Visualisierung von genetischen Varianten, kurze Ziele und Punktmutationen in Zusammenhang mit morphologischen Gewebe mit einem RNA In Situ Hybridisierung Assay

Diese Methode kann wichtige Forschungsfragen in den Neurowissenschaften, der Onkologie und darüber hinaus beantworten, wie z. B. die zelltypspezifische Expression und die räumliche Kartierung von Spleißvarianten in der Gehirn- und Tumormikroumgebung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Exon-Verbindungen, kurze Sequenzen und Punktmutationen im Gewebekontext mit sehr hoher Sensitivität und Spezifität in einzelnen Zellen nachweisen kann. Das Verfahren wird Hell Pimentel, ein assoziierter Wissenschaftler aus unserem Labor, vorführen.

Um das Gewebe vorzubereiten, fixieren Sie es unmittelbar nach der Dissektion in 10% neutral gepuffertem Formalin bei Raumtemperatur für 16 bis 32 Stunden. Anschließend wird die Probe aufbereitet und mit Hilfe von Standardverfahren in Paraffin eingebettet. Schneiden Sie das eingebettete Gewebe mit einem Mikrotom in fünf Plus- oder Minus-Ein-Mikrometer-Abschnitte.

Montieren Sie die Sektionen auf elektrostatisch klebende Glasobjektträger und trocknen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur an der Luft. Eine Stunde vor der Durchführung des RNA NC2-Hybridisierungsassays legen Sie die montierten Gewebeobjektträger in ein Objektträgergestell und backen Sie sie in einem Umluftofen bei 60 Grad Celsius. Stellen Sie vor dem Start des RNA-NC2-Hybridisierungsassays sicher, dass der Hybridisierungsofen auf 40 Grad Celsius eingestellt ist.

Befeuchten Sie das Befeuchtungspapier gründlich, entfernen Sie restliches Wasser und legen Sie den Deckel auf die Feuchtigkeitskontrollschale. Bereiten Sie 200 Milliliter des im Handel erhältlichen 1X-Reagenzes für die Zielgewinnung vor, indem Sie 20 Milliliter des 10-fachen Reagenzes für die Zielentnahme zu 180 Millilitern Wasser hinzufügen. Legen Sie zwei Diahalter in einen Dampfgarer.

Füllen Sie einen Objektträgerhalter mit 200 Millilitern 1X Target Retrieval Reagenz und den anderen mit 200 Millilitern Wasser. Mit dem Dampfgarer beide Lösungen zum Kochen bringen. Erwärmen Sie den 50X-Waschpuffer 10 bis 20 Minuten lang auf 40 Grad Celsius.

Bereiten Sie dann drei Liter 1X-Waschpuffer vor, indem Sie 60 Milliliter vorgewärmten 50X-Waschpuffer mit 2,94 Litern Wasser verdünnen. Bereiten Sie in einem Abzug 50 % der Gill-Hämatoxylin-Gegenfärbelösung vor, indem Sie 100 Milliliter Gill-Hämatoxylin zu 100 Millilitern Wasser hinzufügen. Bereiten Sie das Bläuereagenz vor, indem Sie 1,43 Milliliter 20 bis 30 % Ammoniumhydroxid zu 250 Millilitern Wasser hinzufügen.

Erwärmen Sie die Zielsonden vor der Sondenhybridisierung 10 Minuten lang bei 40 Grad Celsius. Bringen Sie die sieben Amplifikationsreagenzien (Amp 0 bis 6) auf Raumtemperatur. Beginnen Sie mit der Probenentschärfung, indem Sie Schnitte aus dem Ofen nehmen und die montierten Gewebeobjektträger fünf Minuten lang unter Rühren in Xylol eintauchen.

Erneut fünf Minuten lang in frischem Xylol depariffinisieren. In 100%igem Ethanol zwei Minuten lang unter Rühren dehydrieren. Und wiederholen Sie den Vorgang erneut in frischem 100%igem Ethanol für zwei Minuten.

Trocknen Sie die Objektträger bei 60 Grad Celsius in einem Umluftofen fünf Minuten an der Luft, bis sie vollständig getrocknet sind. Als nächstes inkubieren Sie die Schnitte mit etwa vier Tropfen gebrauchsfertigem Wasserstoffperoxid bei Raumtemperatur für 10 Minuten, um die endogene Peroxidaseaktivität zu löschen. Dekantieren Sie die Lösung von den Objektträgern und spülen Sie sie zweimal mit Wasser ab.

Tauchen Sie die Schnitte kurz in das vorgewärmte Wasser und legen Sie die Schnitte dann in 200 Milliliter des Zielentnahmereagenzes bei 100 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten in den Dampfgarer. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Zielentnahme und spülen Sie sie zweimal mit Wasser ab. Tauchen Sie 100% Ethanol für drei Minuten ein.

Anschließend trocknen Sie die Objektträger bei 60 Grad Celsius in einem Umluftofen, bis sie vollständig getrocknet sind. Sobald die Objektträger trocken sind, zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift eine etwa 0,75 x 0,75 Zoll große hydrophobe Barriere um den Abschnitt. Lassen Sie die Barriere eine Minute lang bei Raumtemperatur vollständig trocknen.

Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter und legen Sie den Objektträgerhalter in das vorgewärmte Tablett mit kontrollierter Luftfeuchtigkeit. Geben Sie etwa vier Tropfen Protease 3 auf jeden Objektträger und inkubieren Sie bei 40 Grad Celsius im Hybridisierungsofen für 15 bis 30 Minuten. Dekantieren Sie die Lösung von den Objektträgern und spülen Sie sie zweimal mit Wasser ab.

Um mit der Sondenhybridisierung zu beginnen, fügen Sie etwa vier Tropfen der entsprechenden gebrauchsfertigen Sondenlösung hinzu, um den gesamten Abschnitt abzudecken. Hybridisieren Sie die Sonden bei 40 Grad Celsius im Hybridisierungsofen für zwei Stunden. Dekantieren Sie die Lösung von den Objektträgern und waschen Sie die Objektträger in 200 Millilitern 1X Waschpuffer bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Rühren für zwei Minuten.

Wiederholen Sie den Waschvorgang. Der nächste Schritt besteht darin, das Signal zu verstärken, indem die Abschnitte in einer Reihe von Amplifikationsreagenzien inkubiert werden. Fügen Sie etwa vier Tropfen Amp 0 hinzu, um den gesamten Abschnitt auf jedem Objektträger abzudecken, und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius im Hybridisierungsofen.

Dann die Lösung dekantieren und die Objektträger in 200 Millilitern 1X Waschpuffer bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Rühren zwei Minuten lang waschen. Wiederholen Sie den Waschvorgang. Auf die gleiche Weise werden die Abschnitte in Amp 1 bis Amp 6 bei der in diesem Schema angegebenen Temperatur und Zeit inkubiert.

Nachdem die Objektträger mit der Serie von Amplifikationsreagenzien behandelt wurden, bereiten Sie eine Fast Red Farbstoff-Arbeitslösung vor. Geben Sie die entsprechende Menge an Fast Red-B Farbstoff und Fast Red-A Farbstoff in eine Tube und mischen Sie gut. Dekantieren Sie die überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern und geben Sie die Fast Red Farbstoff-Arbeitslösung auf die Objektträger.

Inkubieren Sie die Objektträger in einer Schale mit Deckel 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 10 Minuten die Fast Red Lösung umfüllen und die Objektträger zweimal mit Leitungswasser auf und ab tauchen. Um die Gewebeschnitte gegenzufärben, tauchen Sie die Objektträger zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in 50%ige Gill'sche Hämatoxylinlösung.

Waschen Sie die Objektträger mit Leitungswasser und wiederholen Sie dies mehrmals, bis die Objektträger klar sind und die Abschnitte violett bleiben. Tauchen Sie die Objektträger zwei- bis dreimal in 02%Ammoniakwasser, um sie zu bläuen. Ersetzen Sie das Ammoniakwasser durch Leitungswasser und waschen Sie die Objektträger drei- bis fünfmal.

Trocknen Sie die Objektträger im Umluftofen bei 60 Grad Celsius für 15 Minuten, bis sie vollständig getrocknet sind. Geben Sie ein bis zwei Tropfen Eindeckreagenz auf einen Deckglas und legen Sie den Objektträger über den Deckglas, wobei Luftblasen nicht eingeschlossen werden müssen. Trocknen Sie die Objektträger mindestens fünf Minuten lang an der Luft.

Betrachten Sie schließlich die Objektträger unter einem Standard-Hellfeldmikroskop. Doppel-Z-Exon-Junction-Sonden wurden für die Bestimmung des EGFRvIII-Status in zwei Formalin-fixierten Paraffin-Embedded- oder FFPE-Glioblastomproben entwickelt. Beide Wildtyp-Sonden detektierten in beiden Proben Signale, was darauf hindeutet, dass die beiden Proben Wildtyp-EGFR exprimieren.

Die mutierte Sonde detektierte jedoch nur das Signal in der EGFRvIII-positiven Probe und nicht in der EGFRvIII-negativen Probe. Positiv- und Negativkontrollsonden wurden in den Assay einbezogen. Bei der Durchführung eines Short-Target-Assays an Jurkat-Zellen, die als FFPE-Zellpellet mit Antisense- oder Sense-Sonden präpariert wurden und auf die roten Sequenzen abzielten, wurde eine robuste Färbung mit Antisense-Sonden sowohl für CDR3-alpha als auch für CDR3-beta beobachtet, während Sense-Sonden wenig bis gar kein Signal detektierten.

Als Negativkontrolle wurde dapB verwendet. Der Assay ist auch in der Lage, Punktmutationen nachzuweisen. In diesem Beispiel wurden zwei Sonden entwickelt, eine zum Nachweis der L858R-mutierten EGFR-Sequenz und eine andere zum Nachweis der EGFR-L858-Wildtyp-Sequenz.

Die mutierte Sonde detektierte ein Signal in der H1975-Zelllinie, die heterozygot für die EGFR L858R-Mutation ist, aber kein Signal in der H2229-Zelllinie, die nur den EGFR L858-Wildtyp exprimiert. Die Wildtyp-Sonde hat das Signal in beiden Zelllinien detektiert. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Ihr Gewebe richtig zu fixieren, positive und negative Kontrollsonden laufen zu lassen und das Objektträgerverarbeitungssystem im Hybridisierungsofen zu verwenden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie IHC mit Zellmarkern durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Identifizierung der zelltypspezifischen Expression von Spleißvarianten oder kurzen Zielsequenzen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in den Neurowissenschaften, der Onkologie und darüber hinaus, um alternative Spleißereignisse im Gewebekontext zu erforschen, räumlich kartierte Punktmutationen zu identifizieren und hochgradig homologe und kurze Sequenzen in situ zu visualisieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit neutral gepuffertem Formalin und Xylol äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einem Abzug und das Tragen persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.