Funktionelle Charakterisierung von Carboxylesterases in Insektizid gegen Stubenfliegen, Musca Domestica

Diese Methode kann bei den zentralen Fragen der Insektentoxikologie helfen, z.B. ob alle exprimierenden metabolischen Entgiftungsgene an der Insektizidresistenz beteiligt sind? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, größere Mengen an Proteinen herzustellen und die Funktion dieser Proteine bei der Metabolisierung von Insektiziden in vitro zu charakterisieren. Die Verfahren werden von Xuechun Feng, einem Doktoranden in meinem Labor, vorgeführt.

Xuechens Doktorarbeit konzentriert sich auf die Charakterisierung der Funktion der Carboxylesterase bei der Parasitenresistenz von Stubenfliegen, Musca domestica. Mischen Sie zunächst einen Mikroliter GFP-Eintrittsplasma-DNA mit fünf Mikrolitern einer kommerziell erhältlichen linearen C-Term-DNA in 250-Mikroliter-PCR-Röhrchen. Geben Sie als Nächstes zwei Mikroliter der im Handel erhältlichen Lambda-Rekombinationsmischung in jedes der PCR-Röhrchen.

Mischen Sie die Röhrchen vorsichtig und inkubieren Sie sie über Nacht bei 25 Grad Celsius. Säen Sie zwei Milliliter SF9-Zellkultur für das Wachstum in der logarithmischen Phase gleichmäßig in die Vertiefungen einer Zellkulturplatte. Lassen Sie die Zellen dann mindestens drei Stunden lang bei Raumtemperatur in der Haube anlagern.

Überprüfen Sie mit einem Inversphasenmikroskop bei 250x die Zellanhaftung. Entfernen Sie dann das Zellkulturmedium und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter des Insektenmediums von Grace. Bereiten Sie danach die Transfektionsmischung A und B-Lösungen gemäß dem Textprotokoll vor.

Mischen Sie dann die Transfektionsmischungen A und B vorsichtig miteinander, indem Sie auf die Röhrchen klopfen. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur in der Haube 35 Minuten lang. Geben Sie dann die Mischung tropfenweise auf die ausgesäten Zellen.

Verschließen Sie die Vertiefungen mit Klebeband und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 27 Grad Celsius. Ersetzen Sie die zwei Milliliter von Graces Insektenmedium durch zwei Milliliter vollständiges Wachstumsmedium. Geben Sie dann 100 Mikromol Ganciclovir in jede Vertiefung

Verschließen Sie die Vertiefungen mit Klebeband und inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang bei 27 Grad Celsius. 72 Stunden nach der Infektion, sammeln Sie das Medium aus jeder Vertiefung und geben Sie es in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Dann zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1500 mal G, fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Geben Sie einen Milliliter des vollständigen Wachstumsmediums in die Vertiefung und verwenden Sie ein Mikroskop mit Fluoreszenzlicht, um die Infektionszeichen der Zellen im Stadium der P1-Baculovirus-Amplifikation zu beobachten. Füllen Sie den Überstand in neue 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen um und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius unter dunklen Bedingungen. Danach säen Sie zwei Milliliter SF9-Zellkultur aus dem Log-Phasen-Wachstum gleichmäßig in die Vertiefungen einer Zellkulturplatte.

Lassen Sie die Zellen mindestens drei Stunden lang bei Raumtemperatur in der Haube anlagern. Impfen Sie fünf Mikroliter P1-Virusbestand in die mit der Zellaussaat bestückten Vertiefungen und fügen Sie dann 100 Mikromol Ganciclovir in jede Vertiefung hinzu. Verschließen Sie die Vertiefungen und inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang bei 27 Grad Celsius.

Zunächst werden fünf Milliliter SF9-Zellen von Insekten mit logaritärem Phasenwachstum mit vollständigem Wachstumsmedium in unbehandelten T25-Kolben kultiviert. Fügen Sie dann 25 Mikroliter P1-Virus-Stammlösung hinzu, um die Zellkultur 48 Stunden lang unter leichtem Schütteln bei 27 Grad Celsius zu infizieren. Bereiten Sie unter Verwendung von Acetonitril serielle Verdünnungen von 100 Millimol Permethrin vor.

Anschließend werden 200 Mikroliter infizierter Zellkulturen, ergänzt mit 300 Mikrolitern komplettem Wachstumsmedium, in eine 24-Well-Platte gegeben. Stellen Sie sicher, dass Permethrin vollständig im Acetonitril gelöst und gleichmäßig in jede Vertiefung der Platte abgegeben wird. Nachdem Sie das Permethrin hinzugefügt haben, schütteln Sie die Platte vorsichtig, um das Permethrin vollständig mit dem Medium zu vermischen.

Verschließen Sie danach die Platte mit Klebeband und inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang bei 27 Grad Celsius unter dunklen Bedingungen. Entfernen Sie das Zellkulturmedium von der Platte, ohne die unten befestigte Zellschicht zu stören. Geben Sie 200 Mikroliter des MMT-Reagenzes in jede Vertiefung.

Inkubieren Sie die Platte dann vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius, bis sich in jeder Vertiefung dunkelviolette Formazan-Ausfällungsmittel bilden. Geben Sie 500 Mikroliter DMSO in jede Vertiefung, um die Fällungsmittel vollständig aufzulösen. Übertragen Sie dann 200 Mikroliter der gelösten Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.

Die vollständige Auflösung des Niederschlags in DMSO ist entscheidend für die Genauigkeit der Ergebnisse. Nach der Zugabe des DMSO zu den Proben in der Platte werden die Proben mit der Pipette mehrmals gewaschen, bis sich der Niederschlag vollständig aufgelöst hat. Verwenden Sie abschließend einen Mikroplatten-Reader, um die Absorptionswerte der Platte bei 540 Nanometern zu messen.

Im P1-Stadium ist die Infektionsrate gering. Im P2-Stadium war das Infektionsverhältnis signifikant erhöht. Im Stadium der P3-Infektion zeigten fast alle Zellen Symptome der Ablösung von der Zellkulturplatte, der Vergrößerung des Zelldurchmessers sowie der Beendigung des Zellwachstums.

Basierend auf den detektierten Absorptionswerten zeigten die Md alpha E7-exprimierenden Zellen eine signifikant höhere Viabilität im Vergleich zu den Kontroll-CAT-Zellen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine Zellkontamination in allen Schritten zu verhindern, indem die Oberfläche von Gegenständen wie Flaschen und Tuben vor der Durchführung der Zellexperimente mit 70 Prozent Ethanol abgewischt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können einige andere Methoden, wie die Homologiemodellierung und die Dunkelanalyse, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Wechselwirkungen zwischen dem Carboxylesterase-Protein und dem Permethrin-Liganden.

Diese Technik ebnete den Forschern in der Insektentoxikologie den Weg, um die funktionelle Charakterisierung der Gene und Mechanismen der Insektizidresistenz von Insekten zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Insektiziden sehr schädlich sein kann und bei der Durchführung dieser Eingriffe immer Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe und Laborkittel getroffen werden sollten.