Isolierung und Identifizierung von Extravascular Immunzellen des Herzens
August 23rd, 2018
Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Methode, um zu isolieren, Identifikation und Quantifizierung von Immunzellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von Mäusen im Steady-State oder Entzündungen. Das Protokoll kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung zur Erzeugung einer einzelnen Zelle Suspension, die weiter durch Durchflusszytometrie analysiert werden können.
Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen über die Zusammensetzung von Immunzelluntergruppen im Herzen zu beantworten, sowohl im stationären als auch im Krankheitszustand. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie für eine genaue Immunphänotypisierung von kardialen Immunzellpopulationen, einschließlich sehr seltener Untergruppen, verwendet werden kann. Dieses Protokoll ist relativ einfach.
Schwanzveneninjektionen können jedoch schwierig sein, daher ist es wichtig, diese Technik zu üben, bis Sie sich wohl fühlen, bevor Sie Versuchstiere verwenden. Um die zirkulierenden Leukozyten zu markieren, geben Sie 200 Mikroliter frisch zubereiteten Maus-Fluorophor-konjugierten Anti-CD45-Antikörper in PBS in eine 28,5-Gauge-Insulinspritze und wärmen Sie acht 12 Wochen alte Mäuse auf einer zirkulierenden Wasserdecke, die auf 35 bis 41 Grad Celsius eingestellt ist, fünf bis zehn Minuten lang vor. Wenn sich die Schwanzvene erweitert hat, halten Sie das erste Tier in der Brustbeinposition mit einer geeigneten Rückhaltevorrichtung fest.
Wenn die Schwanzvenen nicht ausreichend erweitert sind, tauchen Sie den Schwanz für ein bis zwei Minuten in 36 bis 40 Grad warmes Wasser. Wenn die Schwanzvenen fertig sind, tupfen Sie den Injektionsbereich mit 70%iger Ethanol-getränkter Gaze ab und immobilisieren Sie die Basis des Schwanzes mit dem Zeige- und Mittelfinger und den mittleren distalen Bereich des Schwanzes mit Daumen und Ringfinger. Halten Sie die Nadel mit der schrägen Seite nach oben und parallel zur Vene, führen Sie die Nadel in eine erweiterte Schwanzvene ein und injizieren Sie intravenös das gesamte Volumen des Antikörpers.
Lassen Sie den Antikörper dann fünf Minuten lang zirkulieren, bevor er human eingeschläfert wird. Um das Herz zu entnehmen, besprühen Sie die Maus mit 70%igem Ethanol und heben Sie die Haut des Bauches an, um den Bauch entlang der ventralen Mittellinie von den Hüften bis zum Brustbein zu öffnen. Öffnen Sie das Peritoneum und bewegen Sie die Leber, um das Zwerchfell freizulegen.
Schneiden Sie das Zwerchfell und die Rippen auf beiden Seiten der Mittellinie und achten Sie darauf, dass die Lunge und das Herz nicht durchstochen werden. Schälen Sie die Rippen zurück, um das Herz freizulegen, bevor Sie den linken und rechten Vorhof einschneiden. Fassen Sie vorsichtig mit einer Pinzette nach der Basis des Herzens, führen Sie eine 21-Gauge-Nadel, die an einer 60-Milliliter-Spritze befestigt ist, in den linken Ventrikel in der Nähe der Spitze ein und perfundieren Sie das Herz mit 15 bis 20 Millilitern kaltem PBS.
Eine gute Durchblutung des Herzens ist unerlässlich, um intravaskuläre Verunreinigungen zu vermeiden. Achten Sie daher darauf, das Herz nach der Euthanasie schnell zu präparieren und zu perfundieren, um eine Kontamination durch geronnenes Blut zu vermeiden. Nach der soeben gezeigten Perfusion des rechten Ventrikels sollten weiße Lungen und eine blasse Leber beobachtet werden.
Halten Sie die Basis des Herzens mit der Pinzette fest, ziehen Sie das Herz vorsichtig nach oben und durchtrennen Sie die großen Lungenarterien und -venen, die Aorta und den Perikardsack, um das Herzgewebe zu lösen. Halten Sie das Herz vorsichtig zwischen Daumen und Zeigefinger, reinigen Sie das Herz vorsichtig mit einem sauberen, fusselfreien Papiertuch und entfernen Sie mit der Pinzette die Vorhöfe und alle Überreste wichtiger Arterien und Venen oder andere Verunreinigungen. Legen Sie das gereinigte Herz in eine fünf Zentimeter große Plastikschale und fügen Sie 50 Mikroliter kaltes PBS hinzu.
Mit einer gebogenen Präparierschere das Herz so lange zerkleinern, bis keine Stücke mehr sichtbar sind und das Gewebe eine glatte, dicke Konsistenz hat. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um das Gewebe in Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen, die 800 Mikroliter kaltes DMEM enthalten. Mit Kollagenase, DNase und Hyaluronidase ergänzen und 45 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius und 50 U/min inkubieren.
Am Ende des Aufschlusses die Proben 20 Sekunden lang verziehen und sofort auf Eis legen. Die Probe sollte immer bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden, sofern nicht anders angegeben, da einige Oberflächenantigene internalisiert werden können, wenn sie bei Raumtemperatur gelagert werden. Anschließend wird ein 140-Mikroliter-Zellsieb in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen pro Probe mit einem Milliliter kaltem HBB vorbefeuchtet.
Pipettieren Sie die Proben mit einer Ein-Milliliter-Pipette, bis die Gewebesuspensionen homogen sind und die Pipettenspitze nicht verstopfen, und geben Sie die homogenisierten Proben in die Filter. Waschen Sie die Proben langsam mit 12 bis 14 Millilitern kaltem HBB pro Probe durch die Filter und geben Sie die gefilterten Proben in ein beschriftetes konisches 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Eine gute Verdauung zeigt sich darin, dass sich keine Herzreste im Filter befinden.
Die Proben werden durch Zentrifugation entnommen und der Überstand entfernt. Geben Sie einen Milliliter Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer zu jeder Probe. Resuspendieren Sie die Proben durch kurzes Vortexen, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur.
Stoppen Sie dann die Hämolyse mit fünf bis acht Millilitern kaltem HBSS. Sammeln Sie die Proben durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder FACS-Puffer und geben Sie sie für eine weitere Zentrifugation in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zur Analyse der Proben mittels Durchflusszytometrie resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikrolitern Anti-CD16/CD32-Antikörper und einem Monozytenblocker, um die unspezifische Antikörperbindung für eine 15-minütige Inkubation bei Raumtemperatur zu reduzieren.
Geben Sie ohne Waschen 50 Mikroliter Antikörper-Mastermix zu jeder Probe und mischen Sie sie für eine 30-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius, die vor Licht geschützt ist. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben mit 600 Mikrolitern FACS-Puffer pro Röhrchen und resuspendieren die Pellets in 300 Mikrolitern frischem FACS-Puffer oder 1 % Paraformaldehyd. Analysieren Sie dann die kardialen Leukozyten mittels Durchflusszytometrie gemäß den Standardprotokollen der Durchflussanalyse.
Die Analyse der kardialen Einzelzellsuspension mittels Durchflusszytometrie erfordert ein Pre-Gating mit CD45, um Immunzellen von nicht-immunen Zellen des Herzens zu unterscheiden, gefolgt von einem Einzelzell- und Small Size Exclusion Gating. Makrophagen, die durch ihre CD64-Expression identifiziert werden, sind die wichtigste Immunzellpopulation des Herzens und machen 60 bis 70 % aller Immunzellen aus. Konventionelle dendritische Zellen des Herzens sind CD64-negative Zellen, die hohe Spiegel an MHC Klasse II und CD11c exprimieren.
Diese Zellen können anhand ihrer Expression von CD103 oder CD11b weiter unterteilt werden und stellen im Vergleich zu Makrophagen eine viel kleinere kardiale Subpopulation dar. Die Verwendung der Durchflusszytometrie einer Einzelzellsuspension des Myokards ermöglicht die Untersuchung kleiner Leukozyten-Subpopulationen im Herzen. Wenn beispielsweise die Immunzellen des Myokards von Wildtyp- und -Mäusen mit Hilfe der Durchflusszytometrie verglichen werden, kann das Fehlen von CD103-positiven dendritischen Zellen bei den Knockout-Tieren bestätigt werden.
Darüber hinaus ergab diese Analyse, dass es bei den Batf3-defizienten Tieren keine signifikante Veränderung der Zusammensetzung anderer kardialer Populationen gab, was den Grad der Sensitivität zeigt, der mit dieser kombinierten Methode des enzymatischen und mechanischen Verdaus erreicht werden kann, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, immer die Lebensfähigkeit Ihres Zellisolats zu berücksichtigen. Daher empfehlen wir, die Zeit und die Enzymkonzentration des Aufschlusses entsprechend Ihren Versuchsbedingungen zu optimieren.
Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. Einzelzell-RNA-Sequenzierung, funktionelle Assays und magnetische Bead-Isolierung, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Funktionen der isolierten Zellen zu beantworten.
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Übersicht
Dieses Protokoll präsentiert eine einfache und effiziente Methode, um Immunzellen zu isolieren, zu identifizieren und zu quantifizieren, die sich im Myokard von Mäusen im Steady State oder bei Entzündungen befinden. Die Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Zusammensetzung der Immunzelluntergruppen im Herzen sowohl im Steady State als auch in Krankheitszuständen zu beantworten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Immunologie
- Kardiologie
- Fluoreszenzzytometrie
Hintergrund
- Das Herz enthält verschiedene Immunzellpopulationen.
- Das Verständnis dieser Populationen ist entscheidend für die kardiale Gesundheit.
- Eine genaue Immunphänotypisierung ist notwendig für die Untersuchung seltener Immununtergruppen.
- Schwanzvenen-Injektionen sind eine gängige Methode zur Markierung zirkulierender Leukozyten.
Zweck der Studie
- Isolierung und Quantifizierung von Immunzellen im Myokard.
- Analyse von Immunzelluntergruppen in verschiedenen physiologischen Zuständen.
- Verbesserung der Techniken zur Untersuchung kardialer Immunreaktionen.
Verwendete Methoden
- Enzymatische und mechanische Verdauung zur Herstellung einer Einzelzellsuspension.
- Fluoreszenzzytometrie zur Analyse von Immunzellpopulationen.
- Schwanzvenen-Injektionen von fluorophor-konjugiertem Anti-CD45-Antikörper.
- Vorwärmen der Mäuse zur Erleichterung des Zugangs zur Schwanzvene.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Immunzellen aus dem Myokard von Mäusen.
- Identifizierung verschiedener Immunzelluntergruppen.
- Demonstration der Effektivität der Technik sowohl im Steady State als auch in Entzündungszuständen.
- Hervorhebung der Bedeutung der Übung für erfolgreiche Schwanzvenen-Injektionen.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Untersuchung kardialer Immunzellen.
- Es verbessert das Verständnis der Immunreaktionen im Herzen.
- Die Technik ist für Forscher mit angemessener Ausbildung zugänglich.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Accurate profiling of cardiac immune cell subsets enables mechanistic de-risking in cardiovascular target validation by clarifying inflammatory pathways and immune-mediated mechanisms of action. This method supports predictive confidence in preclinical models by providing quantitative, reproducible immunophenotyping data that informs go/no-go decisions in early discovery. The approach addresses a critical gap in studying rare but functionally significant immune populations during steady-state conditions, enhancing translational relevance for immuno-cardiology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying immune cell composition and functional compartmentalization in the myocardium.
- Operational Value: Provides a reliable method to distinguish true tissue-resident immune signals from intravascular contamination, improving data integrity.
- Strategic Value: Supports target de-risking through precise identification of macrophage and dendritic cell subsets implicated in cardiac inflammation and fibrosis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a standardized single-cell suspension suitable for high-dimensional flow cytometry panels, enabling consistent immunophenotyping across experiments.
- Operational Value: Combines enzymatic and mechanical digestion with vascular labeling to achieve high viability and purity, reducing assay variability.
- Strategic Value: Establishes a reproducible workflow for immune cell isolation that can be adapted across disease models and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates longitudinal immune monitoring from steady state to inflammatory conditions, supporting biomarker discovery and mechanistic insight.
- Operational Value: Outputs are compatible with downstream applications such as FACS sorting, magnetic bead separation, and single-cell RNA sequencing for functional validation.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement by confirming target engagement and immune modulation in relevant preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing immune profiling data that informs mechanism of action and safety assessment in cardiovascular drug development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantification of key immune subsets like CD64+ macrophages and CD11c+ MHC-IIhi dendritic cells in the heart.
- Screening: Delivers quantitative, flow-cytometry-ready single-cell suspensions that allow comparison of immune composition across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Generates multi-parametric immune phenotypes (e.g., CD103+ vs CD11b+ dendritic cell ratios) that help de-risk targets by revealing subset-specific responses.
- Translational Research: Connects immune cell dynamics to disease progression, supporting biomarker alignment in models of cardiac inflammation and remodeling.
- Enterprise Reuse: The core isolation and labeling strategy is adaptable to other organs and disease areas, promoting cross-platform standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling confident identification of rare immune subsets that drive cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Standardizes immune cell isolation through defined enzymatic digestion, vascular labeling, and flow cytometry gating strategies.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by providing immune-mediated mechanism data that informs combination therapy and patient stratification strategies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted decision-making through reproducible quantification of immune cell changes in preclinical efficacy and safety studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, tail vein injection techniques, and aseptic tissue dissection to ensure sample quality.
- Dependent on access to flow cytometry equipment, fluorescence-conjugated antibodies, and enzymatic reagents (collagenase, hyaluronidase, DNAse).
- Necessitates standardization of perfusion, digestion, and lysis timing across operators to minimize variability in immune cell yield and viability.
- Requires optimization of enzyme concentration and incubation time based on heart size, age, and disease state to preserve epitope integrity.
- Limited by the need for immediate processing post-excision to prevent surface antigen internalization and maintain staining fidelity.
