Name: Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Lernen Sie endogenes Protein-Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteindynamiken unter endogener Kontrolle.

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Wir danken Daphne Dambournet für viele aufschlussreiche Gespräche und Ratschläge auf gen bearbeiten, Thao für Illustration, Angelique Nelson für kritische Lektüre des Manuskripts und Andrew Tucker zur Erzeugung der mEGFP-Tags Lamin B1-Zell-Linie. Wir möchten die Stammzellen und Gene Editing und Assay-Entwicklung-Teams bei Allen Institut für Cell Science für ihre Beiträge zu bearbeiten gen und Qualitätskontrolle anerkennen. Die WTC-Linie, die wir zur Erstellung unserer gen bearbeitet Zelllinie sorgte das Bruce R. Conklin Laboratory in Gladstone Institute und UCSF. Wir bedanken uns bei Allen Institute for Cell Science Gründer, Paul G. Allen, für seine Vision, Ermutigung und Unterstützung.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Methode, die hier vorgestellten Erzeugung endogen fluoreszierenden Proteins Fusionen im HiPSCs geregelt ist ein vielseitiges und leistungsstarkes Ansatz zur Generierung von Gen bearbeitet Zelllinien mit Anwendungen von live Cell Imaging bis hin zu verschiedenen funktionelle Studien und " in einer Schale "Krankheitsmodelle mit Patienten abgeleitet HiPSC Linien13,14,15. Während diese Methode verwendet wurde, um große FP-Tags, die N - oder C-Terminus des endogenen Proteinen einzuführen, könnte es verwendet werden, andere Tags oder kleine genetische Veränderungen vorzustellen Modell oder richtige krankheitsverursachende Mutationen22,23 . Für kleinere Einsätze die Größe der Homologie-Arm kann reduziert werden, aber allgemeinen Ansatzes für die Bearbeitung präsentiert in dieser Methode kann noch24,25gelten. Während der Einsatz von HiPSCs dringend aufgefordert, für ihre große Nützlichkeit mit sorgfältige Optimierung ist kann dieses Protokoll angepasst werden, damit um die Genome von anderen Säugetieren Zelllinien zu bearbeiten.
Wenn ein Gen des Interesses für die Markierung von FP identifiziert Transkript Fülle schätzt (von Microarray oder RNA-Seq-Daten) sind ein guter Ausgangspunkt für die Beurteilung, ob ein Gen oder Isoform von Interesse zum Ausdruck kommt, obwohl Transkript Ebenen korreliert nicht immer mit Protein-Ebene. Die hier beschriebene FACS-Anreicherung-Strategie funktioniert am besten für Gene, die zumindest mäßig gut ausgedrückt werden in der Zelle Art von Interesse. Diese Strategie wurde auch erfolgreich bei der Auswahl für Fusionen, die punktförmige und/oder diskrete Lokalisierung Muster wie centrin, Desmoplakin und Paxillin zeigen, wo ist die Signal-Hintergrund-Verhältnis sehr geringen12,19. Gene, die nicht stark ausgedrückt werden oder werden nur in Derivative Zelltypen exprimiert erfordern zusätzliche Selektionsstrategien.
Der Ausgangspunkt für CrRNA und Spender Plasmid Vorlagendesigns in humanen Zelllinien verwendet sollte der menschliche Bezug Genom (GRCh38). Da das Genom der verschiedenen Zelllinien innerhalb derselben Spezies variieren können, und CRISPR/Cas9 Sequenz-spezifisch ist, ist es äußerst hilfreich, Zelle linienspezifische Varianten (single Nucleotide Polymorphisms oder Einfügungen/Löschungen (Indels)) zu identifizieren Das unterscheiden sich von den Referenz-Genom und integrieren diese in das Design. Dadurch wird sichergestellt, dass CrRNAs mit das wirtsgenom kompatibel ist und, dass die Spender Vorlage Plasmid Homologie Arme jede Zelllinie spezifischen Varianten erhalten bleibt. Eine vorgeschlagene Strategie ist homozygote Varianten in CrRNAs und Spender Vorlage Plasmid Homologie Arme während des Designprozesses zu integrieren. Einbindung der heterozygote Varianten ist optional. Die spezifischen Reagenzien für große Knock-in Experimenten verwendet und andere wichtigen Überlegungen für dieses Protokoll werden unten besprochen.
Cas9 Protein
Der Hauptvorteil der Verwendung von Cas9 Protein ist, dass die Einführung der Cas9 und gRNA als eine komplexe RNP hat gezeigt, dass eine begrenzte Dauer der Nuklease Aktivität im Vergleich zu Plasmid-basierte Ansätze wo Ausdruck der Cas9 und gRNA kann weiterhin für Tage und führen zur Folge zu größeren - und off-Target Aktivität26,27. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Cas9 Protein ist, dass es einmal im Inneren der Zellen Spalten zur Verfügung. Gegensatz zu herkömmlichen Methoden der Verwendung von Cas9 mRNA oder Cas9/gRNA Plasmid, die Transkription, Übersetzung und Protein26,28Verarbeitung erfordern. Wildtyp S. Pyogenes Cas9 Protein ist jetzt von vielen kommerziellen Quellen zur Verfügung.
Guide RNA
Es gibt viele öffentlich verfügbaren Tools für die Suche nach CrRNA Ziele in der Nähe der gewünschten FP Insertionsstelle, die keine oder nur wenige vorhergesagten off-Ziele in das Wirt Genom29,30,31,32haben. Effizienzgewinne bei HDR und die Präzision der HDR-Ergebnisse variieren stark zwischen den CrRNA Zielen, die an einem bestimmten Locus12verwendet. Aus diesem Grund testen mehrere CrRNAs (2-4 und vorzugsweise innerhalb 50 bp der gewünschten Insertionsstelle) pro Locus wird empfohlen, da dies die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Bearbeitung Experiment erhöhen kann. Derzeitige Möglichkeiten für die Bereitstellung von gRNA enthalten synthetische 2-Komponenten CrRNA und TracrRNA, synthetische einzelne gRNAs (SgRNAs), in-vitro- SgRNAs oder bei der Auslieferung ein Plasmid auf Zellen, die mit dem Ausdruck der SgRNA von einer U6-Promoter transkribiert. Dieses Protokoll wurde nicht für hohe Spaltung Aktivität optimiert. Unveränderte 2-Komponenten CrRNA und TracrRNA (siehe Tabelle der Materialien) wurden mit dem Ziel der Erzeugung von Mono-Allele FP-Tags Zell-Linien während die potenzielle geringsten Störung in den Zellen verursacht verwendet.
Spender-Vorlage Plasmid
Weil einige der Homologie Sequenz arm, sofern beim Spender Vorlage Plasmid während der HDR-Veranstaltung in das wirtsgenom integriert werden, sollten Punktmutationen auf die CrRNA Anerkennung Websites eingeführt werden, um weitere Spaltung durch Cas9 nach HDR zu verhindern. Oft ist die einfachste störenden Veränderungen, die PAM-Sequenz zu mutieren. Da einige nicht-kanonische PAM-Sequenzen noch von Wildtyp S. Pyogenes Cas9 erkannt werden können, empfiehlt es sich, vermeiden die Verwendung von NGG, NAG oder NGA33. Wenn die Homologie Arm mutiert, vermeiden Sie nicht Synonym Mutationen und die Einführung von seltenen Codons. Wenn ein Synonym der PAM-Sequenz nicht möglich ist, erwägen, drei gleichbedeutend Punktmutationen im Großraum Samen (10 bp proximalen PAM) der CrRNA-Bindungsstelle. Extreme Vorsicht geboten bei diesen Änderungen in der 5ʹ unübersetzte Region (UTR), da diese Regionen wichtige regulatorische Sequenzen enthalten können. Beratung einer genetischen Erhaltung Datenbank wie der UCSC Genome Browser vergleichende Genomik Spuren in diesen Fällen Hilfestellung können da Änderungen nicht konserviert Basen besser toleriert werden können, als zu hoch konservierte Basen17ändert. Manchmal reicht die bloße Aufnahme der FP-Sequenz, stören die CrRNA-Bindungsstelle (wie in Abbildung 1); Allerdings sollte die neu angehängte Sequenz für das Fortbestehen des CrRNA Bindung und PAM Sequenzen überprüft werden.
Aminosäure-Linker zwischen den FP und dem nativen Protein werden empfohlen, um die Funktion der Fusion Protein34zu sparen. Oft kann eine Aminosäure-Linker für seine besondere Belastung oder Größe gewählt werden. Wenn eine cDNA-Fusion mit einem Design ähnlich wie die gezielte endogenen ist Schmelzverfahren Protein gut untersucht worden, dass gleiche Linker-Sequenz für die CRISPR/Cas9 Knock-in Experiment12,19verwendet werden kann. Wenn diese Informationen nicht verfügbar ist, wurde auch ein kurze Linker wie GTSGGS12erfolgreich eingesetzt. Andere Studien haben Erfolg mit einer generischen kleine 3-amino Acid Linker-Sequenz für eine Vielzahl von Zielen35gezeigt.
Transfektion und FACS Bereicherung
Viele im Handel erhältlichen Transfektion Reagenzien sind für die Lieferung von bestimmten Arten von Molekülen, Zellen, formuliert, während eine Elektroporation-System verwendet werden kann, Reagenzien mit einer breiten Palette von Größe, Ladung und Zusammensetzung zu liefern. Abgesehen davon, dass eine gängige Methode der Transfektion für Zellen zu transfizieren, wie HiPSCs, trägt Elektroporation auch den Vorteil aller drei Komponenten für CRISPR/Cas9-vermittelten FP Knock-in zu liefern, wie in diesem Verfahren beschrieben. Elektroporation wurde festgestellt, dass die besten Ergebnisse im Vergleich zu anderen im Handel erhältlichen Reagenzien bei der Entwicklung dieser Methode (Daten nicht gezeigt), und wurde auch von anderen RNP Lieferung26,28,36 verwendet zu produzieren .
Wenn Sie dieses Protokoll verwenden für die Bearbeitung von HiPSCs, sollte besondere Vorsicht geboten, um schonende Behandlung der Zellen vor und nach das Gen Bearbeitungsprozess für optimale Zelle überleben und minimale spontane Differenzierung zu gewährleisten. Insbesondere sollten die FACS Anreicherungsverfahren für die Sortierung von Stammzellen mithilfe der größten Düse (130 µm), ein geringer Durchfluss (≤24 µL/min), Konservierungsstoffe Scheide Flüssigkeit angepasst werden (z. B. Kochsalzlösung, siehe Tabelle der Materialien), und niedrige Probe Druck (10 Psi). Statt einzelne Zelle Sortieren, führt zu suboptimalen Lebensfähigkeit in Stammzellen, FACS-angereicherten HiPSCs sortiert in loser Schüttung und erweitert als Population Zelle Lebensfähigkeit und Stammzellforschung Integrität zu optimieren. Jedoch kann einzelne Zelle Sortierung für weniger empfindliche Zelltypen geeignet. Um das Überleben der Zellen zu fördern, sind Zellen wieder Kultur nicht mehr als eine Stunde nach der Ernte für die FACS-Bereicherung und bei Raumtemperatur während der Sortiervorgang aufbewahrt. Für einige Zelltypen kann Zelle überleben auch durch Inkubation Zellen auf Eis (4 ° C) während das Sortierverfahren verbessert werden.
Die Bulk-Erweiterung des FP-positiven Zellen ermöglicht es, die Bevölkerung durch bildgebende Analyse für die Fusion Protein Lokalisierung vor der Generierung von klonalen Linien zu bewerten. Während der daraus resultierenden angereicherten Population von Zellen für einige Studien ausreichend sein kann, zeigen diese Populationen häufig FP Signal von unterschiedlicher Intensität. Die isolierten klonalen Linien haben einheitliche Signal (Abbildung 3), so dass sie besser geeignet für funktionelle Experimente12.
Klonale Zellgeneration Linie
Während der Bearbeitung und klonale Linie Generation ist es wichtig, die Zellmorphologie überwachen. HiPSC Kolonien gewachsen in den Feeder-freien Bedingungen sollen glatte Kanten und eine gleichmäßige, gut verpackt Zentrum12,18,19aufweisen. Differenzierte Zellen sind in weniger als 5 % der Kultur zu beachten. Bei der einzelnen Kolonien Kommissionierung, wählen Sie diejenigen die Ausstellung gute Morphologie. Während der 96-Well-Platte passagierung Veranstaltungen Klone für Morphologie zu überprüfen und diejenigen, die überwuchert haben, so kann dies ein Hinweis auf genetische Instabilität sein oder zu einer Differenzierung führen einzustellen.
Generation von klonalen Zell-Linien können für genetische Bestätigung der präzisen Bearbeitung, was wichtig ist, weil Cas9-induzierten Doppelstrang im Genom bricht oft repariert ungenau trotz Einbeziehung des Tags an den gewünschten Ort. Zuvor beschriebenen PCR-basierten Tests zeigten, dass kumulativ über zehn einzigartige genomic Loci viele (45 %) der FP exprimierenden Klone litt Spender Plasmid Rückgrat Integration bei der gezielten Lokus oder (selten) nach dem Zufallsprinzip in der Genom-12. Darüber hinaus 23 % der GFP-positiven Klone (n = 177) über zehn einzigartige Loci wurden gefunden, um Mutationen an oder in der Nähe des erwarteten CrRNA schneiden in der unmarkierten Allel, wahrscheinlich wegen NHEJ12beherbergen. Diese genetische Analyse von vielen klonalen Linien (~ 100 Klone/Edit) unterstrich die Bedeutung der genetischen Validierung, die nicht in einer Zellpopulation möglich ist, da FP-Ausdruck und erwartete Fusion Protein Lokalisierung allein keine präzise Bearbeitung12 gewährleisten . Darüber hinaus können diese PCR-basierten Tests ausgeführt werden, auf eine angereicherte Population von Zellen mit Bestimmtheit, rechtfertigt die Notwendigkeit einer klonalen Linie Generation bevor aussagekräftige Analyse abgeschlossen werden kann. Genetische Bestätigung des eingefügten FP Tags und Überprüfung der genetische Integrität des unbearbeiteten Allels (in einem Mono-Allele bearbeitete Klon) sind notwendig, um sicherzustellen, präzise Bearbeitung bei der gezielten Lokus über Tag-Ausdruck.
Eine niedrige Rate von Bi-Allele Bearbeitungen und Mangel an Ziel-Mutationen (als vermutlich durch Sanger und Exome Sequenzierung) wurden bisher mit dieser Methode (unveröffentlichte Daten)12beobachtet. Dies steht im Einklang mit früheren Studien beschreiben die Verwendung von kurz andauernde RNP CRISPR/Cas9 Experimente26,27. Das Fehlen von klonalen Zelllinien mit Bi-Allele Bearbeitungen kann auch bestimmten Locus oder wegen der Unfähigkeit der Zelle zwei tolerieren markiert Kopien ein essentielles Protein wie vorgeschlagen von zuvor veröffentlichten Experimenten wo vermeintliche Bi-Allele bearbeitete Zellen für einen Locus (LMNB1), beobachtet aber nicht eine andere (TUBA1B)12. BI-Allele vollständig validierten klonalen Zelllinien wurden mit dieser Methode zu Tag ST6 Beta-Galactoside Alpha-2, 6-Sialyltransferase 1 (ST6GAL1) und RAB5A Mitglied RAS Onkogen Familie (RAB5A) mit mEGFP19generiert.
Darüber hinaus bestätigen die Präzision der Bearbeitung im Genom, gibt es eine Vielzahl von Qualitätskontrolle-Assays, die verwendet werden können, weiter charakterisieren die klonale Linie und Klone, die erfüllen alle Stammzelle, genomische, zu identifizieren und Zelle biologischen Kriterien für die Verwendung in Zukunft Studien . Biologische und funktionelle Assays Zelle lässt sich angemessener Ausdruck, Lokalisierung und Funktion der Fusion Protein12bestätigen. Vergleich zum unbearbeiteten Kindersicherung wird dazu beitragen, den Einfluss des Bearbeitungsprozesses für Lokalisierung, Dynamik und Funktion zu beurteilen. Andere Tests festzustellen wie Wachstum Analysen und Tests für die genomische Stabilität können auch helfen, ob das tagged Protein störenden auf die Zelle. Bei Verwendung von HiPSC in dieses Protokoll kann Bewertung der Pluripotenz Marker und Differenzierung Potenzial bei der Bestimmung, dass ein Klon, das wertvoll für flussabwärts12Studien kritisch. Weil Kultur erweitert HiPSC hat gezeigt, dass genetische Instabilität, Überwachung der Wachstumsrate führen und Karyotyp klonalen Zell-Linien ist auch wichtig,12,37. Allerdings bestimmt das Finale bearbeitete Zellen wird letztlich bestimmen die Höhe und Breite der Qualitätskontrolle Analyse und variieren basierend auf der Anwendung.

Die Verwendung von Genom-Bearbeitung Strategien, vor allem CRISPR/Cas9, zelluläre Prozesse zu studieren wird immer zugänglich und wertvolle1,2,3,4,5, 6 , 7. eine der vielen Anwendungen von CRISPR/Cas9 ist die Einführung (über Homologie gerichtet Reparatur (HDR)) der großen exogene Sequenzen wie GFP in bestimmten genomic Loci, die dann als Reporter für die Aktivität von Genen oder Proteinen Produkt8 dienen . Diese Technik lässt sich eine fluoreszierendes Protein-Sequenz mit einer endogenen offenen Leserahmen verbinden wo resultierende endogen geregelten Fusionsproteins lässt sich die subzelluläre Lokalisation und Dynamik des Proteins des Interesses5 visualisieren ,6,9,10,11. Während endogen tagged Proteine viele Vorteile im Vergleich zur Überexpression Systeme bieten, ist Einfügen von großen Sequenzen in das menschliche Genom ein ineffizienter Prozess in der Regel eine Auswahl oder Bereicherung Strategie eine Bevölkerung der Zellen zu erhalten, die kann zu verlangen sein leicht studierte5,12.
Dieses Protokoll beschreibt die Einfügung einer DNA-Sequenz, die Kodierung eines fluoreszierenden Proteins (FP) in eine gewünschte genomischen Locus. Das Protokoll umfasst Planung und Lieferung von Spender-Vorlage-Plasmid und komplexe Ribonucleoprotein (RNP) (Wildtyp S. Pyogenes Cas9 Protein in Kombination mit synthetischen CRISPR-RNA (CrRNA) und Trans-Aktivierung CrRNA (TracrRNA)). Auch beschrieben ist die Bereicherung der vermeintlich bearbeitete Zellen durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) und die Generierung von klonalen Zelle Linie. Bisher hat diese Methode zum HiPSC Linien mit monoallelisches oder (selten) Bi-Allele grün fluoreszierendes Protein (GFP) Tags Kennzeichnung fünfundzwanzig Proteine repräsentieren wichtige zelluläre Strukturen erzeugen. Die resultierenden bearbeiteten Zellen aus diesen Bemühungen wurden bestätigt haben das erwartete genetische einsetzen, eine korrekte Lokalisierung Fusionsproteins auszudrücken, und Pluripotenz und eine stabile Karyotyp12 (und unveröffentlichte Daten). Mit dieser Methode hat auch mehrere andere generieren Single und Dual (zwei verschiedene Proteine in derselben Zelle markiert) bearbeitet Populationen von HiPSCs (unveröffentlichte Daten).
Menschlichen iPSCs eines gesunden Spenders abgeleitet wurden Erbgut Bearbeitung dafür ausgewählt, weil im Gegensatz zu vielen herkömmlichen Zelllinien, sie diploid, karyotypisch stabil, nicht transformiert und proliferative sind. Diese Eigenschaften stellen ein attraktives Modell für das Studium fundamentale Zellbiologie und Krankheit Modellierung. Darüber hinaus bietet das Potenzial der Differenzierung der HiPSCs die Möglichkeit, mehrere Entwicklungsstadien parallel in verschiedenen Linien und Zelltypen mit isogenen Zellen einschließlich der Organellen, Gewebe und "in einer Schale" Krankheitsmodelle13 studieren ,14,15. Obwohl dieses Protokoll für HiPSCs (WTC Linie) entwickelt wurde, kann es für die Entwicklung von Protokollen mit anderen Säugetieren Zelllinien informativ sein.

<table><tbody><tr><td>Geneious R9</td><td>Biomatters oder eine ähnliche</td><td></td><td>Bioinformatik-Software für in silico Spenderplasmid-Design</td></tr><tr><td>TE Buffer pH 8,0</td><td>IDT oder ähnlich</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i CO2 Inkubator oder ähnliches</td><td>ThermoFisher Scientific oder ähnliches</td><td>51030408</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten (1000 & Mikro; L, 200 & Mikro; L, 20 & Mikro; L, 10 & Mikro; L, 2 & Mikro; L)</td><td>Rainin, oder ähnliche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (1000 &micro; L, 200 & Mikro; L, 20 & Mikro; L)</td><td>Rainin, oder ähnlich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette (200 &Mikro; L)</td><td>Rainin oder ähnliche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>serologische Pipetten (25 mL, 10 mL, 5 mL)</td><td>Costar oder ähnliche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BRAND 8-Kanal-Verteiler für Quiksip, Autoklavierbares</td><td>Millipore Sigma oder ähnliches</td><td>BR704526-1EA</td><td>zur Verwendung mit ungefilterten Pipettenspitzen, wie z. B. Molecular BioProducts Low Retention Pipettierspitzen, Pure 10, darunter</td></tr><tr><td>Molecular BioProducts Low Retention Pipettenspitzen, Pure 10</td><td>Thermo Fisher oder ähnlich</td><td>3501-05</td><td></td></tr><tr><td>XP2 Pipettierhilfe</td><td>Drummond, oder ähnlich</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Pasteurpipetten</td><td>VWR, oder ähnlich</td><td>53300-567</td><td></td></tr><tr><td>Klasse II, Typ A2 Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>CELLGARD, oder ähnlich</td><td>NU-481</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, Wachstumsfaktor reduziert</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>lot getestet vor der Verwendung mit hiPSC</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-phenolrot)</td><td>Gibco</td><td>11039-021</td><td>kalt, zum Verdünnen Matrigel 1:30</td></tr><tr><td>mTeSR1 Complete Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>empfohlenes Wachstumsmedium für die WTC hiPSC-Linie</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>WTC hiPSC Linie</td><td>Coriell</td><td>GM25256</td><td>die in diesem Protokoll verwendete hiPSC-Linie ist über Coriell erhältlich</td></tr><tr><td>Gewebekulturschale 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat Buffered Kochsalzlösung (DPBS) ohne Calcium, kein Magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Polystyrol konisch</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ( ROCK-Inhibitor)</td><td>StemCell Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetische crRNA, unmodifiziert (benutzerdefinierte Sequenz)</td><td>Dharmacon</td><td>Custom0247</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetische tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002005-05</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Wildtyp-Streptococcus pyogenes Cas9-NLS gereinigtes Protein, 40 &; Mikro; M</td><td>University of California-Berkeley QB3 Macrolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kundenspezifisches Donor-Plasmid (PriorityGENE)</td>Das <td>Genewiz-Donor-Insert-Design wurde synthetisiert und in das pUC57-Rückgrat kloniert mit Genewiz</td><td></td> DNA LoBind Tube 1,5 mL Eppendorf 22431021 NucleoBond Xtra Maxi EF Clontech 740424.50 Neon-Transfektionssystem ThermoFisher <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Wissenschaftliches</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon-Transfektionssystem, 100 & micro; L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden und Zellsiebkappe</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konisches Röhrchen aus hochklarem Polypropylen</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Version 10.2</td><td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NERL Blutbank Kochsalzlösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8504</td><td>als konservierungsmittelfreier FACS-Puffer</td></tr><tr><td>Olympus SZX7 Stereomikroskop oder ähnliches</td><td>Olympus oder ähnliches</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturplatte, 96-Well-Falcon</td><td></td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatte, V-Boden</td><td>CELLSTAR</td><td>351180</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Sigma</td><td>C2874-100ML</td><td>als Kryokonservierungspuffer für Zellen im 96-Well-Plattenformat</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturplatte</td><td>CELLSTAR</td><td>662160</td><td></td></tr></tbody></table>

endogene protein tagging in menschlichen induzierten pluripotenten stammzellen mit crispr/cas9

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Ein Protokoll wird für die Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs), die express körpereigene Proteine fusioniert, um in-N - oder C-terminalen fluoreszierende Tags Frame dargestellt. Die prokaryotische CRISPR/Cas9 System (gruppierten regelmäßig dazwischen kurz palindromische Wiederholungen/CRISPR-assoziierten 9) kann eingesetzt werden, große exogene Sequenzen in genomic Loci über Homologie gerichtet Reparatur (HDR) einzuführen. Erreichung der gewünschten Knock-in beschäftigt dieses Protokoll Ribonucleoprotein (RNP)-basierten Ansatz wo Wildtyp Streptococcus Pyogenes Cas9 Protein, synthetische 2-teilig Guide RNA (gRNA) und ein Spender Vorlage Plasmid werden, um die Zellen über geliefert Elektroporation. Vermeintlich bearbeitete Zellen mit dem Ausdruck das eindringmittel tagged Proteine werden durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) bereichert. Klonale Linien werden dann generiert und für präzise Bearbeitung Ergebnisse analysiert werden können. Durch die Einführung der fluoreszierenden Tags bei der genomischen Lokus des Gens von Interesse, kann die daraus resultierende subzelluläre Lokalisation und die Dynamik des Fusionsproteins unter endogenen regulatorischen Kontrolle, eine wesentliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Überexpression untersucht werden Systeme. Die Verwendung von HiPSCs als Modellsystem für die Markierung von Gen bietet die Möglichkeit, die tagged Proteine in nontransformed, diploiden Zellen zu studieren. Da HiPSCs in mehreren Zelltypen unterschieden werden können, bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, erstellen und tagged Proteine in einer Vielzahl von isogenen zellulären Kontexten zu studieren.

Das Ziel dieses Experiments wurde zu mEGFP (Monomere verbesserte GFP) verschmelzen mit dem nuklearen lamin B1-Protein durch die Einführung der mEGFP-Sequenz am 5ʹ Ende des LMNB1-Gens (N-Terminus des Proteins). Ein Linker (Aminosäure-Sequenz SGLRSRAQAS) wurde von Michael Davidson fluoreszierende Protein Sammlung21basierend auf vorherigen cDNA Konstrukte gewählt. Da die CrRNA Bindung Region in dem Spender Vorlage Plasmid für jeden Kandidaten CrRNA nach dem einsetzen in Silico des mEGFP und der Linker-Sequenz unterbrochen wurde, musste keine Punktmutationen unternommen werden, um potenzielle CrRNA Anerkennung und Spaltung durch stören Cas9 der Spender-Sequenz (Abbildung 1). Die Spender-Sequenz enthalten 1 kb Homologie Arme flankieren beidseitig die mEGFP-Linker-Sequenz. Die daraus resultierende 2.734 bp DNA geklont wurde in einem pUC57 Rückgrat, Reihenfolge überprüft, und die daraus resultierende Spender Vorlage Plasmid gereinigt wurde, mit einem Endotoxin-freie Maxi Prep. Die Spender Vorlage Plasmid und komplexe RNP transfiziert wurden, vermeintlich bearbeitete Zellen angereichert wurden und die Lokalisierung des mEGFP des Nuklearbereichs lamin B1 Fusionsproteins wurde bestätigt durch Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 2). Nur Ergebnisse aus der crRNA1-Transfection werden hier beschrieben, obwohl beide CrRNA Sequenzen vermeintlich bearbeiteten Populationen12hergestellt.
Im Vergleich zu der negativen Kontrolle, die keine gRNA, Cas9 Protein oder Spender Vorlage Plasmid in die Elektroporation Reaktion (nur Puffer) enthalten, die LMNB1 crRNA1 transfizierten enthalten Zellen 0,95 % mEGFP-positiven Zellen repräsentieren die vermeintlich bearbeitete mEGFP-Kern lamin B1 Bevölkerung (Abb. 3a). Dieses Ergebnis war im Bereich der Knock-in Effizienz über viele genomic Loci, die mit dieser Methode, wie bereits berichtet12beobachtet.
Die mEGFP-positiven Zellen wurden durch FACS isoliert und durch live Mikroskopie erwarteten Lokalisierung des mEGFP des Nuklearbereichs lamin B1-Fusionsproteins, die Kernhülle bestätigen abgebildet. Nach FACS-Anreicherung waren etwa 90 % der sortierten Zellen aus der LMNB1 crRNA1 Bevölkerung mEGFP-positiv (wie von Mikroskopie bestimmt), was darauf hindeutet, das einige mEGFP-Negative Zellen mit den GFP-positiven Zellen während der Sortierung Prozedur Co gereinigt. Dies war ein akzeptables Niveau der Bereicherung, die für die Kommissionierung von 96 Klonen erlaubt, die für die erfolgreiche Bearbeitung dann genetisch untersucht werden konnte. Im Allgemeinen ist ein Cut-off für erfolgreiche Bereicherung 50 % GFP positiv.
Der Großteil der sortierten Zellpopulation Fluoreszenz an die Kernhülle (nukleare Peripherie) in den nondividing Zellen angezeigt und eine erweiterte nuclear Lamina im Zytoplasma während der Mitose mit Vertrauen in die richtigen genomische bearbeiten in der LMNB1 Locus. Die angereicherte Bevölkerung enthaltenen Zellen mit entweder hell oder dunkel-Signal. Dieser Unterschied in der Signalintensität spiegeln eine Kombination der richtigen und falschen bearbeiten, Ergebnisse und Highlights, die das Dienstprogramm erzeugen eine genetisch validierte klonale Linie für weitere Studien (siehe Diskussion) (Abb. 3 b)12. Klonale Linie hinweg validiert genetisch Zellen zeigte gleichmäßige Intensität der GFP in Mikroskopie Experimente (Abb. 3 c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> Abbildung 1 . Design-Strategie für die N-Terminus GFP Kennzeichnung des LMNB1 Gens. Das GFP-Tag wurde für N-terminale Einfügung 5ʹ des ersten Exons des LMNB1 befindet sich auf Chromosom 5 entwickelt. 5ʹ und 3ʹ Homologie Arme sind 1 kb und Treffen zwischen dem Start-Codon (ATG) und dem zweiten Codon (Homologie Arme nur teilweise dargestellt in Abbildung). Zwei Kandidaten CrRNAs wurden entwickelt, um Cas9, so nah wie möglich an die vorgesehene Einstichstelle wie möglich, während immer noch einzigartig in das Genom zu Spalten führen. Sequenz zur mEGFP und eine Aminosäure Linker waren eingefügten nur 3ʹ von dem Start-Codon (mEGFP und Linker Sequenz nicht maßstabsgetreu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> Abbildung 2 . Arbeitsablauf für die Herstellung von endogen getaggt klonalen Linien HiPSC. Transfektion Komponenten, einschließlich des Cas9/CrRNA/TracrRNA RNP-komplexes (dargestellt als rote Cas9 Protein mit gold CrRNA und lila TracrRNA), dem Spender Vorlage Plasmid enthält die Homologie Arme (HAs, gezeigt in Gold), und FP + Linker Sequenz (gezeigt im grün), wurden elektroporiert. Nach 4 Tagen wurden die vermeintlich bearbeitet FP-Positive Zellen angereichert durch FACS erweitert als Population durch impfen aller sortierten Zellen in einen einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte (~ 1.000 Zellen) und dann bis mehrere Millionen Menschen arbeiten in Kultur erweitert Zellen könnten als "angereicherte Bevölkerung" geprüft werden (siehe Protokoll Schritt 3,8). Die Ausbeute an FP-positiven Zellen unterscheidet sich durch Experiment durch Variablen Zinssätzen von HDR-12; eine erfolgreiche Bereicherung umfassen in der Regel ~ 300-5.000 Zellen nach Transfektion von ca. 1,6 x 106 HiPS-Zellen. Bildgebende Voruntersuchungen bestätigt das Signal und die Lokalisierung des Fusionsproteins in der angereicherten Bevölkerung. Kolonien wurden manuell in eine 96-Well-Platte für Expansion und Kryokonservierung abgeholt. Weitere genomische Qualitätskontrolle Screening mit Tröpfchen digitalen PCR (DdPCR) und andere PCR-basierte Assays wurde dann verwendet, um richtig bearbeitete Klone als zuvor beschriebenen12zu identifizieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> Abbildung 3 . Anreicherung von vermeintlich bearbeitete Zellpopulationen. (A) Flow Cytometry Grundstücke der LMNB1 Zellen vier Tage nach Transfektion bearbeitet. Die y-Achse zeigt GFP Intensität und der x-Achse forward Scatter. Sortier Tore wurden basierend auf den Puffer nur Kontrolle festgelegt. Da HiPSCs empfindlich auf Störungen reagieren, lebenden/Toten Fleck wurde weggelassen und eine sehr konservative FSC/SSC-Tor wurde stattdessen verwendet. (B) nach der Bereicherung, bearbeitet die Bevölkerung der LMNB1 Cr1 Zellen zeigten ca. 90 % der Zellen mit GFP Lokalisierung, die Kernhülle (erwartete LMNB1 Lokalisierung). Die Bevölkerung enthaltenen Zellen unterschiedlicher Intensität der GFP sowie einige GFP-negativen Zellen. Maßstabsleisten sind 10 Mikron. (C) nach klonalen Linie Generation Zellen zeigte eine einheitliche GFP-Intensität, mit einigen Zellzyklus abhängige Unterschiede. Maßstabsleiste ist 20 Mikrometer.

Hier beschrieben ist, dass ein Protokoll für die Markierung von endogen Proteine mit fluoreszierenden Tags in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9 ausgedrückt. Vermeintlich bearbeitete Zellen werden bereichert durch Fluoreszenz aktiviert Zellsortierung und klonale Zell-Linien entstehen.

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, humane induzierte pluripotente Stammzellen zu erzeugen, die endogene Fusionsproteine exprimieren, die mit Endrahmen-N- oder C-terminalen Fluoreszenz-Tags fusioniert sind. Um den gewünschten Knock-in zu erzielen, verwenden wir das CRISPR-Cas9-System und einen Ribonukleoprotein-basierten Ansatz unter Verwendung des Wildtyp-S.pyogenes Cas9-Proteins und einer synthetischen zweiteiligen CRSPR-RNA und tracrRNA. Dieses RNP wird zusammen mit der gewünschten fluoreszierenden Tag-Sequenz als Donorplasmid durch Elektroporation abgegeben.Muttativ editierte Zellen, die das fluoreszierende, markierte Protein exprimieren, werden mit FACS angereichert. Anschließend werden klonale Linien generiert, um die präzisen Bearbeitungsergebnisse zu analysieren. Dieses Gen-Editing-Protokoll hat viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Überexpressionskonstrukten.Da ein fluoreszierender Tag in das Genom eingeführt wird, können die subzelluläre Lokalisation und Dynamik des resultierenden Fusionsproteins unter endogener regulatorischer Kontrolle untersucht werden. Hier verwenden wir induzierte pluripotente Stammzellen als Modellsystem, da es uns ermöglicht, die markierten Proteine in diploiden nicht-transformierten Zellen zu untersuchen. Da die Zellen in mehrere Zelltypen differenziert werden können, wie die hier gezeigten Kardiomyozytenzellen, bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, markierte Proteine in einer Vielzahl von isogenen zellulären Kontexten zu erzeugen und zu untersuchen.Bei sorgfältiger Optimierung könnte dieses Protokoll jedoch für die Bearbeitung der Genome anderer Säugetierzelltypen angepasst werden. Hallo, ich bin Amanda Haupt, ich bin Teil des Stammzellen- und Gen-Editing-Teams hier am Allen Institute for Cell Science. Heute haben wir mit diesem Ansatz über 35 verschiedene Zelllinien erzeugt, die endogene Fusionsproteine exprimieren.Wir nutzen diese, um eine Vielzahl einzigartiger zellulärer Strukturen und Prozesse zu untersuchen. Dieser Ansatz war für bis zu 95% der Loci, die bisher mit unserer Gruppe versucht wurden, erfolgreich. Diese Methode wird besonders nützlich für Zellbiologen sein, die daran interessiert sind, die Dynamik eines Proteins in lebenden Zellen besser zu verstehen.Sobald jedoch die editierten klonalen Linien generiert sind, sind die Möglichkeiten für Studien endlos. Mit dieser Methode sind wir in der Lage, Klone mit monoallelischen fluoreszierenden Proteinmarkierungen konsistent zu identifizieren, ohne dass es zu weiteren Unterbrechungen in der Genomsequenz kommt. Gelegentlich sind wir auch in der Lage, biallelisch editierte Klone zu erhalten.In diesem Video zeigen wir einige der wichtigsten Schritte bei der Transfektionierung, FACS-Anreicherung und Isolierung klonaler Zelllinien, die endogen regulierte fluoreszierende Fusionsproteine exprimieren. Behandeln Sie die hiPS-Zellen zwei bis drei Stunden vor der Transfektion mit zehn mikromolaren ROCK-Inhibitoren, die in Wachstumsmedien supplementiert werden. Dies fördert das Überleben nach der Elektroporation.Die Zellen werden nach dieser Behandlung ein stacheliges Aussehen haben. Die Zellen sollten vor der Transfektion unter Verwendung einer einzelnen Zelldissoziationsregion aus der Gewebeverschlussplatte entnommen und die Zellsuspension in einem konischen Röhrchen gesammelt werden. Bereiten Sie für jede zu transfizierende Versuchsbedingung ein Aliquot von 1,84 mal 10 für die sechs Zellen vor.Bereiten Sie Ribonukleoprotein-Komplexröhrchen für jede Transfektion vor, indem Sie 2,88 Mikroliter 10 mikromolare Guide-RNA und 2,88 Mikroliter 10 mikromolare Cas9 in ein 1,5-mil-Röhrchen geben. Bei Raumtemperatur mindestens 10 Minuten, maximal eine Stunde inkubieren. Das im vorigen Schritt hergestellte Zellaliquot wird drei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 211-facher G pelletiert.Saugen Sie dann den Überstand an und drehen Sie das Zellpellet in 220 Mikrolitern Elektroporationspuffer. Geben Sie 220 Mikroliter resuspendierter Zellen in das zuvor vorbereitete 1,5 mil RNP-Komplexröhrchen. Fügen Sie 4,6 Mikroliter eines Mikrogramms pro Mikroliter Donorplasmid hinzu.Mischen Sie die beiden Inhalte mit der Nukleofektionsspitze und der Pipette zwei- bis dreimal und geben Sie dann hundert Mikroliter Suspension in das vorbereitete Elektroporationsgerät. Vermeiden Sie es, Blasen in die Spitze zu bringen. Legen Sie dreizehnhundert Volt für einen Impuls von dreißig Millisekunden an.Übertragen Sie die Suspension vorsichtig mit einer Schwenkbewegung in eine vorbereitete Sechs-Well-Platte. Dispergieren Sie die Zellen, indem Sie die Platte vorsichtig von einer Seite zur anderen und von vorne nach hinten bewegen. Nach der Wiederholung aller experimentellen Bedingungen und Kontrollen werden die transfizierten Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubiert und das Medium nach 24 Stunden auf reguläres Wachstumsmedium ohne ROCK-Inhibitor umgestellt.Füttern Sie die hiPSCs dann weiterhin alle 24 Stunden für 72 bis 96 Stunden und überwachen Sie ihre Konfluenz. Wenn die HiPS-Zellen eine Konfluenz von 68 bis 80 % erreichen, fahren Sie mit der FACS-Anreicherung fort. Zwei bis drei Stunden vor der Transfektion behandeln Sie hiPS-Zellen mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, die in das Wachstumsmedium supplementiert werden, um das Überleben nach der FACS-Anreicherung zu fördern.Um die Zellen zu sortieren, entfernen Sie sie mit dem Einzelzell-Dissoziationsreagenz von der Platte und filtrieren Sie dann die hiPSC-Suspension durch einen 35-Mikron-Maschenfilter in Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden. Sortieren Sie Zellen mit Vorwärts- und Seitenstreuung, einschließlich: Höhe versus Breite, Tripletts, Ablagerungen und Dubletten. Verwenden Sie Steuerzellen nur mit Live-Puffer, um das positive FP-Gate so einzustellen, dass weniger als 1,1 % der Zellen, die nur Puffer sind, innerhalb des Gates liegen.Bei der Sortierung von Stammzellen passen Sie die Geräteeinstellungen an, um das Überleben der Zellen zu fördern, wie im Diskussionsteil vorgeschlagen. Die typische Klopfeffizienz, die durch den Prozentsatz der FP-positiven Zellen durch FACS bestimmt wird, kann zwischen 0,1 % und 5 % liegen. Sortieren Sie die Zellen in ein 1,5 bis 15 mil Polypropylen-Röhrchen, das 0,5 bis 2 mil Wachstumsmedium bei Raumtemperatur enthält, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren. Die gesammelten Zellen werden bei 211-facher G drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.Den Überstand vorsichtig aspirieren und das Zellpellet in 200 Mikrolitern Wachstumsmedium, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, resuspendieren. Übertragen Sie bis zu dreitausend verschiedene Zellen in eine einzelne Vertiefung einer frischen, mit Matrigel beschichteten 96-Well-Platte. Inkubieren Sie sortierte Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 und wechseln Sie das Medium nach 24 Stunden auf Wachstumsmedien, die mit 5 mikromolaren ROCK-Inhibitoren ergänzt werden.Dann, nach 48 Stunden, füttern Sie die Zellen weiterhin mit regulären Wachstumsmedien, ohne ROCK-Inhibitor alle 24 Stunden für 72 bis 96 Stunden, um die Konfluenz zu überwachen. Sobald die Zellen reif genug sind, um aus der 96-Well-Platte herausgenommen zu werden, empfehlen wir, sie schrittweise in größere Platten zu überführen. Verschieben Sie sie beispielsweise von einer Vertiefung einer 96-Well-Platte auf ein bis zwei Vertiefungen einer 24-Well-Platte.Und dann von dort aus in eine 6-Well-Platte usw., bis Sie genügend Zellen für nachgelagerte Zwecke haben. In der Regel mindestens drei bis vier Millionen Zellen. Um klonale Linien aus der FACS-angereicherten Population von strafeditierten Zellen zu erzeugen, werden zehntausend Zellen in eine Einzelzellsuspension überführt und auf eine 10 Zentimeter dicke Platte aufgebracht, um die Kolonien fünf bis sieben Tage lang wachsen zu lassen.Wenn die Kolonien makroskopisch sichtbar sind, sind sie groß genug, um isoliert zu werden. Verwenden Sie an einem Präpariermikroskop eine P200-Pipette, um einzelne Kolonien vorsichtig von der Plattenoberfläche abzukratzen und abzusaugen. Übertragen Sie das Volumen mit der Kolonie in eine einzelne Vertiefung der 96-Well-Platte.Nachdem alle Kolonien übertragen wurden, inkubieren Sie die Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für 24 Stunden. Wechseln Sie das Medium nach 24 Stunden auf ein normales Wachstumsmedium ohne ROCK-Inhibitor. Füttern Sie die Zellen dann alle 24 Stunden für 72 bis 96 Stunden, bis sich die Kolonien ungefähr verdreifacht haben.Die Zellen müssen gezüchtet und in 96-Well-Platten passaget werden, um genügend Zellen für die Kryokonservierung von Antalis für die genomische DNA-Extraktion zu haben. Weitere Informationen finden Sie im schriftlichen Protokoll. Für den Durchgang in 96-Well-Platten wird ein Achtkanal-Aspirator verwendet, um das Medium aus der ersten Säule zu entfernen und zu entsorgen.Geben Sie mit einer P200-Mehrkanalpipette etwa 200 Mikroliter DPBS in die erste Säule der Platte, um die Zellen zu waschen. Entfernen Sie dann mit einem Achtkanal-Aspirator die DPBS-Wäsche aus der ersten Säule und entsorgen Sie sie. Geben Sie dann 40 Mikroliter Dissoziationsreagenz in die erste Spalte.Wiederholen Sie diese Schritte, indem Sie jeweils eine Säule für bis zu sechs Säulen der 96-Well-Platte bearbeiten. Wechseln Sie die Spitzen, um sicherzustellen, dass Sie die Bohrlöcher nicht kreuzen. Legen Sie die Platte für drei bis fünf Minuten in den Inkubator, nachdem das Dissoziationsreagenz in die erste Säule gegeben wurde.Wenn die Zellen in der ersten Säule der Platte begonnen haben, sich vom Boden abzuheben, verwenden Sie eine P200-Mehrkanalpipette, um 160 Mikroliter DPBS in die erste Säule zu geben, und zerreiben Sie die Zellen in den Positionen 12 Uhr, 3 Uhr, 6 Uhr und 9 Uhr jeder Vertiefung vorsichtig. Übertragen Sie das gesamte Volumen mit der Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden. Wiederholen Sie diese Schritte für die verbleibenden Säulen, die Dissoziationsreagenz enthalten, und ändern Sie die Spitzen, um die Vertiefungen nicht zu verunreinigen.Die V-Bodenplatte in der Zentrifuge bei 385-facher G für drei Minuten bei Raumtemperatur drehen. Die bis zu diesem Zeitpunkt gezeigten Subs für die 96-Well-Passage werden jedes Mal auf die gleiche Weise durchgeführt, wenn die Zellen in diesem Plattenformat durchlaufen werden. Als nächstes zeigen wir Ihnen, wie Sie vorgehen müssen, wenn Sie bereit sind, die Zellen im 96-Well-Format zu kryokonservieren.Weitere Informationen finden Sie im schriftlichen Protokoll. Nach dem im vorherigen Abschnitt gezeigten Zentrifugationsschritt wird der Überstand mit einer P200-Mehrkanalpipette aspiriert und dann in 60 Mikrolitern Wachstumsmedium, ergänzt mit einem 10-mikromolaren ROCK-Inhibitor, erneut suspendiert. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Vertiefungen und ändern Sie die Spitzen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.Übertragen Sie 30 Mikroliter Zellsuspension auf eine mit Nicht-Matrigel beschichtete 96-Well-Gewebekulturplatte. Übertragen Sie die restlichen 30 Mikroliter Suspension in eine Schwesterplatte und geben Sie dann schnell 170 Mikroliter Gefrierpuffer in jede Vertiefung, ohne zu mischen. Beachten Sie, dass dieser Prozess in doppelten Schwesterplatten durchgeführt wird, so dass nach dem Auftauen einer der einzelnen Platten eine Backup-Population von Zellen vorhanden ist.Das Einsetzen von kryokonservierten Zellen in nur jede zweite Säule der 96-Well-Platte ermöglicht ein schnelleres Auftauen. Wickeln Sie die Platte mit Parafilm ein und legen Sie sie in eine Styropordose mit Deckel bei Raumtemperatur. Lege die ganze Box in den minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank.Nach 24 Stunden können die Platten aus der Styroporbox umgefüllt und bis zu vier Wochen lang bei minus 86 Grad Celsius sortiert werden. Die Kryokonservierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen im 96-Well-Format ermöglicht eine zeitliche Pause in der Zellkultur. Der Forscher kann genomische Validierungsassays an den klonalen Minen durchführen, um die genetisch erwünschten Klone zu identifizieren, die für zukünftige Studien aufgetaut werden sollen.Vier Tage nach der Transfektion der WTC-hiPSC-Linie mit einem zielspezifischen Guide-RNA-Cas9-Protein und einem sorgfältig entworfenen Donor-Template-Plasmid wurde beobachtet, dass 0,95% der Zellen GFP exprimierten. FACS wurde verwendet, um alle GFP-positiven Zellen als angereicherte Population auszusortieren. Vorläufige mikroskopische Untersuchungen zeigten die erwartete Lokalisation des mEGFP-Kernlamin-B1-Fusionsproteins in der Kernhülle.Das fluoreszenzmarkierte Protein wurde in etwa 95% der Zellen mit unterschiedlicher Intensität beobachtet. Nach der Generierung klonaler Linien wurden Klone mit einheitlicher mEGFP-Intensität erhalten und für eine präzise Editierung weiter analysiert. Abschließend haben wir eine Transfektionsmethode zur Geneditierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen für die Expression endogen regulierter fluoreszierender Fusionsproteine gezeigt.Da typische Klopfineffizienzen gering sind, führt eine Anreicherungsstrategie wie die hier gezeigte FACS-Methode zu einer Population von mutmaßlich editierten Zellen, die das Fusionsprotein exprimieren. Die angereicherte Population kann für biologische Studien verwendet werden oder es können klonale Linien erzeugt werden, wie in dieser Methode beschrieben, wodurch es möglich ist, Zelllinien zu identifizieren, die präzise geneditiert sind. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Cas9-induzierte Doppelstrangbrüche im Genom oft ungenau repariert werden, obwohl der Tag am vorgesehenen Locus eingebaut wurde.Darüber hinaus enthält das nicht getaggte Allel in monoallelisch editierten Klonen häufig Indels, die höchstwahrscheinlich durch eine nicht-homologe Endverbindungsreparatur verursacht werden. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der genetischen Validierung nach einem CRISPR-Cas9-Knock-in, der erst durch die Analyse des Genoms klonaler Zelllinien aufgedeckt wurde. Die Expression des erwarteten Fusionsproteins allein garantiert keine präzise Editierung.Wenn Sie dieses Protokoll für die Editierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen verwenden, achten Sie darauf, die im schriftlichen Protokoll aufgeführten Empfehlungen zu befolgen, um eine schonende Behandlung der Zellen für ein optimales Zellüberleben und eine minimale spontane Differenzierung zu gewährleisten. Wir hoffen, dass dieses Video und das dazugehörige Protokoll und die Materialliste Ihnen helfen, ähnliche Experimente in Ihrem eigenen Labor an Ihrem Lieblingsprotein durchzuführen. Danke fürs Zuschauen.

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Forschung

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Genetik

Genom-Editing-Tools wie das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) haben die Effizienz des Gen-Targetings in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) erheblich verbessert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Generierung eines linienspezifischen hiPSC-Reporters unter Verwendung der CRISPR/Cas-System-unterstützten homologen Rekombination.

Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System

Protokolle HPSC Mutantenlinien mit der iCRISPR Plattform und zu differenzieren hPSCs in Glukose-responsive β-ähnlichen Zellen beschrieben zu erzeugen. Genom Bearbeitungstechnologie mit HPSC gerichtete Differenzierung Die Kombination bietet eine leistungsfähige Plattform für die systematische Analyse der Rolle von Lineage Determinanten in der menschlichen Entwicklung und Progression der Erkrankung.

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Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.

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Hier stellen wir ein Cas9-basiertes Exon23-Löschprotokoll vor, um die Dystrophinexpression in iPSC von Dmdmdx Maus-abgeleiteten Hautfibroblasten wiederherzustellen und iPSCs direkt in myogene Vorläuferzellen (MPC) mit dem Tet-on MyoD Aktivierungssystem zu differenzieren.

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Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Erleichterung der Erzeugung definierter heterozygoter oder homozygoter Nukleotid-Änderungen mit CRISPR-CAS9 in menschlichen pluripotenten Stammzellen.

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Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Reporter und Zellsortierung, um Knock-in-Experimente in Makrophagen- und T-Zelllinien zu vereinfachen. Für diese vereinfachten Knock-in-Experimente werden zwei Plasmide verwendet, nämlich ein CRISPR/Cas9- und DsRed2-exprimierendes Plasmid und ein homologes Rekombinationsspenderplasmid, das EBFP2 exprimiert, das dauerhaft am Rosa26-Locus in Immunzellen integriert ist.

Gene Knock-in durch CRISPR/Cas9 und Zellsortierung in Makrophagen- und T-Zelllinien

Hier stellen wir ein vereinfachtes endogenes Gen-Tagging-Protokoll für Drosophila vor, das eine PCR-basierte Technik zur markerfreien Identifizierung erfolgreicher genetischer Veränderungen verwendet und die Entwicklung stabiler Knock-in-Linien erleichtert.

Einstufige CRISPR-basierte Strategie zur endogenen Genmarkierung in Drosophila melanogaster

Die AviTag-spezifische standortbeschränkte Beleuchtungsverstärkte Biotinylierung (ALIBi) ist eine neuartige optogenetetisch aktivierte Methode, die zur Markierung und Affinitätsreinigung subzellulärer Populationen von Ribosomen für die nachgelagerte Sequenzierung und proteomische Analyse entwickelt wurde.

Isolierung subzellulärer Ribosom-Subpopulationen basierend auf rekombinanten, peptid-tag-spezifischer, ortsbeschränkter Beleuchtungsverstärkter Biotinylierung

Die vorgestellte Methode beschreibt die Erzeugung eines CRISPR-vermittelten Gen-Knockouts in der humanen embryonalen Stammzelllinie (hESC) H9, die sgRNAs, die auf das L2HGDH-Gen abzielen, unter Verwendung eines hocheffizienten lentiviralen Gentransfersystems stabil exprimiert.

CRISPR-Cas9-vermittelte Gendeletion in humanen pluripotenten Stammzellen, die unter feederfreien Bedingungen kultiviert wurden

Ein CRISPR/Cas9-Mikroinjektions-Workflow für endogene fluoreszierende Markierung in der Keimlinie Caenorhabditis elegans , um homozygote Knock-in-Linien für die In-vivo-Proteinlokalisationsanalyse zu erhalten.

CRISPR/Cas9-vermittelte endogene fluoreszierende Markierung keimbahnspezifischer Gene in Caenorhabditis elegans

Lernen Sie endogenes Protein-Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteindynamiken unter endogener Kontrolle.

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