Name: Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Erfahren Sie die transiente gentechnische Veränderung menschlicher Dental follikelstammzellen mittels MicroRNA-Einführung. Diese sichere Methode ohne stabile Genomintegration ermöglicht verbesserte therapeutische Eigenschaften für die regenerative Medizin.

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Diese Arbeit wurde durch das FORUN-Programm von Rostock University Medical Center (889018) und der feuchten Foundation (2016-11) unterstützt. Darüber hinaus ist Uhr und r.d. werden durch das BMBF (VIP + 00240) unterstützt.

HDFSCs sind isoliert die zahnmedizinische Follikel der extrahierte Weisheitszähne, die von der Abteilung für Mund- und plastische Gesichtschirurgie des Universitätsklinikum Rostock zur Verfügung gestellt. Einwilligung nach Aufklärung und schriftliche Genehmigung wurde von allen Patienten erhalten. Diese Studie wurde von der lokalen Ethikkommission der Universität Rostock (Erlaubnis No. A 2017-0158) ermächtigt.
1. Isolierung der hDFSCs
Hinweis: Um bakterielle Kontamination zu verhindern, sollten Weisheitszähne nicht vor der Extraktion ausgebrochen
<ol><li>
Vorbereitung der erforderlichen Lösungen
	<ol>
<li>Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vorbereiten / Penicillin-Streptomycin-Glutamin (P-S-G) Lösung: 495 mL PBS mit 5 mL P-S-G-Lösung vermischen. Lagern Sie Aliquote von 50 mL bei 4 ° c</li>
		<li>HDFSC Kulturmedium vorbereiten: 445 mL basal Medium mit 5 mL des Antibiotika-Agents und 50 mL der fetalen bovine Serum (FBS) mischen. Shop bei 4 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie Kollagenase Typ ich Lager Lösung (30 mg/mL): 300 mg Kollagenase Typ ich in 10 mL basal Medium mit 1 % antibiotische Mittel ergänzt zu verdünnen. Mischen Sie kräftig die Lösung. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,2 µm-Filter. Store Aliquote von 500 µL der Kollagenase Typ I Vorratslösung bei-20 ° C.</li>
		<li>Dispase II-Stammlösung (40 mg/mL) vorbereiten: Dispase II 40 mg in 10 mL basal Medium ergänzt mit 1 % antibiotische Mittel zu verdünnen. Mischen Sie kräftig die Lösung. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,2 µm-Filter. Shop-Aliquote von 500 µL der Stammlösung Dispase II bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chirurgischer Eingriff
	<ol>
<li>Eine ausreichende Menge zu injizieren (maximal: 2 mL) von Lokalanästhetika.</li>
		<li>Schaffen und eine dreiseitige Schleimhautlappen Klappe erhöhen. Eine mehrsprachige Klappe anheben ist nicht erforderlich.</li>
		<li>Schützen Sie den sprachlichen Aspekt mit einer periostalen Aufzug.</li>
		<li>Sanft Mühle bukkal und distalen Knochen mit einer Runde harte Metall Burr.</li>
		<li>Lösen Sie das Gewebe der Follikel mit einer periostalen Aufzug. Entfernen Sie vorsichtig den kompletten Zahn (Keim) und Follikel durch Herausziehen der Krone (und Follikel) mit einer Pinzette posterior (dritte Molar).</li>
		<li>Debride und die Buchse mit NaCl-Lösung gründlich zu bewässern.</li>
		<li>Ersetzen Sie die Schleimhautlappen Klappe mit Vicryl Nähte (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Entfernen Sie den Zahn Follikel aus der Mundhöhle und legen Sie sie in einem aliquoten 50 mL PBS/P-S-G-Lösung. Hinweis: Die Probe kann bei 4 ° C gelagert werden, bis die Weiterverarbeitung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enzymatische Verdauung des Follikels, der Zahn
	<ol>
<li>Wärmen Sie hDFSC Kulturmedium und PBS/P-S-G-Lösung auf Raumtemperatur (RT vor).</li>
		<li>Tauen Sie ein Aliquot der jeweiligen Kollagenase, I und Dispase II auf Lagerlösungen. Bereiten Sie eine Verdauung-Lösung von 3 mg/mL Kollagenase Typ I und 4 mg/mL Dispase II durch Zugabe von 500 µL jeder Kollagenase Typ I und Dispase II-Stammlösung bis 4 mL des basalen mittlere enthält 1 % Antibiotika Agent.</li>
		<li>Extrahierten Follikel in eine sterile Petrischale geben Sie und 10 mL PBS/P-S-G-Lösung des entnommenen Gewebes zu waschen. Wiederholen Sie waschen zweimal.</li>
		<li>Hacken Sie die extrahierte Follikel in Stücke von etwa 1 mm x 1 mm mit einem sterilen Skalpell in der Petrischale mit 10 mL PBS/P-S-G-Lösung.</li>
		<li>Übertragen Sie Hackfleisch / Gewebe und PBS/P-S-G-Lösung in einem konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL aus der Petrischale. Waschen Sie die Petrischale mit 10 mL PBS/P-S-G-Lösung und übertragen Sie die Lösung in das gleiche Rohr.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie der konischen Zentrifugenröhrchen für 10 min bei 353 X g bei RT und verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Das gebeizte Gewebe 5 mL Aufschlusslösung hinzufügen. Mischen Sie die Lösung und das Gewebe vorsichtig. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C und 5 % CO2 für 2 h in einem schütteln Inkubator.</li>
		<li>Zentrifuge Zellgewebe/Federung bei 353 X g für 10 min bei RT. verwerfen des Überstands verdaut und neu gewonnene Pellet in 6 mL Kulturmedium hDFSC auszusetzen.</li>
		<li>Samen Zellsuspension in einem 25 cm2 Zell-Kultur-Kolben und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 20 % O2. Hinweis: Wenn Gewebe nicht vollständig verdaut, übertragen Sie das restliche Gewebe auf der Zelle-Kultur-Kolben sowie.</li>
		<li>Ändern Sie Medium sorgfältig 24 h nach Aussaat der Zelle. Danach wechselt Medium alle drei Tage bis Konfluenz. Hinweis: HDFSCs sollte Kunststoff-Anhänger 24 h nach Aussaat Zelle und aus nicht-anhaftende Zellen und Blutbestandteilen getrennt werden können, indem Sie einfach das Medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zelle zu ernten
	<ol>
<li>Wärmen Sie hDFSC Kulturmedium, PBS/P-S-G-Lösung und Trypsin/Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) Lösung für RT vor</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand von Kultur Kolben zu und waschen Sie konfluierende Zellen mit 5 mL PBS/P-S-G-Lösung.</li>
		<li>Die Kultur-Flasche 1 mL Trypsin/EDTA-Lösung hinzufügen und 3 Minuten bei 37 ° c inkubieren Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von 3 mL hDFSC Kulturmedium in den Kultur-Kolben.</li>
		<li>Übertragen Sie Zellsuspension in einem konischen Zentrifugenröhrchen 15 mL und Zentrifugieren Sie die Aufhängung für 10 min bei RT verwerfen des Überstands 353 X g und wieder auszusetzen Sie das Pellet in angemessener Höhe hDFSC Kulturmedium.</li>
		<li>Zählen von Zellen: 10 µL Zellsuspension mit 10 µL Trypan blau Lösung vorsichtig mischen. 10 µL in einer Zählkammer anwenden und die hDFSC Zelle berechnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Charakterisierung von hDFSCs
<ol><li>
Die Immunphänotypisierung
	<ol>
<li>Vorbereitung der durchflusszytometrischen Analyse von Zellen<ol>
<li>Vorbereitung der erforderlichen Lösungen<ol>
<li>PBS/EDTA (2 mM) Vorbereitung: Mischen Sie 996 mL PBS mit 4 mL EDTA (0,5 M).</li>
				<li>Bereiten Sie Färbung Puffer: 995 mL PBS/EDTA (2 mM) mit 5 g der BSA zu mischen. Filtern Sie die Lösung mit einer 0,22 µm-Filter-Einheit und bis zur Verwendung bei 4 ° C lagern.</li>
				<li>Vorbereiten von Paraformaldehyd (PFA)-Stammlösung (4 %): 4 g PFA in 100 mL PBS verdünnen und die Lösung auf 80 ° c erhitzen Mischen Sie die Lösung und stellen Sie den pH-Wert auf 7,3. Aliquoten erhalten PFA Lösung im jeweiligen Beträge (1,5 mL) und im Store bei-20 ° C bis zum Einsatz. Achtung: Da PFA Dämpfe giftig sind, bereiten Sie die PFA-Lösung in einem gelüfteten Abzug.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Übertragen Sie nach der Ernte (1.4) Zelle 14 Proben von 5 x 104 Zellen in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Suspensionen bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Hinweis: Führen Sie die folgende Arbeiten in einem eher schattigen Raum. Zellen und Reagenzien auf Eis zu halten, sofern nicht anders angegeben.</li>
			<li>Wieder aussetzen Sie Zellen in bestimmten Mengen an Färbung Puffer (4 ° C) und fügen Sie FcR Reagenz (4 ° C) blockiert, wie in Tabelle 1angegeben.</li>
			<li>Die folgenden Antikörper auf der Innenseite der jeweiligen Probe hinzufügen, wie in Tabelle 1angegeben: Allophycocyanin (APC) Maus Anti-Human CD29; APC-Maus IgG1 κ Isotype Kontrolle; Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP)-Cyanine5.5 Maus Anti-Human CD44; PerCP-Cyanine5.5 Maus IgG2b κ Isotype Kontrolle; V500 Maus Anti-Human CD45; V500 Maus IgG1 κ Isotype Kontrolle; Phycoerythrin (PE) Maus Anti-Human CD73; PE-Maus IgG1 κ Isotype Kontrolle; PerCP-Cyanine5.5 Maus Anti-Human CD90; PerCP-Cyanine5.5 Maus IgG1 κ Isotype Kontrolle; Anti-Human CD105 Maus: Alexa Fluor (AF) 488; Maussteuerung IgG1 negativ: AF488; PE-Cyanine7 Maus Anti-Human CD117; PE-Cyanine7 Maus IgG1, κ Isotype Kontrolle. Nach jeder Probe Antikörper hinzugefügt wurden, spin-down Antikörper und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie die Lösungen für 10 min bei 4 ° c</li>
			<li>Fügen Sie 1 mL PBS (4 ° C) und Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
			<li>Wieder aussetzen Sie Zellen in 100 µL PBS (4 ° C) und fügen Sie 33 µL PFA (4 %). Mischen Sie die Lösungen und bis zur durchflusszytometrischen Analyse auf Eis oder bei 4 ° C lagern.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Durchflusszytometrischen Durchflussmessung von Zellen Hinweis: Führen Sie die folgende Arbeiten in einem eher schattigen Raum. Halten Sie die Zellen auf dem Eis bis zur Messung.<ol>
<li>Um den Ausdruck von Oberflächenantigenen untersuchen, übertragen Sie Proben in Röhren geeignet für Durchflussmessungen durchflusszytometrischen.</li>
			<li>Messen Sie mindestens 2 x 104 Veranstaltungen mit einem Durchflusszytometer. Analysieren Sie, wie in Abbildung 2dargestellt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Multipotenten Differenzierung Potenzial der hDFSCs
	<ol>
<li>Verwenden Sie eine handelsübliche menschlichen mesenchymalen Stem Cell funktionale Identifikation Kit adipogenen osteogene und Chondrogenic Differenzierung Potenzial von hDFSCs bestätigen. Gelten Esel Anti-Ziege AF488 Sekundärantikörper zum Beizen von Fettsäure-bindendes Protein 4 (FABP4) und Aggrecan sowie Esel Anti-Maus AF488 Sekundärantikörper zum Beizen von Osteocalcin. Verwenden Sie für die Färbung der Kerne Eindeckmittel mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI). Hinweis: Bereiten Sie Proben ohne primären Antikörper als Negativkontrollen für mikroskopische Analysen.</li>
		<li>Analysieren Sie Expression von Proteinen durch Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie. Mikroskopie-Einstellungen: 40 X Objektiv mit Ölimmersion; Erregung Laser 488 nm (für AF488) und 405 nm (für DAPI).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. die Transfektion von hDFSCs
<ol><li>Samen Sie nach der Ernte (1.4) Zelle hDFSCs auf einer 24-Well Zellplatte Kultur 24 h vor Transfektion. Hinweis: Zelldichte ist ca. 4 x 104 Zellen pro Bohrloch. Zellen sollten am Tag der Transfektion Zusammenfluss ~ 80 % erreichen. Hinweis: Saatgut eine zusätzliche Zelle Probe als Steuerung für durchflusszytometrischen Analyse.</li>
	<li>Vorbereitung der Transfektion komplexe Hinweis: Zur Vermeidung von Kontamination durch RNases Reinigen des Arbeitsbereichs direkt vor der Zubereitung der Transfektion komplexe mit RNase Dekontaminationslösung. Verwenden Sie nur RNase-freie Material und Lösungen. Hinweis: Führen Sie die folgende Arbeiten in einem eher schattigen Raum.<ol>
<li>Bereiten Sie MiR Stammlösung (50 µM): erneut aussetzen Cy3 gekennzeichnet Vorläufer MiR (5 Nmol) in 100 µL Nuklease-freies Wasser. Aliquoten erhalten MiR Stammlösung in entsprechenden Mengen (5 µL) und Store im Dunkeln bei-20 ° C bis zum Einsatz.</li>
		<li>Verdünnen Sie 40 Pmol von MiR (0,8 µL der MiR-Vorratslösung 50 µM) in 66,7 µL reduzierte Serum-Medium. Die Lösung vorsichtig mischen</li>
		<li>Verdünnen Sie 0,67 µL kationischen Lipid-basierte Transfection Reagens in 66,7 µL reduzierte Serum-Medium. Die Lösung vorsichtig mischen und 5 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Nach der Inkubation vorverdünnt Transfection Reagens hinzufügen der vorverdünnt MiR. Die Lösung vorsichtig mischen und 15 min bei RT inkubieren</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie die vorbereiteten Transfektion komplexe tropfenweise direkt an das Kulturmedium auf Zellen. Mischen von 24 wohlen Kultur Zellplatte hin und her schaukeln.</li>
	<li>Inkubation der Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2und 20 % O2 für 24 h.</li>
</ol>4. Analyse der Transfektion
Hinweis: Führen Sie die folgende Arbeiten in einem eher schattigen Raum.
<ol><li>
Zelle nach Transfektion Ernte Hinweis: Sammeln Sie alle Zelle Lösungen einer Probe in der gleichen konische Zentrifugenröhrchen 15 mL.<ol>
<li>24 h nach Transfektion, sammeln den Überstand der Proben im jeweiligen Zentrifuge Röhren.</li>
		<li>Zellen mit 1 mL PBS waschen, übertragen PBS in den jeweiligen Zentrifugenröhrchen geben und 500 µL Trypsin/EDTA (RT) Zellen. Inkubieren Sie die Lösungen für 3 min bei 37 ° c</li>
		<li>Trypsinization durch Zugabe von 1 mL Kulturmedium (RT) auf die Zellen und Transfer der Lösung in den jeweiligen Zentrifugenröhrchen zu stoppen. Zentrifuge Zellen bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Hinweis: Halten Sie aus dieser Zeit Zellen und Reagenzien auf Eis, sofern nicht anders angegeben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der durchflusszytometrischen Analyse von Zellen
	<ol>
<li>Verwerfen Sie den überstand. Wieder aussetzen Sie Zellen in 100 µL Färbung Puffer (4 ° C) und Transferlösung Zelle zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Den Proben 0,5 µL Amin Reaktivfarbstoffen zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen hinzugefügt. Vorsichtig mischen Sie die Lösung und 10 min bei 4 ° c inkubieren</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL PBS (4 ° C) Zellen und Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie Zellen in 100 µL PBS (4 ° C) und fügen Sie 33 µL PFA (4 %). Mischen Sie die Lösungen und bis zur durchflusszytometrischen Analyse auf Eis oder bei 4 ° C lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Durchflusszytometrischen Durchflussmessung von Zellen Hinweis: Führen Sie die folgende Arbeiten in einem eher schattigen Raum. Halten Sie die Zellen auf dem Eis bis zur Messung.<ol>
<li>Übertragen Sie Proben in Röhren geeignet für Durchflussmessungen durchflusszytometrischen.</li>
		<li>Untersuchen Sie Zellviabilität und MiR Aufnahme Effizienz mit einem Durchflusszytometer. Messen Sie mindestens 2 x 104 Veranstaltungen. Verwenden Sie die gating Strategie in Abbildung 4dargestellt. Hinweis: Verwenden Sie untransfected Zellen als Negativkontrolle, arrangieren die Anspritzung Cy3 positive Zellen und Zelltod verursacht durch Transfektion zu berechnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Adulte Stammzellen sind derzeit im Fokus für die Behandlung von verschiedenen degenerativen Erkrankungen. Vor allem Knochenmark (BM)-Stammzellen, einschließlich hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) abgeleitet und MSCs, intensive klinische Untersuchung47unterliegen. Allerdings BM Ernte ist ein invasives Verfahren verursachen Schmerzen an der Stelle der Spende und kann zu unerwünschten Ereignissen48führen. Vor kurzem hat die postnatale Zahngewebe eine neuartige und leicht zugä...

Die menschlichen zahnmedizinische Follikel ist eine lose Ectomesenchymally abgeleitet Bindegewebe rund um den dritten Zahn1,2. Neben seiner Funktion, Osteoclastogenesis und Osteogenesis für den Zahn-Ausbruch-Prozess zu koordinieren birgt dieses Gewebe Stamm- und Vorläuferzellen Zellen vor allem für die Entwicklung des Parodonts3,4,5. Daher gilt die zahnmedizinische Follikel als alternative Energiequelle menschliche adulte Stammzellen6,7zu ernten.
Mehrere Studien bewiesen, dass menschliche dental follikelstimulierendes Stammzellen (hDFSCs) in der Lage, Differenzierung in der parodontalen Linie einschließlich der Osteoblasten, Fibroblasten Bänder- und Cementoblasts8,9,10 . Darüber hinaus diese Zellen erwiesen sich alle Merkmale des mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) einschließlich selbst erneuernde Kapazität, Einhaltung von Kunststoff, Ausdruck der spezifischen Oberflächenmarker übereinstimmen (z. B., CD73, CD90, CD105) sowie als osteogene adipogenen und Chondrogenic Differenzierung möglicher11,12,13. Andere Studien zeigten auch eine neuronale Differenzierung Potenzial von hDFSCs2,14,15,16,17,18.
Aufgrund ihrer vielversprechenden Eigenschaften und einfachen Zugang wurde hDFSCs vor kurzem relevant für Tissue engineering19,20,21. Die ersten Studien konzentrierten sich auf das Potenzial der DFSCs, Knochen, parodontale Regeneration und Zahn Wurzeln19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Seit das Wissen der neurogenen Fähigkeit des hDFSCs ist ihre Anwendung als potenzielle Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen untersuchten31,32,33. HDFSCs haben auch Bedeutung in Bezug auf die Regeneration des anderen Geweben (z.B. Hornhaut-Epithel)34,35. Das therapeutische Potenzial von hDFSC basiert nicht nur auf ihre direkte Differenzierung Potenzial, sondern auch auf ihre parakrine Aktivität. Vor kurzem haben hDFSCs gezeigt, dass eine Fülle von bioaktive Faktoren, wie Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und Hepatozyten Wachstum absondern Faktor (HGF), die eine entscheidende Rolle bei der Angiogenese, Immunmodulation, extra zellulären Matrix Modellierung und reparative Prozesse36spielen.
Breite klinische Übersetzung der Stammzell-Therapie ist jedoch immer noch durch verschiedene Herausforderungen, wie massive erste Zelltod und niedrigen positiven Stammzellen Effekte37,38beeinträchtigt. Gentechnik stellt eine vielversprechende Strategie zur Bewältigung dieser Herausforderungen und können daher erheblich verbessern die therapeutische Wirksamkeit von Stammzellen38,39,40. Für vorübergehende Zelle Manipulation sind Micro-RNAs (MiRs) geeignete Kandidaten, wie diese kleinen translationale Regler, das Schicksal und das Verhalten von Stammzellen ohne die Gefahr von stabilen Genom Integration41,42, Steuern 43. bisher mehrere vorteilhafte MiRs identifiziert wurden Stamm Zellproliferation, überleben, Homing, parakrine Aktivität sowie deren Differenzierung in verschiedene Linien44zu fördern. MiR-133a entwickelt beispielsweise MSCs zeigte ein verlängertes Überleben und Engraftment aufrecht, wodurch eine verbesserte Herzfunktion im Vergleich zu unveränderten MSCs45Rattenherzen. Ebenso zeigten MiR-146a überexprimierenden MSCs höhere Mengen an VEGF absondern, was wiederum zu einer verbesserten therapeutischen Effizienz im ischämischen Gewebe46geführt.
Diese Handschrift enthält ein detailliertes Protokoll für die selektive Extraktion und gentechnische Veränderung von hDFSCs. Zu diesem Zweck haben wir die Ernte- und enzymatische Verdauung von menschlichen zahnmedizinische Follikel sowie die nachträgliche Isolierung der hDFSCs beschrieben. Um isolierte Zellen zu charakterisieren, wurden wichtige Hinweise für die Überprüfung der MSC Eigenschaften gemäß den Richtlinien der International Society for Zellulartherapie13aufgenommen. Darüber hinaus bieten wir eine ausführliche Beschreibung zur Erzeugung von MiR modifiziert hDFSCs durch die Anwendung einer kationischen Lipid-basierte Transfektion Strategie und die Bewertung der Effizienz der Transfektion und Zytotoxizität.

<table><tbody><tr><td>Maus Anti Human CD105 Antikörper: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1557A488</td><td>Klon SN6, monoklonale</td></tr><tr><td>Maus IgG1 Negative Kontrolle Antikörper: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928A488</td><td>monoklonale</td></tr><tr><td>APC Maus Anti-Human CD29 Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>559883</td><td>Klon MAR4, monoklonale</td></tr><tr><td>APC Maus IgG1 & kappa; Isotyp-Kontroll-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>555751</td><td>Klon MOPC-21, monoklonaler</td></tr><tr><td>PE-Maus-Anti-Human-CD73-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>550257</td><td>Klon AD2, monoklonaler</td></tr><tr><td>PE-Maus-IgG1 & kappa; Isotyp-Kontroll-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>Klon MOPC-21, monoklonales</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Maus Anti-Human-CD117 Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>339217</td><td>Klon 104D2, monoklonales</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Maus IgG1 & Kappa; Isotyp-Kontroll-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>557872</td><td>Klon MOPC-21, monoklonales</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Maus Anti-Human-CD44-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>Klon G44-26, monoklonales</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Maus IgG2b & kappa; Isotyp-Kontroll-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Klon 27-35, monoklonales</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Maus-Anti-Human-CD90&nbsp; Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>561557</td><td>Klon 5E10, monoklonales</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Maus IgG1, &amppa; Isotyp-Kontroll-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>55095</td><td>Klon MOPC-21, monoklonaler</td></tr><tr><td>V500-Maus-Anti-Human-CD45-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>560777</td><td>Klon HI30, monoklonaler</td></tr><tr><td>V500-Maus-IgG1 & kappa; Isotyp-Kontroll-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>560787</td><td>Klon X40, monoklonales</td></tr><tr><td>FcR-Blockierungsreagenz, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td>0,5 M, pH 8,0</td></tr><tr><td>Steritop</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>0,22 &micro; m, radiosterilisiert, Polyethersulfon</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>Humanes mesenchymales Stammzell-Funktionsidentifikationskit</td><td>R& D Systems</td><td>SC006</td><td></td></tr><tr><td>RNase Dekontaminationslösung; RNaseZap RNase Dekontaminationslösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-markierter Vorläufer miR; Cy3-Farbstoff-markierte Pre-miR-Negativkontrolle #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17120</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Pre-miR miRNA-Vorläufer-Negativkontrolle #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17110</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>kationisches Transfektionsreagenz auf Lipidbasis; Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Reduziertes Serummedium; Opti-MEM I Reduziertes Serummedium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Ziegen-IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>polyklonaler</td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>polyklonales</td></tr><tr><td>Eindeckmedium; Fluoroshield mit DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td><td>Histologie-Einbettmedium</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN2011 Software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA-Lösung (0,05%/ 0,02%)</td><td>Biochrom</td><td>L2143</td><td>in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>Amin-Reaktivfarbstoff; LEBEND/TOT&HANDEL; Fixierbares Nahinfrarot-Färbeset</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific L10119</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023 pH-Wert</td><td>: 7,4; ohne Ca: Ca und Mg</td></tr><tr><td>P-S-G (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Basalmedium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nährstoffmischung F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum, ZellShield</td><td>Biochrom</td><td>W 13-0050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Filter, Sterifix Spritzenfilter 0,2 & Mikro; m</td><td>Braun</td><td>4099206</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; mL konisches Zentrifugenröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konisches Zentrifugenröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturkolben 75 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833.910.002</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturkolben, 25 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833,911.002</td><td></td></tr><tr><td>Gefriermedium, Biofreeze</td><td>Biochrom</td><td>F 2270</td><td></td></tr><tr><td>Kryoröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>377267</td><td>1,8 mL</td></tr><tr><td>Trypanblau Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0,4 %</td></tr><tr><td>Zählkammer</td><td>Paul Marienfeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lokalanästhetikum, Xylocitin (Lidocainhydrochlorid) 2% mit Adrenalin (Adrenalin) 0,001</td>%<td>Mibe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl Lösung</td><td>Braun</td><td></td><td>0.9 %</td></tr><tr><td>Vicryl gesättigte Fettsäuren, Vicryl rapide</td><td>Ethicon</td><td></td><td>3 - 0</td></tr></tbody></table>

isolierung, charakterisierung und rna-basierte gentechnische veränderung von menschlichen dental follikelstimulierendes stammzellen

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Bis heute sind mehrere Stammzelltypen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien im Fokus für die Behandlung von degenerativen Erkrankungen. Jedoch beeinträchtigt bestimmte Aspekte wie anfängliche massive Zelltod und geringen therapeutischen Wirkungen, ihre breite klinische Übersetzung. Gentechnische Veränderung von Stammzellen vor der Transplantation erwies sich als eine vielversprechende Methode zur therapeutischen Stammzellen Effekte optimieren. Sichere und effiziente gen-Delivery-Systeme fehlen jedoch noch. Daher kann die Entwicklung geeigneter Methoden einen Ansatz zur Lösung der aktuellen Herausforderungen stammzellbasierte Therapien bieten.
Dieses Protokoll beschreibt die Gewinnung und Charakterisierung von menschlichen dental follikelstimulierendes Stammzellen (hDFSCs) sowie ihre nicht-viralen genetischen Veränderung. Die postnatale zahnmedizinische Follikel enthüllt als vielversprechende und leicht zugängliche Quelle für die Ernte von multipotenten Stammzellen besitzen hohe Verbreitung Potenzial. Die beschriebenen Isolierung-Verfahren stellt eine einfache und zuverlässige Methode zur hDFSCs von Weisheitszähne Ernte. Dieses Protokoll umfasst auch Methoden zur Stammzell-Merkmale der isolierten Zellen definieren. Für gentechnische Veränderung von hDFSCs ist eine optimierte kationischen Lipid-basierte Transfektion Strategie ermöglicht hocheffiziente MicroRNA-Einführung vorgelegt, ohne zytotoxische Wirkungen verursacht. Micro-RNAs sind geeignete Kandidaten für vorübergehende Zelle Manipulation, wie diese kleinen translationale Regler das Schicksal und das Verhalten von Stammzellen ohne die Gefahr der stabilen Genom Integration zu kontrollieren. Dieses Protokoll stellt ein sicheres und effizientes Verfahren zur Konstruktion von hDFSCs, die wichtig für die Optimierung ihrer therapeutischen Wirksamkeit werden können.

Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Isolierung Anleitung hDFSCs aus menschlichen zahnmedizinische Follikel Gewebe zu ernten. Aufgrund der Anbindung des zahnmedizinischen Follikels während der routinemäßigen Operation ist es eine vielversprechende Quelle für die Gewinnung von adulten Stammzellen.
Die isolierten hDFSCs zeigte alle Merkmale für die Definition von MSCs13beschrieben. In der Tat waren...

Dieses Protokoll beschreibt der Transienten Gentechnik zahnmedizinische Stammzellen aus der menschlichen zahnmedizinische Follikel extrahiert. Die angewandte nicht-viralen Modifikation Strategie kann eine Grundlage für die Verbesserung der therapeutischen Stammzellen Produkte geworden.

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Regenerativen Medizin zu beantworten, wie z. B. wo ein menschlicher Zahnfollikel Stammzellen gentechnisch verändert werden könnte, um ihre therapeutischen Eigenschaften zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Stammzellen durch die Einführung von microRNA ohne die Gefahr einer stabilen Genomintegration modifiziert werden können. Beginnen Sie das Verfahren zur enzymatischen Verdauung der beiden Follikel, durch Vorerwärmung auf Raumtemperatur, menschliche Zahnfollikel Stammzelle oder hDFSC Kulturmedium und PBSPSG-Lösung.Thaw ein aliquot jede von Collagenase Typ I und Dispase II Aktienlösungen. Bereiten Sie eine Verdauungslösung vor, indem Sie 500 Mikroliter der Lagerlösung Kollagenase Typ I und 500 Mikroliter der Dispase II-Lagerlösung auf 4 Milliliter Basal Medium mit 1% Antibiotika enthalten. Um eine Kontamination der Standorte während der menschlichen Zahnfollikel-Stammzellisolation zu vermeiden, müssen Waschpuffer und verwendete Kulturmedien Antibiotika enthalten.Legen Sie einen extrahierten Zahnfollikel in eine sterile Petrischale. Fügen Sie 10 Milliliter PBSPSG-Lösung hinzu, um das extrahierte Gewebe zu waschen. Aspirieren und entsorgen Sie die Lösung und fügen Sie frische PBSPSG-Lösung hinzu, um die Wäsche zu wiederholen.Mit einem sterilen Skalpell zerkleinern Sie den extrahierten Follikel in Stücke, wenn etwa 1 mal 1 Millimeter. Das Hackfleisch und die PBSPSG-Lösung aus der Petrischale in ein 50-Milliliter-Konzentrigerohr geben, die Petrischale mit 10 Milliliter PBSPSG-Lösung waschen und in ein und dasselbe Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 353 x g bei Raumtemperatur für zehn Minuten.5 Milliliter Verdauungslösung in das palettenGewebe geben, die Lösung und das Gewebe vorsichtig mischen, die Mischung bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 in einem Schüttelinkubator für zwei Stunden inkubieren. Nach zwei Stunden zentrifugieren Sie die verdaute Zelle und Gewebesuspension bei 353 g für zehn Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie die erhaltene Palette in 6 MilliliterHDSC-Kulturmedium wieder auf.Säen Sie die Zellsuspension in einem 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben, und brüten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Nach der Zellernte und Charakterisierung von HDFSC ist wie im Textprotokoll beschrieben, Samen hDFSCs in einer 24 Well-Zell-Kulturplatte. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 und 20% Sauerstoff für 24 Stunden.Am folgenden Tag 40 Picomole von microRNA in 66,7 Mikroliter reduziertem Serummedium verdünnen und die Lösung wirbeln. Verdünnen Sie 0,67 Mikroliter kationisches Lipid-basiertes Transfektionsreagenz in 66,7 Mikroliter reduziertem Serummedium, Wirbel der Lösung und inkubieren Bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach fünf Minuten die vorverdünnte microRNA in das vorverdünnte Transfektionsreagenz geben, die Lösung mischen und bei Raumtemperatur 15 Minuten brüten.Als nächstes fügen Sie die vorbereiteten Transfektionskomplexitäten tropfenweise direkt zum Kulturmedium auf Zellen hinzu. Mischen Sie sanft, indem Sie die 24 Brunnenzellkulturplatte hin und her schaukeln. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden.24 Stunden nach der Transfektion den Überstand der Proben in den jeweiligen 15 Milliliter-Konifugenrohren sammeln. Waschen Sie die Zellen mit 1 Milliliter PBS und übertragen Sie die PBS in das jeweilige Zentrifugenrohr. Fügen Sie 500 Mikroliter Tropf und EDTA in die Zellen, und brüten die 24 Brunnenplatte bei 37 Grad Celsius, für 3 Minuten.Beenden Sie die Trypsinisierung, indem Sie 1 Milliliter Zellkulturmedium für die Zellen hinzufügen und die Lösung in das jeweilige Zentrifugenrohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g und 4 Grad Celsius für zehn Minuten. Von hier aus halten Sie die Zellen und Reagenzien auf Eis, sofern nicht anders angegeben.Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter Neinen Desstrich wieder auf und übertragen Sie die Zelllösung in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 0,5 Milliliter Amin-Reaktivfarbstoff zu jeder Probe hinzu, um zwischen lebenden und abgestorbenen Zellen zu unterscheiden. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, und brüten bei 4 Grad Celsius für zehn Minuten.Fügen Sie 1 Milliliter PBS zu den Zellen hinzu, und Zentrifuge bei 300g und 4 Grad Celsius für zehn Minuten Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter PBS wieder auf, fügen Sie 33 Mikroliter Paraformaldehyd hinzu und mischen Sie die Lösungen, speichern Sie die Proben bei 4 Grad Celsius, geschützt vor Licht, bis zytometrische Messungen durch den Fluss. Übertragen Sie die Proben in Röhren, die für zytometrische Durchflussmessungen geeignet sind, und führen Sie die Durchflusszytometrie mithilfe der im Textprotokoll beschriebenen Gating-Strategie durch. Die isolierten menschlichen Zahnfollikelstammzellen zeigten alle für die Definition mesenchymaler Stromalzellen beschriebenen Eigenschaften, Zellen waren kunststoffhaft und zeigten eine Glasfaser-ähnliche Morphologie unter Standardkulturbedingungen.Die zytometrische Analyse des Flusses ergab, dass hDFSCs ein Panel mit bestimmten Oberflächenantigenen exprimiert haben, einschließlich CD29, CD44, CD73, CD90 und CD105. Während CD45 und CD117 fehlten. Die adipogenen, osteogenen und chondrogenen Differenzierungspotenziale von Zellen unter spezifischen In-Vitro-Kulturbedingungen wurden durch Immunfärbung, ein Fettsäure-Bindendes Protein für:Osteocalcin und Aggrecan, bestätigt.Die Gating-Strategie für die Quantifizierung der Zytotoxizität und Cy3 markiert microRNA Aufnahme Effizienz 24 Stunden nach der Transfektion, bestätigte microRNA Aufnahme in 100% der lebensfähigen Zellen. Vergleichbare Mengen abgestorbener Zellen in transfizierten und untransfizierten Proben deuten darauf hin, dass microRNA effizient ohne zytotoxische Wirkungen eingeführt wird. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Transdifferenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Cytolab Plastizität zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Das beschriebene Verfahren Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Zahnpulpa Stammzellen (hDPSCs) unter Verwendung...

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Das kontinuierlich wachsende Maus Schneidezahn stellt ein Modell für die Untersuchung Erneuerung der Zahngewebe aus Zahn epithelialen Stammzellen (DESC). Ein robustes System für konsistent und zuverlässig diese Zellen von den Schneide erhalten und in vitro expandiert sie hier berichtet wird.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Wir haben ein Verfahren zur Isolierung, phänotypische Charakterisierung und funktionelle Analyse von Immunzellen aus murinen Gingiva etabliert.

Isolierung, Charakterisierung und funktionelle Untersuchung des Zahnfleisch Immune Cell Network

Ein ideales Modell für das Studium der adulten Stammzellbiologie ist der Haarfollikel der Maus. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung verschiedener Populationen von Haarfollikeln, Stammzellen und epidermalen Keratinozyten vor, wobei die enzymatische Verdauung der Rückenhaut von Mäusen mit anschließender FACS-Analyse zum Einsatz kommt.

Isolieren von Haarfollikelstammzellen und epidermalen Keratinozyten von Dorsal Mäusehaut

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die menschlichen Dental Pulp Stammzellen isoliert und Vermehrung um das Prion-Protein-Expression bei neuronalen Differenzierungsprozess zu bewerten.

Isolation, Vermehrung und Prion-Protein-Expression während neuronaler Differenzierung von Stammzellen menschlichen Zahnpulpa

Der Dentalfollikel enthält eine Epithelpopulation und mesenchymale Zellen. Die Epithelpopulation wurde aus der heterogenen Dentalfollikelzellpopulation ausgewählt, indem ein bestimmtes Kulturmedium bereitgestellt wurde. Epithelzellen überlebten und bildeten Kolonien in einem serumfreien Medium.

Isolierung von Epithelzellen aus dem menschlichen Zahnfollikel

Wir präsentieren ein Protokoll zur Entwicklung epithelialer Organoidkulturen ausgehend vom menschlichen Zahn. Die Organoide sind robust expandierbar und rekapitulieren die epithelialen Stammzellen des Zahnes, einschließlich ihrer Ameloblasten-Differenzierungskapazität. Das einzigartige Organoidmodell bietet ein vielversprechendes Werkzeug, um die Biologie der menschlichen Zahnmedizin (Stammzelle) mit Perspektiven für zahnregenerative Ansätze zu untersuchen.

Etablierung von Organoiden aus dem menschlichen Zahn als mächtiges Werkzeug für die mechanistische Forschung und regenerative Therapie

Dieser Artikel enthält eine schrittweise Anleitung zur Etablierung einer Primärkultur von Zahnpulpa-Stammzellen unter Verwendung der Explantatkulturmethode und zur Charakterisierung dieser Zellen auf der Grundlage der ICSCRT-Richtlinien. Die durch dieses Protokoll isolierten Zellen können als mesenchymale Stammzellen für weitere Anwendungen betrachtet werden.

Primärkultur von Stammzellen der Zahnpulpa

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Extraktion, Kultivierung und Konservierung von multipotenten Stammzellen aus Zahnpulpa durch enzymatischen Verdau. Darüber hinaus demonstriert es ihr Potenzial, sich in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten zu differenzieren, was die Bedeutung von Präzision und Konsistenz in diesem Prozess unterstreicht.

Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von Stammzellen der Zahnpulpa aus menschlichen Milchzähnen und bleibenden Zähnen

Die Isolierung von BAMBI-hohenMFGE8-hohen MSCs, einer der drei Hauptuntergruppen der heterogenen humanen UC-MSCs, ist hilfreich, um die Eigenschaften und Funktionen dieses Subtyps für seine zukünftige Anwendung zur Verbesserung der klinischen Wirksamkeit bei bestimmten Erkrankungen vollständig zu verstehen. Hier stellen wir eine Methode zur Sortierung von BAMBIhochMFGE8hoch UC-MSCs vor.

Isolierung von humanen mesenchymalen Stromazellen mitBAMBI-Gehalt anhohemMFGE8-Nabelschnurgehalt

Erfahren Sie die transiente gentechnische Veränderung menschlicher Dental follikelstammzellen mittels MicroRNA-Einführung. Diese sichere Methode ohne stabile Genomintegration ermöglicht verbesserte therapeutische Eigenschaften für die regenerative Medizin.

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen (Video) | JoVE Journal

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

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