Ein High-Performance Liquid Chromatography-Messung von Kynurenin und Kynurenic Säure: Biochemie zur Kognition und Schlaf bei Ratten

Diese Methode kombiniert biochemische und verhaltenswissenschaftliche Ansätze, um Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften über die Auswirkungen einer akuten Kynurenin-Provokation bei Ratten zu beantworten. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass sie eine zuverlässige und konsistente Methode zur Messung von Metaboliten des Kynurenin-Signalwegs im Gehirn und Plasma von Ratten bietet. Carly Fabian, eine studentische Hilfskraft aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen.

Tauen Sie gefrorenes geerntetes Plasma zum geeigneten experimentellen Endpunkt nach intraperitonealer Kynurenin-Verabreichung auf nassem Eis auf und verdünnen Sie die aufgetauten Proben mit Reinstwasser. 100 Mikroliter der verdünnten Probe in einzelne Behälter mit 25 Mikrolitern 6%iger Perchlorsäure überführen und die Proben zentrifugieren. Dann werden 100 Mikroliter Überstände aus jedem Röhrchen in einzelne 250-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen für die Bestimmung von Kynurenin und Kynurensäure überführt.

Für die Kynurensäuremessung aus Gehirnproben tauen Sie die gefrorenen geernteten Gehirnproben auf Trockeneis auf und wiegen Sie jede Probe einzeln auf einer präzisen Analysenwaage. Wenn alle Proben gewogen wurden, stellen Sie die Röhrchen auf nasses Eis und verdünnen Sie jede Gewebeprobe in einem Verhältnis von eins zu 10 Volumenprozent mit Reinstwasser, gefolgt von einer Homogenisierung mit einem Ultraschallgerät. Aliquotieren Sie 100 Mikroliter jeder Probenaufschlämmung in ein neues Röhrchen und fügen Sie dann 25 Mikroliter 25%ige Perchlorsäure zum Vortexen und Zentrifugieren hinzu.

Dann werden 100 Mikroliter Überstand in einzelne 250-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen für die Kynurensäurebestimmung überführt. Um das Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Gerät (HPLC) für die Kynurenin-Analyse vorzubereiten, legen Sie zunächst die einzelnen HPLC-Ansaugschläuche in die Behälter für die mobile Phase, Reinstwasser und 100 % Acetonitril. Programmieren Sie dann das Gerät so, dass es 5 % Acetonitril und 95 % Reinstwasser mit 0,5 Millilitern pro Minute laufen lässt, und lassen Sie das HPLC-Gerät 20 bis 30 Minuten lang laufen.

Wenn ein stabiler Druck und eine stabile Ausgangslinie erreicht wurden, ändern Sie die Lösungszusammensetzung auf eine mobile Phase mit 5 % Acetonitril und 95 % Natriumacetat und äquilibrieren Sie das Gerät für weitere 30 Minuten. Schalten Sie während des Gleichgewichts des Geräts die Lampe im Fluoreszenzdetektor ein. Pumpen Sie vor der Ableitung die Zinkacetatlösung separat durch eine peristaltische Pumpe, die sich mit der mobilen Phasensäule verbindet, und schalten Sie die Nachsäulenpumpe etwa 20 Minuten lang auf eine Durchflussrate von 0,1 Millilitern pro Minute ein, bis sie einen stabilen Druck von etwa 500 psi erreicht.

Wenn das Gerät für die Analyse bereit ist, stellen Sie die Systemsoftware so ein, dass die Parameter der Probensequenz gesteuert und die automatische Injektion mehrerer Proben ermöglicht wird. Klicken Sie im Bildschirm "Sample ausführen" auf "Datei" und ziehen Sie den Mauszeiger nach unten auf "Neues Sample-Set erstellen" und wählen Sie im neuen Fenster die Option "Leer". Listen Sie alle Standards und Proben einzeln in der Reihenfolge auf, in der sie ausgeführt werden sollen, wobei die Standards am Anfang und Ende der Sequenz getestet werden.

Legen Sie in der Funktionsspalte die Standards und Proben fest und stellen Sie das Programm so ein, dass zwischen jeweils fünf Proben Wasser injiziert wird. Stellen Sie die Laufzeit für jede Probe auf 15 Minuten ein und injizieren Sie 20 Mikroliter der Proben aus den Standards, gefolgt von 20 Mikrolitern der Plasmaproben und 30 Mikrolitern der Gehirnhomogenatproben, je nach experimenteller Eignung. Stellen Sie dann die Anregungs- und Emissionswellenlängen entsprechend der zu messenden Verbindung ein und führen Sie die Sequenz aus.

Um die Daten zu quantifizieren, öffnen Sie den Bildschirm "Projekt durchsuchen" und doppelklicken Sie auf der Registerkarte "Sample Sets" auf den zu quantifizierenden Sample-Satz. Markieren Sie in der Liste der Injektionen alle Standards und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um im neuen Fenster "Prozess" auszuwählen. Verwenden Sie dann das Dropdown-Menü, um Kalibrieren und Quantifizieren auszuwählen. Markieren Sie erneut alle Standards, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Überprüfen. Wenn die Chromatogramme geöffnet sind, integrieren und kalibrieren Sie jeden Standard, um die Standardkurve zu generieren.

Kehren Sie dann zur Registerkarte Probensätze zurück und doppelklicken Sie auf das Probenset, um es wie demonstriert zu quantifizieren und zu überprüfen, indem Sie jede Probe integrieren und quantifizieren, um die Konzentration jeder Probe basierend auf der zuvor erstellten Standardkurve auszugeben. Die HPLC-Analyse von Gewebeproben von Tieren, denen Kynurenin verabreicht wurde, ergab eine Kynurenin-Retentionszeit von etwa sechs Minuten und eine Kynurensäure-Retentionszeit von etwa 11 Minuten. Die Quantifizierung von Plasma-Kynurenin und Hippocampus-Kynurensäure zeigt, dass die akute Kynurenin-Injektion den Kynurensäurespiegel im Gehirn erhöht, wobei ein Höhepunkt zwei Stunden nach der Injektion erreicht wird und vier Stunden nach der Injektion zum Ausgangswert zurückkehrt.

Obwohl während der Trainingsversuche mit passivem Vermeidungsparadigma keine Gruppenunterschiede beobachtet wurden, zeigten Kontrolltiere während der Testversuche einen signifikanten Anstieg der Latenz, um auf die dunkle Seite zu gelangen, was auf kontextuelles Lernen hindeutet, während Tiere, denen 24 Stunden zuvor Kynurenin injiziert wurde, nicht den gleichen Anstieg der Latenz zeigten, was ein Lerndefizit zeigt. Des Weiteren deutet die Beurteilung des Einflusses einer akuten Kynureninerhöhung während der Lichtphase auf die Schlaf-Wach-Architektur auf eine Verringerung der gesamten Schlafdauer mit schnellen Augenbewegungen während der ersten zwei Stunden nach der Kynurenin-Injektion hin. Diese Daten spiegeln sich in einer Zunahme der Wachdauer während dieser Zeiträume und einer leichten Verringerung des Schlafs ohne schnelle Augenbewegungen wider, was zeigt, dass eine akute Kynureninerhöhung auch Störungen der Schlaf-Wach-Dynamik verursacht.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Verhaltensanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Rolle einer erhöhten Kynurensäurebildung bei der Modulation von Kognition und Schlaf zu beantworten.