnahme Effizienz 24 Stunden nach der Transfektion, bestätigte microRNA Aufnahme in 100% der lebensfähigen Zellen. Vergleichbare Mengen abgestorbener Zellen in transfizierten und untransfizierten Proben deuten darauf hin, dass microRNA effizient ohne zytotoxische Wirkungen eingeführt wird. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Transdifferenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Cytolab Plastizität zu beantworten.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die transiente genetische Modifikation von dentalen Stammzellen, die aus dem menschlichen Dentalfollikel gewonnen wurden. Die Methode ermöglicht die Veränderung der Stammzellen durch die Einführung von Mikro-RNAs, ohne die Risiken einer stabilen genomischen Integration.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Regenerativen Medizin
- Stammzellbiologie
Hintergrund
- Menschliche dentalfollikuläre Stammzellen (hDFSC) haben therapeutische Anwendungsmöglichkeiten.
- Die genetische Veränderung kann die Eigenschaften dieser Stammzellen verbessern.
- Nichtvirale Modifikationsstrategien sind sicherere Alternativen zu herkömmlichen Methoden.
Zweck der Studie
- Untersuchung der genetischen Modifikation humaner dentaler Stammzellen (hDFSC) zur Verbesserung therapeutischer Ergebnisse.
- Entwicklung eines Protokolls zur transienten Modifikation dentaler Stammzellen.
Verwendete Methoden
- Enzymatische Verdauung von Zahlfollikeln.
- Zubereitung der Verdauungslösung mit Kollagenase Typ I und Dispase II.
- Verwendung von Antibiotika in Waschpuffern und Kulturmedien zur Verhinderung von Kontaminationen.
- Einführung von Mikro-RNA für eine vorübergehende genetische Modifikation.
Hauptergebnisse
- Es wurde eine erfolgreiche transiente Modifikation von hDFSC erreicht.
- Die Methode zeigte Sicherheit, da eine stabile Genomintegration vermieden wurde.
- Es wurden verbesserte therapeutische Eigenschaften der Stammzellen beobachtet.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll bietet eine Grundlage zur Verbesserung von Stammzelltherapien.
- Die transiente genetische Veränderung kann ein vielversprechender Ansatz in der regenerativen Medizin sein.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die transiente genetische Modifikation menschlicher dentaler Follikel-Stammzellen mittels microRNA, ohne eine stabile Genomintegration vorzunehmen, wodurch ein zentrales Sicherheitsanliegen bei stammzellbasierten Therapien adressiert wird. Der Ansatz unterstützt die präklinische Risikominimierung, indem er eine funktionelle Validierung therapeutischer Verbesserungen vor der Transplantation erlaubt. Es stellt eine skalierbare, nicht-virale Methode bereit, um die Wirksamkeit von Stammzellen für Anwendungen in der regenerativen Medizin zu optimieren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Untersuchung von microRNA-vermittelten Wegen beim Verhalten von Stammzellen und deren Differenzierungspotential.
- Operativer Wert: Bietet eine zuverlässige Methode zur Modulation des Stammzellphänotyps ohne genomische Veränderung und unterstützt so die hypothesenbasierte Validierung von Zielstrukturen.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Beurteilung des therapeutischen Wirkmechanismus durch vorübergehende phänotypische Veränderungen und verbessert die Zuverlässigkeit bei der Auswahl aussichtsreicher Kandidaten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, transfectionsbereite Stammzellpopulationen für konsistente Screening-Untersuchungen von Wirkstoffen oder Modulatoren.
- Operativer Wert: Ermöglicht quantifizierbare Nachweise zum Aufnahmeverhalten von Mikro-RNAs und zur Zellviabilität mittels Durchflusszytometrie und damit die Reproduzierbarkeit von Assays zwischen verschiedenen Laboren.
- Skalierbarkeit: Verwendet eine kationische Lipidtransfektion, die mit Mehrbradenplattenformaten für Screening-Workflows mit mittlerer Durchsatzleistung kompatibel ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Unterstützt den Übergang von isolierten Stammzellen zu funktionell modifizierten Zellen für präklinische Wirksamkeitstests.
- Mechanistische Entwederung: Ermöglicht die Bewertung der Auswirkungen von Mikro-RNAs auf die Stammzellfunktion, ohne Bedenken hinsichtlich insertionaler Mutagenese.
- Krankheitsrelevante Systemplattform: Nutzt das postnatale Zahnläppchen als leicht zugängliche Quelle für multipotente Stammzellen mit hohem Proliferationspotenzial zur Modellierung der Gewebe-Reparatur.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein, indem sie einen vorübergehenden Modifikationsschritt nach der Isolierung und Charakterisierung von Stammzellen ermöglicht und so eine funktionelle Optimierung vor nachgeschalteten Anwendungen erlaubt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zum Schicksal und Verhalten von Stammzellen durch kontrollierte Einführung von Mikro-RNAs.
- Screening: Ermöglicht die standardisierte Herstellung von Stammzellen zur Bewertung genetischer oder pharmakologischer Modulatoren in Mehrfach-Well-Formaten.
- Analytik: Bietet eine durchflusszytometrische Quantifizierung der Transfektionseffizienz und Zytotoxizität und unterstützt so einen objektiven Vergleich der Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Isolierung von Stammzellen mit der präklinischen Validierung, indem modifizierte Zellen mit erhöhtem therapeutischem Potenzial erzeugt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Transfektionsplattform, die auf verschiedene Stammzelltypen und Mikro-RNA-Kandidaten anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert die Vorhersagegenauigkeit bei Stammzelltherapeutika, indem vorübergehende, reversible Modulation der Genexpression ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Bietet eine sichere, effiziente und reproduzierbare, nicht-virale Transfektionsmethode mit minimalen zytotoxischen Effekten.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien, indem die präklinische Bewertung von Wirkmechanismen ohne Gefahren durch genomische Integration ermöglicht wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Stammzellkandidaten durch funktionelle Validierung vor Studien zur Zulassungsvorbereitung (IND-enabling studies).
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur von Stammzellen, der enzymatischen Gewebedissoziation und Transfektionstechniken.
- Benötigt Zugang zu Schüttelinkubatoren, Durchflusszytometern und der standardmäßigen Infrastruktur für die Zellkultur.
- Erfordert die Standardisierung der Transfektionsreagenzien-Verhältnisse und Inkubationszeiten zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Erfordert die Anpassung der Mikro-RNA-Dosierung und der Transfektionsbedingungen je nach Herkunft oder Art der Stammzellen.
- Auf vorübergehende Effekte beschränkt; nicht geeignet für Anwendungen, die eine stabile genetische Modifikation erfordern.
