Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen
November 16th, 2018
Dieses Protokoll beschreibt der Transienten Gentechnik zahnmedizinische Stammzellen aus der menschlichen zahnmedizinische Follikel extrahiert. Die angewandte nicht-viralen Modifikation Strategie kann eine Grundlage für die Verbesserung der therapeutischen Stammzellen Produkte geworden.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Regenerativen Medizin zu beantworten, wie z. B. wo ein menschlicher Zahnfollikel Stammzellen gentechnisch verändert werden könnte, um ihre therapeutischen Eigenschaften zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Stammzellen durch die Einführung von microRNA ohne die Gefahr einer stabilen Genomintegration modifiziert werden können. Beginnen Sie das Verfahren zur enzymatischen Verdauung der beiden Follikel, durch Vorerwärmung auf Raumtemperatur, menschliche Zahnfollikel Stammzelle oder hDFSC Kulturmedium und PBSPSG-Lösung.
Thaw ein aliquot jede von Collagenase Typ I und Dispase II Aktienlösungen. Bereiten Sie eine Verdauungslösung vor, indem Sie 500 Mikroliter der Lagerlösung Kollagenase Typ I und 500 Mikroliter der Dispase II-Lagerlösung auf 4 Milliliter Basal Medium mit 1% Antibiotika enthalten. Um eine Kontamination der Standorte während der menschlichen Zahnfollikel-Stammzellisolation zu vermeiden, müssen Waschpuffer und verwendete Kulturmedien Antibiotika enthalten.
Legen Sie einen extrahierten Zahnfollikel in eine sterile Petrischale. Fügen Sie 10 Milliliter PBSPSG-Lösung hinzu, um das extrahierte Gewebe zu waschen. Aspirieren und entsorgen Sie die Lösung und fügen Sie frische PBSPSG-Lösung hinzu, um die Wäsche zu wiederholen.
Mit einem sterilen Skalpell zerkleinern Sie den extrahierten Follikel in Stücke, wenn etwa 1 mal 1 Millimeter. Das Hackfleisch und die PBSPSG-Lösung aus der Petrischale in ein 50-Milliliter-Konzentrigerohr geben, die Petrischale mit 10 Milliliter PBSPSG-Lösung waschen und in ein und dasselbe Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 353 x g bei Raumtemperatur für zehn Minuten.
5 Milliliter Verdauungslösung in das palettenGewebe geben, die Lösung und das Gewebe vorsichtig mischen, die Mischung bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 in einem Schüttelinkubator für zwei Stunden inkubieren. Nach zwei Stunden zentrifugieren Sie die verdaute Zelle und Gewebesuspension bei 353 g für zehn Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie die erhaltene Palette in 6 MilliliterHDSC-Kulturmedium wieder auf.
Säen Sie die Zellsuspension in einem 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben, und brüten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Nach der Zellernte und Charakterisierung von HDFSC ist wie im Textprotokoll beschrieben, Samen hDFSCs in einer 24 Well-Zell-Kulturplatte. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 und 20% Sauerstoff für 24 Stunden.
Am folgenden Tag 40 Picomole von microRNA in 66,7 Mikroliter reduziertem Serummedium verdünnen und die Lösung wirbeln. Verdünnen Sie 0,67 Mikroliter kationisches Lipid-basiertes Transfektionsreagenz in 66,7 Mikroliter reduziertem Serummedium, Wirbel der Lösung und inkubieren Bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach fünf Minuten die vorverdünnte microRNA in das vorverdünnte Transfektionsreagenz geben, die Lösung mischen und bei Raumtemperatur 15 Minuten brüten.
Als nächstes fügen Sie die vorbereiteten Transfektionskomplexitäten tropfenweise direkt zum Kulturmedium auf Zellen hinzu. Mischen Sie sanft, indem Sie die 24 Brunnenzellkulturplatte hin und her schaukeln. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden.
24 Stunden nach der Transfektion den Überstand der Proben in den jeweiligen 15 Milliliter-Konifugenrohren sammeln. Waschen Sie die Zellen mit 1 Milliliter PBS und übertragen Sie die PBS in das jeweilige Zentrifugenrohr. Fügen Sie 500 Mikroliter Tropf und EDTA in die Zellen, und brüten die 24 Brunnenplatte bei 37 Grad Celsius, für 3 Minuten.
Beenden Sie die Trypsinisierung, indem Sie 1 Milliliter Zellkulturmedium für die Zellen hinzufügen und die Lösung in das jeweilige Zentrifugenrohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g und 4 Grad Celsius für zehn Minuten. Von hier aus halten Sie die Zellen und Reagenzien auf Eis, sofern nicht anders angegeben.
Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter Neinen Desstrich wieder auf und übertragen Sie die Zelllösung in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 0,5 Milliliter Amin-Reaktivfarbstoff zu jeder Probe hinzu, um zwischen lebenden und abgestorbenen Zellen zu unterscheiden. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, und brüten bei 4 Grad Celsius für zehn Minuten.
Fügen Sie 1 Milliliter PBS zu den Zellen hinzu, und Zentrifuge bei 300g und 4 Grad Celsius für zehn Minuten Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter PBS wieder auf, fügen Sie 33 Mikroliter Paraformaldehyd hinzu und mischen Sie die Lösungen, speichern Sie die Proben bei 4 Grad Celsius, geschützt vor Licht, bis zytometrische Messungen durch den Fluss. Übertragen Sie die Proben in Röhren, die für zytometrische Durchflussmessungen geeignet sind, und führen Sie die Durchflusszytometrie mithilfe der im Textprotokoll beschriebenen Gating-Strategie durch. Die isolierten menschlichen Zahnfollikelstammzellen zeigten alle für die Definition mesenchymaler Stromalzellen beschriebenen Eigenschaften, Zellen waren kunststoffhaft und zeigten eine Glasfaser-ähnliche Morphologie unter Standardkulturbedingungen.
Die zytometrische Analyse des Flusses ergab, dass hDFSCs ein Panel mit bestimmten Oberflächenantigenen exprimiert haben, einschließlich CD29, CD44, CD73, CD90 und CD105. Während CD45 und CD117 fehlten. Die adipogenen, osteogenen und chondrogenen Differenzierungspotenziale von Zellen unter spezifischen In-Vitro-Kulturbedingungen wurden durch Immunfärbung, ein Fettsäure-Bindendes Protein für:Osteocalcin und Aggrecan, bestätigt.
Die Gating-Strategie für die Quantifizierung der Zytotoxizität und Cy3 markiert microRNA Aufnahme Effizienz 24 Stunden nach der Transfektion, bestätigte microRNA Aufnahme in 100% der lebensfähigen Zellen. Vergleichbare Mengen abgestorbener Zellen in transfizierten und untransfizierten Proben deuten darauf hin, dass microRNA effizient ohne zytotoxische Wirkungen eingeführt wird. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Transdifferenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Cytolab Plastizität zu beantworten.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt die transiente genetische Veränderung von Zahnstammzellen, die aus dem menschlichen Zahnfollikel extrahiert wurden. Die Methode ermöglicht die Modifikation von Stammzellen durch die Einführung von MikroRNA ohne die Risiken, die mit einer stabilen Genomintegration verbunden sind.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Regenerative Medizin
- Stammzellbiologie
Hintergrund
- Stammzellen aus dem menschlichen Zahnfollikel (hDFSC) haben potenzielle therapeutische Anwendungen.
- Genetische Veränderung kann die Eigenschaften dieser Stammzellen verbessern.
- Nicht-virale Modifikationsstrategien sind sicherere Alternativen zu traditionellen Methoden.
Zweck der Studie
- Erforschung der genetischen Veränderung von hDFSC für verbesserte therapeutische Ergebnisse.
- Aufbau eines Protokolls für transiente Modifikation von Zahnstammzellen.
Verwendete Methoden
- Enzymatische Verdauung von Zahnfollikeln.
- Zubereitung der Verdauungslösung mit Collagenase Typ I und Dispase II.
- Verwendung von Antibiotika in Waschpuffern und Kulturmedien zur Vermeidung von Kontamination.
- Einführung von MikroRNA für transiente genetische Modifikation.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche transiente Modifikation von hDFSC wurde erreicht.
- Die Methode zeigte Sicherheit durch Vermeidung stabiler Genomintegration.
- Verbesserte therapeutische Eigenschaften der Stammzellen wurden beobachtet.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll bietet eine Grundlage für die Verbesserung von Stammzelltherapien.
- Transiente genetische Veränderung kann ein praktikabler Ansatz in der regenerativen Medizin sein.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables transient genetic modification of human dental follicle stem cells using microRNA without stable genome integration, addressing a key safety concern in stem cell-based therapies. The approach supports preclinical de-risking by allowing functional validation of therapeutic enhancements prior to transplantation. It provides a scalable, non-viral method to optimize stem cell efficacy for regenerative medicine applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of microRNA-mediated pathways in stem cell behavior and differentiation potential.
- Operational Value: Provides a reliable method to modulate stem cell phenotype without genomic alteration, supporting hypothesis-driven target validation.
- Predictive Value: Facilitates assessment of therapeutic mechanism through transient phenotypic changes, improving confidence in lead candidate selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, transfection-ready stem cell populations for consistent compound or modulator screening.
- Operational Value: Delivers quantifiable microRNA uptake and viability readouts via flow cytometry, enabling assay reproducibility across laboratories.
- Scalability: Uses cationic lipid transfection compatible with multi-well plate formats for medium-throughput screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from isolated stem cells to functionally modified cells for preclinical efficacy testing.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of microRNA effects on stem cell function without insertional mutagenesis concerns.
- Disease-Relevant System: Utilizes postnatal dental follicle as an accessible source of multipotent stem cells with high proliferation potential for tissue repair modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing a transient modification step after stem cell isolation and characterization, enabling functional optimization before downstream applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stem cell fate and behavior through controlled microRNA introduction.
- Screening: Enables standardized preparation of stem cells for evaluating genetic or pharmacological modulators in multi-well formats.
- Analytics: Provides flow cytometry-based quantification of transfection efficiency and cytotoxicity, supporting objective comparison of conditions.
- Translational Research: Bridges stem cell isolation and preclinical validation by generating modified cells with enhanced therapeutic potential.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transfection platform applicable to multiple stem cell types and microRNA candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in stem cell therapeutics by enabling transient, reversible modulation of gene expression.
- Operational Value: Offers a safe, efficient, and reproducible non-viral transfection method with minimal cytotoxic effects.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by allowing preclinical assessment of mechanism without genomic integration hazards.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of stem cell candidates through functional validation prior to IND-enabling studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, enzymatic tissue dissociation, and transfection techniques.
- Needs access to shaking incubators, flow cytometers, and standard cell culture infrastructure.
- Demands standardization of transfection reagent ratios and incubation times across teams for reproducibility.
- Requires adaptation of microRNA dosage and transfection conditions for different stem cell sources or species.
- Limited to transient effects; not suitable for applications requiring stable genetic modification.
