Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie zur T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1-Differenzierung sowie zur Antigen-präsentierenden Zellstimulation der adaptiven Immunität zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung einer in vivo-Umgebung ermöglicht und gleichzeitig die Zellmanipulation in vitro ermöglicht. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Organ- und Knochenisolierung und des adoptiven Transfers allein durch Textanweisungen schwer zu bewältigen sind.

Für die Isolierung von Knochenmarkzellen desinfizieren Sie die Hintergliedmaßen einer erwachsenen Maus mit 70 % Ethanol und verwenden Sie eine Schere, um einen seitlichen Hautschnitt über die Hintergliedmaßen zu machen. Führen Sie eine Schere an der medialen Seite der Beine ein und schneiden Sie die Haut mit der Schere bis zum Anfang der Hintergliedmaßen ein. Trennen Sie dann mit einer Pinzette die Haut von den Beinen.

Trennen Sie den Muskel mit einer Schere vom Oberschenkelknochen und dem Schienbein und verwenden Sie eine Schere, um das Hüftgelenk zu disartikulieren und den Oberschenkelkopf zu brechen. Trennen Sie dann den Oberschenkelknochen von der Tibia, ohne die Knochenenden zu brechen, und legen Sie die Knochen in eine Petrischale mit vollständigem Medium auf Eis. Wenn alle Knochen entnommen wurden, schneiden Sie vorsichtig die proximalen und distalen Enden jedes Knochens mit einem Skalpell ab und spülen Sie die Knochen mit einer 1-Milliliter-Spritze und einer 25-Gauge-Nadel wiederholt mit einem Gesamtvolumen von 10 Milliletern warmem vollständigem RPMI-Medium aus.

Wenn alle Knochen gespült wurden, geben Sie den gesamten Inhalt der Schale in ein konisches 50-Millileter-Röhrchen, das mit einem 70-Mikrometer-Poren-Nylonbahnfilter ausgestattet ist, und entfernen Sie vorsichtig alle Ablagerungen und Zellkonglomerate durch leichtes Rühren und Pipettieren. Sammeln Sie die Knochenmarkzellen durch Zentrifugation. Suspendieren Sie das Pellet durch Pipettieren in einem Milliliter vier Grad Celsius heißem Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen und inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang auf Eis.

Am Ende der Inkubation stoppen Sie die Lyse mit 10 Millileter PVS und resuspendieren Sie das Pellet in 25 Millileter vollständigem Medium für eine zweite Zentrifugation. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 5 Millileter frischem vollständigem Medium für die Zählung und zentrifugieren Sie die Zellen erneut. Für die Isolierung von sekundären lymphatischen Gewebezellen entnehmen Sie die Leisten-, Achsel-, brachialen, zervikalen und mesentarischen Lymphknoten sowie die Milz von OT-II-transgenen Mäusen und übertragen Sie das sekundäre lymphatische Gewebe in eine Plastik-Petrischale mit 10 Millileter vollständigem RPMI-Medium.

Wenn alle Gewebe entnommen wurden, übertragen Sie die Lymphknoten und die Milz in ein 70-Mikrometer-Zellsieb in einem konischen 50-Millileter-Röhrchen und verwenden Sie einen Spritzenkolben, um das Gewebe zu homogenisieren. Spülen Sie das Sieb mit bis zu 15 Milliletern Medium und schleudern Sie die Zellen durch Zentrifugation herunter. Anschließend isolieren Sie die CD4-positiven T-Zellen durch magnetische Bead-Sortierung gemäß den Standardprotokollen.

Für die In-vivo-Aktivierung der naiven OT-II CD4-positiven T-Zellen markieren Sie die magnetischen beadisolierten T-Zellen mit vitalem Zelltracer-Farbstoff gemäß Standardprotokollen und resuspendieren Sie die markierten Zellen in einer Konzentration von 10 bis sechs Zellen pro 100 Mikroliter PBS-Konzentration. Übertragen Sie dann adoptiv 100 Mikroliter Zellen pro Tier über die Schwanzvene. Wärmen Sie die Mäuse vor der Injektion vor, um sicherzustellen, dass die Schwanzvenen ausreichend erweitert sind, um die Abgabe des gesamten Zellvolumens zu ermöglichen.

Nach 24 Stunden werden 10 bis fünfte LPS-gereifte OVA-Peptid-beladene dendritische Zellen durch subkutane Injektion in den Fußballen jedes injizierten T-Zell-Tieres abgegeben. Zwei und fünf Tage nach der Adoptionsprovokation werden die Poplitiallymphknoten von den Empfängertieren für die Gewebeverarbeitung und die T-Zellisolierung entnommen, wie gezeigt. Um die T-Zell-Aktivierung zu analysieren, färben Sie am zweiten Tag isolierte Zellen mit fluoreszierenden Antikörpern gegen CD4, CD69 und CD25, um den Prozentsatz von CD64-positiven, CD25-positiven T-Zellen innerhalb der CD4-positiven Empfängerpopulation mittels Durchflusszytometrie zu bestimmen.

Um die T-Zellproliferation zu beurteilen, färben Sie am fünften Tag isolierte Zellen mit den entsprechenden fluoreszierenden Antikörpern gegen CD4 und analysieren Sie den Zerfall des vitalen Zell-Tracer-Farbstoffsignals in der CD4-positiven T-Zellpopulation des Spenders mittels Durchflusszytometrie. Um die Th1-Differenzierung zu bewerten, werden viermal 10 bis zum fünften Tag fünf isolierte T-Zellen pro Vertiefung in 200 Mikroliter vollständiges Medium, ergänzt mit Ionomycin und PMA pro Vertiefung, in einer 96-Well-Platte plattiert. Legen Sie die Platte dann für sechs Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Zellkultur-Inkubator und geben Sie Brefeldin A in jede Vertiefung, um die Zytokinsekretion während der letzten vier Stunden der Stimulation zu blockieren.

Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Platte und verwerfen den Überstand durch rasche Inversion. Färben Sie die Zellen mit Anti-CD4-Antikörpern und fixieren Sie sie anschließend 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in 100 Mikrolitern 2%Paraformaldehyd und 1%Saccharose. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius, gefolgt von einer Zentrifugationswäsche mit 150 Mikrolitern PBS pro Well.

Als nächstes färben Sie die interessierenden intrazellulären Zytokine gemäß den Standardprotokollen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, gefolgt von zwei Zentrifugationswaschungen mit 150 Mikrolitern PBS, die mit 1 % Saponin pro Vertiefung ergänzt sind. Analysieren Sie dann die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Die durchflusszytometrische Analyse von dendritischen Zellen aus dem GM-CSF-Knochenmark nach LPS-Stimulation zeigt eine Hochregulation von Reifungsmarkern wie MHCII, CD80 und CD86.

Naive CD4-positive OT-II-T-Zellen werden nach adoptivem Transfer auf Empfängertiere durch ihre Hochregulierung der T-Zell-Aktivierungsmarker, der Oberflächenexpression und mehrerer Zellteilungsrunden aktiviert. Nach der Aktivierung weisen die proliferierenden CD-positiven OT-II T-Zellen einen Th1-Phänotyp auf, wie ihre intrazelluläre Interferon-gamma-Expression zeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Reagenzien und Materialien am Tag vor dem Experiment vorzubereiten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern in der Immunologie den Weg, dendritische Zellen und T-Zellen bei Mäusen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Knochenmark aus den Femuren und Tibia von Mäusen isoliert und wie man T-Zellen und dendritische Zellen auf Empfängertiere überträgt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit scharfen Instrumenten wie Nadeln, Skalpellen oder Scheren äußerst gefährlich sein kann, daher sollten bei diesen Eingriffen immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung eines geeigneten Fingerschutzes getroffen werden.