Isolierung und Identifizierung von Extravascular Immunzellen des Herzens
23. August 2018
Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Methode, um zu isolieren, Identifikation und Quantifizierung von Immunzellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von Mäusen im Steady-State oder Entzündungen. Das Protokoll kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung zur Erzeugung einer einzelnen Zelle Suspension, die weiter durch Durchflusszytometrie analysiert werden können.
Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen über die Zusammensetzung von Immunzelluntergruppen im Herzen zu beantworten, sowohl im stationären als auch im Krankheitszustand. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie für eine genaue Immunphänotypisierung von kardialen Immunzellpopulationen, einschließlich sehr seltener Untergruppen, verwendet werden kann. Dieses Protokoll ist relativ einfach.
Schwanzveneninjektionen können jedoch schwierig sein, daher ist es wichtig, diese Technik zu üben, bis Sie sich wohl fühlen, bevor Sie Versuchstiere verwenden. Um die zirkulierenden Leukozyten zu markieren, geben Sie 200 Mikroliter frisch zubereiteten Maus-Fluorophor-konjugierten Anti-CD45-Antikörper in PBS in eine 28,5-Gauge-Insulinspritze und wärmen Sie acht 12 Wochen alte Mäuse auf einer zirkulierenden Wasserdecke, die auf 35 bis 41 Grad Celsius eingestellt ist, fünf bis zehn Minuten lang vor. Wenn sich die Schwanzvene erweitert hat, halten Sie das erste Tier in der Brustbeinposition mit einer geeigneten Rückhaltevorrichtung fest.
Wenn die Schwanzvenen nicht ausreichend erweitert sind, tauchen Sie den Schwanz für ein bis zwei Minuten in 36 bis 40 Grad warmes Wasser. Wenn die Schwanzvenen fertig sind, tupfen Sie den Injektionsbereich mit 70%iger Ethanol-getränkter Gaze ab und immobilisieren Sie die Basis des Schwanzes mit dem Zeige- und Mittelfinger und den mittleren distalen Bereich des Schwanzes mit Daumen und Ringfinger. Halten Sie die Nadel mit der schrägen Seite nach oben und parallel zur Vene, führen Sie die Nadel in eine erweiterte Schwanzvene ein und injizieren Sie intravenös das gesamte Volumen des Antikörpers.
Lassen Sie den Antikörper dann fünf Minuten lang zirkulieren, bevor er human eingeschläfert wird. Um das Herz zu entnehmen, besprühen Sie die Maus mit 70%igem Ethanol und heben Sie die Haut des Bauches an, um den Bauch entlang der ventralen Mittellinie von den Hüften bis zum Brustbein zu öffnen. Öffnen Sie das Peritoneum und bewegen Sie die Leber, um das Zwerchfell freizulegen.
Schneiden Sie das Zwerchfell und die Rippen auf beiden Seiten der Mittellinie und achten Sie darauf, dass die Lunge und das Herz nicht durchstochen werden. Schälen Sie die Rippen zurück, um das Herz freizulegen, bevor Sie den linken und rechten Vorhof einschneiden. Fassen Sie vorsichtig mit einer Pinzette nach der Basis des Herzens, führen Sie eine 21-Gauge-Nadel, die an einer 60-Milliliter-Spritze befestigt ist, in den linken Ventrikel in der Nähe der Spitze ein und perfundieren Sie das Herz mit 15 bis 20 Millilitern kaltem PBS.
Eine gute Durchblutung des Herzens ist unerlässlich, um intravaskuläre Verunreinigungen zu vermeiden. Achten Sie daher darauf, das Herz nach der Euthanasie schnell zu präparieren und zu perfundieren, um eine Kontamination durch geronnenes Blut zu vermeiden. Nach der soeben gezeigten Perfusion des rechten Ventrikels sollten weiße Lungen und eine blasse Leber beobachtet werden.
Halten Sie die Basis des Herzens mit der Pinzette fest, ziehen Sie das Herz vorsichtig nach oben und durchtrennen Sie die großen Lungenarterien und -venen, die Aorta und den Perikardsack, um das Herzgewebe zu lösen. Halten Sie das Herz vorsichtig zwischen Daumen und Zeigefinger, reinigen Sie das Herz vorsichtig mit einem sauberen, fusselfreien Papiertuch und entfernen Sie mit der Pinzette die Vorhöfe und alle Überreste wichtiger Arterien und Venen oder andere Verunreinigungen. Legen Sie das gereinigte Herz in eine fünf Zentimeter große Plastikschale und fügen Sie 50 Mikroliter kaltes PBS hinzu.
Mit einer gebogenen Präparierschere das Herz so lange zerkleinern, bis keine Stücke mehr sichtbar sind und das Gewebe eine glatte, dicke Konsistenz hat. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um das Gewebe in Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen, die 800 Mikroliter kaltes DMEM enthalten. Mit Kollagenase, DNase und Hyaluronidase ergänzen und 45 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius und 50 U/min inkubieren.
Am Ende des Aufschlusses die Proben 20 Sekunden lang verziehen und sofort auf Eis legen. Die Probe sollte immer bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden, sofern nicht anders angegeben, da einige Oberflächenantigene internalisiert werden können, wenn sie bei Raumtemperatur gelagert werden. Anschließend wird ein 140-Mikroliter-Zellsieb in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen pro Probe mit einem Milliliter kaltem HBB vorbefeuchtet.
Pipettieren Sie die Proben mit einer Ein-Milliliter-Pipette, bis die Gewebesuspensionen homogen sind und die Pipettenspitze nicht verstopfen, und geben Sie die homogenisierten Proben in die Filter. Waschen Sie die Proben langsam mit 12 bis 14 Millilitern kaltem HBB pro Probe durch die Filter und geben Sie die gefilterten Proben in ein beschriftetes konisches 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Eine gute Verdauung zeigt sich darin, dass sich keine Herzreste im Filter befinden.
Die Proben werden durch Zentrifugation entnommen und der Überstand entfernt. Geben Sie einen Milliliter Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer zu jeder Probe. Resuspendieren Sie die Proben durch kurzes Vortexen, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur.
Stoppen Sie dann die Hämolyse mit fünf bis acht Millilitern kaltem HBSS. Sammeln Sie die Proben durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder FACS-Puffer und geben Sie sie für eine weitere Zentrifugation in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zur Analyse der Proben mittels Durchflusszytometrie resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikrolitern Anti-CD16/CD32-Antikörper und einem Monozytenblocker, um die unspezifische Antikörperbindung für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur zu reduzieren.
Geben Sie ohne Waschen 50 Mikroliter Antikörper-Mastermix zu jeder Probe und mischen Sie sie für eine 30-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius, die vor Licht geschützt ist. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben mit 600 Mikrolitern FACS-Puffer pro Röhrchen und resuspendieren die Pellets in 300 Mikrolitern frischem FACS-Puffer oder 1 % Paraformaldehyd. Analysieren Sie dann die kardialen Leukozyten mittels Durchflusszytometrie gemäß den Standardprotokollen der Durchflussanalyse.
Die Analyse der kardialen Einzelzellsuspension mittels Durchflusszytometrie erfordert ein Pre-Gating mit CD45, um Immunzellen von nicht-immunen Zellen des Herzens zu unterscheiden, gefolgt von einem Einzelzell- und Small Size Exclusion Gating. Makrophagen, die durch ihre CD64-Expression identifiziert werden, sind die wichtigste Immunzellpopulation des Herzens und machen 60 bis 70 % aller Immunzellen aus. Konventionelle dendritische Zellen des Herzens sind CD64-negative Zellen, die hohe Spiegel an MHC Klasse II und CD11c exprimieren.
Diese Zellen können anhand ihrer Expression von CD103 oder CD11b weiter unterteilt werden und stellen im Vergleich zu Makrophagen eine viel kleinere kardiale Subpopulation dar. Die Verwendung der Durchflusszytometrie einer Einzelzellsuspension des Myokards ermöglicht die Untersuchung kleiner Leukozyten-Subpopulationen im Herzen. Wenn beispielsweise die Immunzellen des Myokards von Wildtyp- und -Mäusen mit Hilfe der Durchflusszytometrie verglichen werden, kann das Fehlen von CD103-positiven dendritischen Zellen bei den Knockout-Tieren bestätigt werden.
Darüber hinaus ergab diese Analyse, dass es bei den Batf3-defizienten Tieren keine signifikante Veränderung der Zusammensetzung anderer kardialer Populationen gab, was den Grad der Sensitivität zeigt, der mit dieser kombinierten Methode des enzymatischen und mechanischen Verdaus erreicht werden kann, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, immer die Lebensfähigkeit Ihres Zellisolats zu berücksichtigen. Daher empfehlen wir, die Zeit und die Enzymkonzentration des Aufschlusses entsprechend Ihren Versuchsbedingungen zu optimieren.
Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. Einzelzell-RNA-Sequenzierung, funktionelle Assays und magnetische Bead-Isolierung, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Funktionen der isolierten Zellen zu beantworten.
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Übersicht
Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Methode zur Isolierung, Identifizierung und Quantifizierung von im Myokard von Mäusen angesiedelten Immunzellen während des Ruhezustands oder einer Entzündung vor. Die Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Zusammensetzung von Immunzellsubpopulationen im Herzen sowohl im Ruhezustand als auch bei Krankheitszuständen zu beantworten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Kardiologie
- Durchflusszytometrie
Hintergrund
- Das Herz enthält verschiedene Populationen von Immunzellen.
- Das Verständnis dieser Populationen ist entscheidend für die Herzgesundheit.
- Eine genaue Immunphänotypisierung ist notwendig, um seltene Immunzellsubpopulationen zu untersuchen.
- Injektionen in die Schwanzvene sind eine gängige Methode zur Markierung zirkulierender Leukozyten.
Zweck der Studie
- Isolierung und Quantifizierung von Immunzellen im Myokard.
- Analyse von Immunzellsubpopulationen während unterschiedlicher physiologischer Zustände.
- Verbesserung von Techniken zur Untersuchung kardialer Immunantworten.
Verwendete Methoden
- Enzymatische und mechanische Verdauung zur Herstellung einer Einzelzell-Suspension.
- Durchflusszytometrie zur Analyse von Immunzellpopulationen.
- Injektionen in die Schwanzvene mit fluorophor-konjugierten Anti-CD45-Antikörpern.
- Vorwärmen der Mäuse zur Erleichterung des Zugangs zur Schwanzvene.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Immunzellen aus dem Myokard von Mäusen.
- Identifizierung verschiedener Immunzellsubpopulationen.
- Nachweis der Wirksamkeit der Methode sowohl im Ruhezustand als auch in entzündlichen Zuständen.
- Hervorhebung der Bedeutung der Übung für erfolgreiche Injektionen in die Schwanzvene.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Untersuchung kardialer Immunzellen.
- Es vertieft das Verständnis der Immunantworten im Herzen.
- Die Technik ist für Forscher mit entsprechender Ausbildung zugänglich.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine präzise Profilierung kardialer Immunzellsubpopulationen ermöglicht die mechanistische Risikominderung bei der Validierung kardiovaskulärer Zielstrukturen, indem entzündliche Signalwege und immunvermittelte Wirkmechanismen geklärt werden. Diese Methode stärkt die Vorhersagekraft präklinischer Modelle, indem sie quantitative und reproduzierbare Immunphänotypisierungsdaten liefert, die über Go/No-Go-Entscheidungen in der frühen Entdeckungsphase informieren. Der Ansatz schließt eine entscheidende Lücke beim Studium seltener, aber funktionell bedeutender Immunpopulationen unter stabilen Bedingungen und erhöht so die translative Relevanz für immunkardiologische Programme.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung der Zusammensetzung immunologischer Zellen und der funktionellen Kompartimentalisierung im Myokard.
- Operationaler Wert: Bietet eine zuverlässige Methode, um echte gewebeeigene Immunsignale von intravaskulären Kontaminationen zu unterscheiden und verbessert dadurch die Datenintegrität.
- Strategischer Wert: Unterstützt die Risikominderung bei Zielstrukturen durch präzise Identifizierung von Makrophagen- und dendritischen Zellsubtypen, die an kardialer Entzündung und Fibrose beteiligt sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt eine standardisierte Einzelzell-Suspension, die für hochdimensionale Durchflusszytometrie-Panels geeignet ist und eine konsistente Immunphänotypisierung über verschiedene Experimente hinweg ermöglicht.
- Operationaler Wert: Kombiniert enzymatische und mechanische Digestion mit vaskulärer Markierung, um hohe Zellviabilität und Reinheit zu erzielen und die Variabilität des Assays zu verringern.
- Strategischer Wert: Etabliert einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Isolierung von Immunzellen, der auf verschiedene Krankheitsmodelle und Screening-Kampagnen übertragen werden kann.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die longitudinale Immunüberwachung vom Ruhezustand bis hin zu entzündlichen Zuständen und unterstützt so die Entdeckung von Biomarkern sowie mechanistische Erkenntnisse.
- Operationaler Wert: Die Ergebnisse sind kompatibel mit nachgeschalteten Anwendungen wie FACS-Sortierung, magnetischer Bead-Separation und Einzelzell-RNA-Sequenzierung zur funktionellen Validierung.
- Strategischer Wert: Ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem die Targetbindung und immunmodulatorische Wirkung in relevanten präklinischen Modellen bestätigt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung ein und liefert Daten zur Immunprofilerstellung, die Aufschluss über den Wirkmechanismus und die Sicherheitsbewertung in der kardiovaskulären Arzneimittelentwicklung geben.
- Entdeckungsbiochemie Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem die Quantifizierung wichtiger Immunzellsubpopulationen wie CD64+ Makrophagen und CD11c+ MHC-IIhi Dendritische Zellen im Herzen ermöglicht wird.
- Screening: Liefert quantitative, für die Durchflusszytometrie geeignete Einzelzell-Suspensionen, die den Vergleich der Immunzusammensetzung unter genetischen oder pharmakologischen Bedingungen ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt multiparametrische immunphänotypische Profile (z. B. Verhältnisse von CD103+ zu CD11b+ dendritischen Zellen), die zur Entschärfung von Zielstrukturen beitragen, indem sie subset-spezifische Reaktionen aufzeigen.
- Translationale Forschung Verbindet die Dynamik von Immunzellen mit dem Krankheitsverlauf und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern in Modellen kardialer Entzündung und Remodeling.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die grundlegende Strategie zur Isolierung und Markierung ist auf andere Organe und Krankheitsbereiche übertragbar und fördert die Standardisierung über verschiedene Plattformen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem eine zuverlässige Identifizierung seltener Immunzellsubpopulationen ermöglicht wird, die die kardiale Pathophysiologie antreiben.
- Operativer Wert: Standardisiert die Isolierung von Immunzellen durch definierte enzymatische Verdauung, vaskuläre Markierung und Strategien zur Torgate-Definition in der Durchflusszytometrie.
- Strategischer Wert: Verbessert die Portfolio-Priorisierung, indem Daten zu immunvermittelten Wirkmechanismen bereitgestellt werden, die Kombinationstherapien und Strategien zur Patientenstratifizierung informieren.
- Portfolio-Beitrag: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungsfindung durch reproduzierbare Quantifizierung von Veränderungen der Immunzellen in präklinischen Wirksamkeits- und Sicherheitsstudien.
Durchlegungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Nagern, Techniken zur Injektion in die Schwanzvene sowie aseptische Gewebedissektion, um die Probenqualität sicherzustellen.
- Setzt Zugang zu Durchflusszytometrieausrüstung, fluoreszenzmarkierten Antikörpern und enzymatischen Reagenzien (Kollagenase, Hyaluronidase, DNAse) voraus.
- Erfordert die Standardisierung von Perfusions-, Verdauungs- und Lysezeiten zwischen verschiedenen Bedienern, um die Variabilität der Ausbeute und Vitalität von Immunzellen zu minimieren.
- Benötigt die Optimierung der Enzymkonzentration und Inkubationszeit entsprechend Herzgröße, Alter und Krankheitszustand, um die Integrität der Epitope zu bewahren.
- Ist durch die Notwendigkeit einer sofortigen Verarbeitung nach der Entfernung begrenzt, um die Internalisierung von Oberflächenantigenen zu verhindern und die Zuverlässigkeit der Färbung aufrechtzuerhalten.
