Name: Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Lernen Sie die biochemische Charakterisierung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität in vitro mit rekombinanten Enzymen. Diese einfache Methode ermöglicht die direkte Detektion kovalenter RNA-Modifikationen.

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Wir möchten Dr. David Engelke für seine Führung und hilfreichen Kommentare auf dieser Handschrift zu danken. PJS - Ball State University Labor Start Mittel; DAB - 1R15AI130950-01 zu gewähren.

Hinweis: Das Protokoll wurde vom Ref. 24angepasst.
1. besorgen Sie RNA und Enzym von Interesse
<ol><li>Einsatz in Vitro transkribiert RNAs intern mit 32P gekennzeichnet, und rekombinante His6-Mod5 ausgedrückt und von E. Coli, wie zuvor beschrieben24gereinigt.<ol>
<li>Einführung in Vitro transkribiert RNAs (Abschnitt 3) T7-RNA-Polymerase im Beisein von unbeschrifteten ATP, UTP, CTP, GTP und 10 µCi Gel gereinigt, Ethanol ausgefällt α-ATP, mit Nukleinsäuretablette in 1 X TE (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 0,1 mM EDTA), und bei-80 ° C gelagert 24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativ erhalten Sie im Handel erhältlichen eindringmittel beschrifteten RNAs von Interesse. Die Enzyme(s) des Interesses an einer bevorzugten Expressionssystems zu produzieren. Achtung: Interne fluoreszierende Tags in der RNA RNA-Struktur verändern können und Anerkennung durch Enzyme.</li>
</ol>2. bereiten Sie einen 20 % Polyacrylamid Gel Denaturierung
Hinweis: Zur Erlangung ausreichenden Auflösung von RNA-Fragmenten ist eine 40 cm Länge vertikale Platte Gel empfohlen. Die Breite des Gels verwendet richtet sich nach der Anzahl der Proben analysiert werden.
<ol><li>Glasplatten gründlich zu reinigen. Zuerst mit Seife und Wasser waschen, mit entionisiertem Wasser abspülen und anschließend mit Isopropanol und fusselfreien Tüchern reinigen.</li>
	<li>Montieren Sie die Platten und Distanzscheiben.</li>
	<li>Die folgenden Reagenzien um 100 mL 20 % Acrylamid, 7,5 M Harnstoff, 1 X TBE Gel zu mischen: 80 mL Harnstoff Gel konzentrieren (237,5 g/L von Acrylamid, 12,5 g/L Methylen Bisacrylamide, 7,5 M Harnstoff in entionisiertem Wasser), 10 mL von Harnstoff Gel Verdünnungsmittel (7.5M Harnstoff in entionisiertem Wasser) , und 10 mL Harnstoff Gel Puffer (0,89 M Tris-Borat-20 mM EDTA Puffer pH 8,3 und 7,5 M Harnstoff). Hinweis: Das Volumen der Gel-Lösung muss entsprechend dem Umfang des Gel angepasst werden.</li>
	<li>40 µL N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) und 800 µL frisch zubereitete 10 % Ammonium Bleichen (APS) hinzufügen.</li>
	<li>Auszuarbeiten Sie Gel-Lösung, in eine große Spritze und zwischen Glasplatten zu verzichten. Tippen Sie auf Glas mit den Fingern beim Ausgießen, um Blasenbildung zu vermeiden.</li>
	<li>Lassen Sie Gel für 30 min zu festigen.</li>
	<li>Klemmen Sie erstarrten Gel auf vertikale Gel Apparat mit Binder Clips.</li>
	<li>Füllen Sie die oberen und unteren Puffer Kammern mit 1 X TBE.</li>
	<li>Zwei Stunden vor dem Laden des Gels vor laufen das Gel bei 20 mA, 2 h, die Puffer-Grenze, die kleinste Oligonucleotides - überholen lassen sonst die kleinste Nukleotide und Oligonukleotide tendenziell Puffer vorne zusammenbrechen.</li>
</ol>3. RNA Isopentenylation Assay
<ol><li>Bereiten Sie Reaktionen in einem Endvolumen von 17 µL mit 58 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1,2 mM ATP, 5,8 mM MgCl2, 0,2 mM DMAPP, 10 U RNase-Inhibitor (z.B.SuperRNaseIn), 40.000 CPM intern 32P-Label RNA, 5,3 µM Mod5, und 1,2 mM 2 - Mercaptoethanol.</li>
	<li>Inkubieren Sie Reaktionen bei 37 ° C für 1 h.</li>
	<li>Ethanol-Niederschlag RNAs mit 2,5 Bände (42.5 µL) aus 100 % Ethanol und 1/10 Bände (1,7 µL) von 3,5 M Natrium Acetat pH 5,5 und Ort bei-20 ° C für 1 Stunde oder über Nacht.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie RNA-Proben für 20 min bei 15.400 x g und 4 ° C.</li>
	<li>Sorgfältig den überstand zu entfernen und Waschen der RNA-Pellet mit 500 µL 70 % Ethanol.</li>
	<li>Zentrifuge Proben bei 5 min 15.400 x g und 4° C.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die überstehenden und an der Luft trocknen RNA-Pellets für 15 Minuten, oder bis alle Ethanol verdampft ist.</li>
	<li>RNA-Pellets in 10 µL von 8 M Harnstoff aufzuwirbeln.</li>
	<li>150 U RNase T1 hinzufügen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 2 µL 6 x Ladepuffer (60 % Glycerin, 0,1 % Xylol Cyanol).</li>
	<li>Laden Sie 10 µL jeder RNA-Probe auf einem vor dem Rechenlauf, 20 % Polyacrylamid, 7,5 M Harnstoff Gel (siehe Abschnitt 2 des Protokolls). Hinweis: Radioaktiven RNA Größe Leitern können als eine zusätzliche Mobilität Marker einbezogen werden.</li>
	<li>Gel für 2 h Laufzeit 25 mA.</li>
	<li>Gel zu stoppen und vom Gerät entfernen.</li>
	<li>Pause zwischen den beiden Glasplatten zu versiegeln und entfernen Sie eine der Glasplatten mit dem Gel auf die "Bodenplatte". Hinweis: Achten Sie darauf, nicht um das Gel während dieses Schrittes zu reißen.</li>
	<li>Legen Sie eine Schicht aus Plastikfolie über das Gel und alternativ auf einem Phosphor-Bildschirm für 3 h entlarven, Chromatographiepapier Gel auflegen und Trocknen mit einem Trockner vor der Phosphor Bildschirm Belichtung Gel.</li>
	<li>Bild-Phosphor-Bildschirm auf einem Phosphor Imager.</li>
</ol>

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<li>Kernohan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matchmaking+facilitates+the+diagnosis+of+an+autosomal-recessive+mitochondrial+disease+caused+by+biallelic+mutation+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+%28TRIT1%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutations%22%5BJournal%5D)">Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene.</a> Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).</li>
<li>Yarham, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+i6A37+modification+of+mitochondrial+and+cytosolic+tRNAs+results+from+pathogenic+mutations+in+TRIT1+and+its+substrate+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA.</a> PLoS Genetics. 10 (6), 1004424(2014).</li>
<li>Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoplasmic+and+nuclear+populations+of+the+eukaryote+tRNA-isopentenyl+transferase+have+distinct+functions+with+implications+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer.</a> Gene. 556 (1), 13-18 (2015).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+have+a+limited+set+of+tRNA+anticodon+loop+substrates+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+TRIT1+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).</li>
<li>Swoboda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimelanoma+CTL+recognizes+peptides+derived+from+an+ORF+transcribed+from+the+antisense+strand+of+the+3%27+untranslated+region+of+TRIT1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009(2015).</li>
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<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+polymorphisms+and+haplotype+in+the+region+of+TRIT1%2C+MYCL1+and+MFSD2A+with+the+risk+and+clinicopathological+features+of+gastric+cancer+in+a+southeast+Chinese+population%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population.</a> Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).</li>
<li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+characterization+of+the+candidate+tumor+suppressor+gene+TRIT1+in+human+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer.</a> Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).</li>
<li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethnic+differences+in+frequencies+of+gene+polymorphisms+in+the+MYCL1+region+and+modulation+of+lung+cancer+patients%27+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival.</a> Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).</li>
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</ol>

Keiner, offen zu legen.

RNA-Änderungen weiterhin nachgewiesen werden, dass immer mehr wichtige und vielfältige Rollen in zellulären und organismal Funktion zu spielen. Als solche ist die Entwicklung von Assays RNA ändern Enzyme Verhören zentral zu einem besseren Verständnis der grundlegenden Aspekte der Biologie. Dieses Protokoll beschreibt einen hochauflösende in Vitro Assay zur Charakterisierung der tRNA Modifikation Aktivität von Mod5.
Dieses Protokoll hat den entscheidenden Vorteil bietet eine direkte un...

Mindestens 163 verschiedene posttranskritionelle RNA Modifikationen wurden identifiziert, mit diesen Änderungen Übertragung vielfältige und Kontext-abhängige Funktionen RNAs direkt RNA-Struktur zu beeinflussen und Auswirkungen auf die Beziehungen der RNA Moleküle1,2. Mit zunehmender Wertschätzung für die Anzahl und Vielfalt der RNA Änderungen ist es wichtig, Tests zu entwickeln, die zuverlässig zu verhören kann die RNA-Modifikationen und die Enzyme, die sie katalysieren.
Eine der ersten RNA Änderungen identifiziert werden erfolgt auf Basis 37 in tRNAs, angrenzend an das Anti-Codon auf 3' Seite3,4. Eine Isopentenyl-Gruppe von Dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) auf die N6-Position von Adenosin 37 übertragen (ich6A37) 3,5 auf eine Teilmenge der zytoplasmatischen und mitochondriale tRNAs. Ich6A37 verbessert die Übersetzung Treue und Effizienz durch eine Erhöhung der tRNA-Affinität für das Ribosom4,6 und ich6A37 ist wichtig für die Stress-Reaktion in Bakterien7. Die Enzyme, die diese Änderung durchführen werden tRNA Isopentenyl Transferasen bezeichnet und sind hoch konserviert in Bakterien8,9, Pilze10Würmer11, Pflanzen12und höheren Eukaryoten13 , einschließlich Menschen14.
Mutationen im menschlichen tRNA Isopentenyl Transferase Gens, TRIT1, sind menschliche Krankheiten zugeordnet. Zum Beispiel ist eine Mutation im TRIT1 mit einer schweren mitochondrialen Erkrankung, wahrscheinlich verursacht durch einen Defekt im mitochondrialen Protein Synthese15,16korreliert. Darüber hinaus TRIT1 wurde beschrieben als ein Tumorsuppressor Gen17,18 und ist in verschiedene Arten von Krebs einschließlich Melanom19, Brust20, Magen-21und Lungenkrebs22 verwickelt ,23. Zu guter Letzt TRIT1 und Mod5 (Saccharomyces Cerevisiae) Isopentenyl Transferasen sind Aggregation neigen Proteine, die Prion-wie Amyloid Fasern24,25,26bilden. Diese Beobachtungen implizieren potenziell tRNA Isopentenyl Transferasen bei neurodegenerativen Erkrankungen, obwohl direkte Beweise für diese noch nicht gezeigt wurde.
Angesichts der Rolle, dass Isopentenyl Transferasen in Übersetzung und Krankheit, Methoden, mit denen direkt ich6Messen spielen eine Isopentenyl-Transferase-Aktivität sind wichtig für ein mechanistisches Verständnis dieser Enzyme unter normalen Bedingungen und Krankheitszustände. Eine wachsende Zahl von Methoden stehen zur Erkennung ich6A RNA Änderungen, einschließlich der in-vitro- Isopentenylation-Assays, positive Hybridisierung in Ermangelung von i6(PHA6) Tests, thin Layer Chromatography (TLC), Aminosäure Akzeptanz-Aktivität-Assays und Massenspektrometrie Ansätze (bewertet in Ref. 4).
Ein in-vitro- Isopentenylation-Assay ist beschrieben worden, die 14C-DMAPP und unbeschriftete tRNAs verwendet. In diesem Test wird radioaktiven Kohlenstoff an RNA von 14C-DMAPP durch Isopentenyl-Transferase übertragen. Während dieses Tests sehr empfindlich ist, ist es oft schwierig zu bestimmen, dass bestimmte Rückstände, die9,20,27geändert. PHA6 Assays verlasse ich mich auf die sperrigen6A Änderung Hybridation von 32P-markierten Sonden überspannt die modifizierte Rückstände zu stören. Als solche Hybridisierung ist größer bei fehlender ein i6eine Änderung18,28,29. PHA6-Assays sind hochsensible und geeignet zur Analyse von Gesamt-RNS von zellulären Lysates extrahiert. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, Sonden spezifisch auf die RNA von Interesse zu entwerfen diese Methode wesentliche Ziel Flexibilität. PHA6-Assays sind jedoch beschränkt auf die Charakterisierung der Änderungen, die auf Rückstände in der gezielten Region der Sonde auftreten und sind daher weniger wahrscheinlich neue Modifikation Websites identifizieren. Darüber hinaus fehlen verbindliche Richtwerte der Änderung ist, werden andere Veränderungen oder Mutationen, die RNA-bindende beeinflussen Datenanalyse verwechseln.
Ein weiterer Ansatz verbindet Benzyl DEAE Zellulose (BD) Zellulose Chromatographie mit Aminosäure Akzeptanz Aktivität als ein Auslesen von i6A Modifikationen in tRNA30. Dieser Ansatz Proben direkt die Funktion des i6A Änderung, sondern es ist eine indirekte Annäherung an erkennen ich6A Änderung und Auflösung zuordnen Änderungen an eine bestimmte Rückstände in der RNA fehlt. Ein TLC-Ansatz verwendet wurde, um insgesamt tRNA erkennen ich6A Modifikationen. Bei diesem Ansatz intern 32P-Label tRNAs werden einzelne Nukleotide verdaut und zweidimensionale TLC-Analyse wird verwendet, um Isopentenylation zu identifizieren. Dieser Ansatz ist sehr empfindlich bei der Aufdeckung von total ich6A in einer bestimmten RNA-Probe aber auf Verdauung, alle sequenzinformation ist verloren; So hat der Prüfer keineswegs zur Bestimmung, welche Rückstände veränderter31gewesen sein.
Vor kurzem sind flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Methoden entwickelt worden, die total RNA-Änderungen zwischen Arten, Zelltypen und Versuchsbedingungen32,33quantitativ zu vergleichen, 34. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass es weniger in der Lage zu bestimmen, dass die Identität und die Position innerhalb der RNA aus dem modifizierten Nukleosid war34abgeleitet. Darüber hinaus begrenzen das Know-how und die notwendige Ausrüstung für diese Experimente führen die Praktikabilität dieses Ansatzes.
Darüber hinaus entstanden mehrere Next Generation Sequencing Technologien um RNA Modifikationen Transkriptom-weite34zuzuordnen. Immunopräzipitation RNAs mit Antikörpern, die spezifisch für eine bestimmte Änderung (RIP-Seq) ermöglichen die Ermittler alle Sequenzen mit einer spezifischen Änderung35,36zu identifizieren. Darüber hinaus setzen Reverse-Transkriptase-basierte Ansätze wie Chem-Seq und nicht-zufällige Abweichung Sequenzierung auf Störungen der reversen Transkription Reaktion bei der modifizierten Rückstände37,38,39. Trotz der Vorteil dieser Techniken RNA Modifikationen Transkriptom-weiten zuordnen sind RIP-Seq und Chem-Seq-Technologien durch den Mangel an zuverlässigen Antikörper oder reaktiven Chemikalien für jede gezielte Modifizierung bzw.34begrenzt. Darüber hinaus Enzyme Reverse Transkriptase verpflichtet, Chem-Seq durchführen und nicht-zufällige Abweichung Sequenzierung Techniken können durch stabile RNA-Strukturen behindert werden. Die stark veränderte und strukturell stabile Natur der tRNAs machen sie besonders schwierig, mit diesen Techniken zu befragen. Bisher wurden Sequenzierung-basierten Technologien der nächsten Generation nicht noch auf Karte ich6Modifikationen34genutzt.
Hier beschreiben wir einen einfachen und direkten Ansatz, ich6A tRNA Änderungen in Vitrozu erkennen. Diese Methode nutzt Inkubation von RNAs mit rekombinanten S. Cerevisiae Isopentenyl-Transferase (Mod5), gefolgt von RNase T1 Verdauung und 1-dimensionale Elektrophorese Gelanalyse zuordnen ich6A Modifikationen. Dieser Ansatz ist direkt und erfordert wenig Fachwissen zum Analysieren der Daten. Darüber hinaus ist diese Methode anpassungsfähig an andere RNA, Enzyme, einschließlich Enzyme, die das Molekulargewicht der RNA oder einer RNA Mobilität durch ein Gel kovalent ändern ändern.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UreaGel Konzentrat</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Als Teil eines Kits</td></tr><tr><td>UreaGel Diluent</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Als Teil eines</td></tr><tr><td>Kits UreaGel Buffer</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Als Teil eines Kits</td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Als Teil eines Bausatzes</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylendiamin (TMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Trisbase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34369-07-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>DMAPP</td><td>Caymen Chemical</td><td>1186-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Super RNaseIN</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Xylolcyanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Equipment and Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Short Glass Plates (20-40 cm B x 40 cm L)</td><td>The Gel Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lange Glasplatten (20-40 cm B x 40 cm L)</td><td>The Gel Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vertikales Gelgerät</td><td>The Gel Company</td><td>S2-3040</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Einwegspritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-26</td><td></td></tr><tr><td>Bindemittelclips aus Edelstahl</td><td>Idea Scientific</td><td>1066</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoscreen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>Plastikfolie</td> <td>(örtliches Lebensmittelgeschäft)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein in vitro- test zur erkennung der trna-isopentenyl-transferase-aktivität

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6- Isopentenyladenosine RNA Modifikationen sind funktional vielfältig und hoch konservierte zwischen Prokaryoten und Eukaryoten. Eine der am meisten hoch konservierten N6- Isopentenyladenosine Änderungen tritt an der A37 Position in eine Teilmenge der tRNAs. Diese Änderung verbessert Übersetzung Effizienz und Genauigkeit durch die Erhöhung der Affinität der tRNA für das Ribosom. Mutation von Enzymen verantwortlich für diese Änderung in den Eukaryotes sind mit verschiedenen Krankheitszuständen, einschließlich mitochondriale Dysfunktion und Krebs in Verbindung gebracht. Daher ist es wichtig für das Verständnis der normalen und pathologischen eukaryotic Biologie, Verständnis für die Substratspezifität und biochemischen Aktivitäten dieser Enzyme. Eine Vielfalt von Methoden wurde eingesetzt, um ich6A Modifikationen zu charakterisieren. Hierin wird einen direkten Zugang zur Erkennung von Isopentenylation durch Mod5 beschrieben. Diese Methode nutzt Inkubation von RNAs mit einem rekombinanten Isopentenyl-Transferase, gefolgt von RNase T1 Verdauung und 1-dimensionale Elektrophorese Gelanalyse ich6A Änderungen zu erkennen. Darüber hinaus ist die mögliche Anpassungsfähigkeit dieses Protokolls zum anderen RNA-modifizierende Enzyme charakterisieren diskutiert.

Mod5 wurde mit einem Tyrosin inkubiert tRNA oder Serin tRNA in der Anwesenheit oder Abwesenheit von DMAPP. Im Anschluss an die Änderung Reaktion waren die RNase T1 verdaut, die bindet des 3'-Ende von allen Guanosines ein 3' Guanosin Monophosphates (GMP)24 (Abbildung 1) verlassen. Vollständige Verdauung des RNAs produziert einem vorhersagbaren Muster der radioaktiven Fragmente (Abb. 2A), di...

Hier haben wir ein Protokoll für die biochemische Charakterisierung der Hefe RNA-modifizierende Enzym, Mod5, beschreiben und diskutieren, wie dieses Protokoll auf andere RNA-modifizierende Enzyme angewendet werden könnte.

Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die tRNA-Isopentenyl Transferase Activity In Vitro biochemisch zu charakterisieren. Diese Methode ist nützlich für den In-vitro-Nachweis und die Charakterisierung der tRNA-isopentenyltransferase Aktivität von gereinigten rekombinanten Enzymen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es sich um einen einfachen und direkten Assay handelt, der verwendet wird, um eine kovalente RNA-Modifikation zu detektieren.Obwohl diese Methode Einblicke in die tRNA-isopentenyl transferase Aktivität bietet, ist es potenziell anpassungsfähig für die biochemische Charakterisierung von breiten Spektrum oder RNA modifizierenden Enzymen. Der erste Schritt in diesem Verfahren ist die gründliche Reinigung der Glasplatten, die zum Gießen des Gels verwendet werden. Waschen Sie die Platten mit Seife und Wasser, spülen Sie gut mit entionisiertem Wasser, und reinigen Sie dann die Platten mit Isopropanol und fusselfreien Tüchern.Als nächstes montieren Sie die Platten und Abstandshalter. Mischen Sie die folgenden Reagenzien, um ein 100 Milliliter 20%Acrylamid, 7,5 Molarenharnstoff, 1x TBE-Gel herzustellen. 80 Milliliter Harnstoffgelkonzentrat, 10 Milliliter Harnst

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines synthetischen tRNA Substrat für...

In-vitro-tRNA Methylierungs-Assay mit der Entamoeba histolytica DNA und tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Ein wesentliches Hindernis für biochemische Analysen von Ribosomen, die im Entstehen begriffenen Peptidyl-tRNAs hat das Vorhandensein von anderen Ribosomen in der gleichen Proben, Ribosomen nicht in der Übersetzung der spezifischen mRNA-Sequenz, die analysiert werden beteiligt. Wir entwickelten eine einfache Methode, um zu reinigen, ausschließlich, den Ribosomen, welche die entstehenden Peptidyl-tRNA von Interesse.

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Die Bemühungen um die katalytische Untereinheit der Telomerase zu isolieren, TERT, in ausreichenden Mengen für strukturelle Studien haben mit begrenztem Erfolg seit mehr als einem Jahrzehnt getroffen. Hier präsentieren wir Methoden zur Isolierung des rekombinanten Tribolium castaneum TERT...

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur RNA / Protein-Interaktionen zu untersuchen. Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) auf der differentielle Migration RNA / Protein-Komplexe und freie RNA während nativer Gelelektrophorese. Durch Verwendung eines radioaktiv markierten RNA-Sonde kann RNA / Protein-Komplexe durch Autoradiographie visualisiert werden.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel

Gallium (III) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole und seine Freebase analogen aufweisen niedrigen mikromolaren Zell-Zytotoxizität. Diese Handschrift beschreibt ein RNA-Transkriptionsreaktion, Imaging-RNA mit einem Ethidiumbromid-gefärbten Gel und Quantifizierung RNA mit UV-Vis-Spektroskopie, um die Transkription Hemmung durch Corrolen bewerten und zeigt eine einfache Methode zur Bewertung Krebskandidat Eigenschaften.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Enzymatic Assay zur Transcription Hemmung durch Gallium (III) und H messen<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) Corrole

Der vorliegende Bericht beschreibt einen enzymatischen In-vitro-Assay zur Messung der Phosphatidylethanolamin-Methyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Leishmania-Zellextrakten. Dieser Assay basiert auf der Übertragung einer radioaktiven Methylgruppe von S-[Methyl-3-H]adenosyl-L-methionin auf endogenes Phosphatidylethanolamin.

In vitro-Test an Phosphatidylethanolamin Methyltransferase-Aktivität zu messen

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur funktionellen Untersuchung der Transkription und der inhibitorischen Aktivität von antibakteriellen Wirkstoffen, die auf die bakterielle Transkription abzielen.

In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery

Ein Protokoll wird für die Produktion von tRNA (UUU) und die Analyse von tRNA (UUU) im Komplex mit dem Enzym TcdA durch Agarose-Gel-Retardierungs-Assays vorgestellt.

Protein-tRNA-Agarose-Gel-Retardations-Assays für die Analyse der<em&gt; N.</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosin TcdA-Funktion

Wir legen ein Protokoll vor, um die mRNA-Übersetzungsverordnung in poxvirus-infizierten Zellen zu untersuchen, die in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter Assay verwendet werden. Der Test kann für das Studium der Übersetzungsregulierung durch cis-Elemente einer mRNA verwendet werden, einschließlich 5 '-unübersetzter Region (UTR) und 3 '-UTR. Mit dieser Methode können auch verschiedene Übersetzungsinitiationsmodi untersucht werden.

In Vitro Transcribed RNA-basierter Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infizierten Zellen

Hierwird wird ein antikörperfreier In-vitro-Assay zur direkten Analyse der Methyltransferase-Aktivität an synthetischer oder in vitro transkribierter RNA beschrieben.

Antikörperfreier Assay für rna-Methyltransferase-Aktivitätsanalyse

Das Nachverfolgen einzelner Übersetzungsereignisse ermöglicht hochauflösende kinetische Studien von kappenabhängigen Translationsmechanismen. Hier zeigen wir einen in vitro Einzelmolekül-Assay basierend auf bildgebenden Wechselwirkungen zwischen fluoreszierend markierten Antikörpern und epitopmarkierten aufkommenden Peptiden. Diese Methode ermöglicht die Einzelmolekülcharakterisierung der Initiations- und Peptiddehnungskinetik während der aktiven in vitro capabhängigen Translation.

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Lernen Sie die biochemische Charakterisierung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität in vitro mit rekombinanten Enzymen. Diese einfache Methode ermöglicht die direkte Detektion kovalenter RNA-Modifikationen.

Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

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