Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

Das Ziel dieses Protokolls ist es, humane induzierte pluripotente Stammzellen zu erzeugen, die endogene Fusionsproteine exprimieren, die mit Endrahmen-N- oder C-terminalen Fluoreszenz-Tags fusioniert sind. Um den gewünschten Knock-in zu erzielen, verwenden wir das CRISPR-Cas9-System und einen Ribonukleoprotein-basierten Ansatz unter Verwendung des Wildtyp-S.pyogenes Cas9-Proteins und einer synthetischen zweiteiligen CRSPR-RNA und tracrRNA. Dieses RNP wird zusammen mit der gewünschten fluoreszierenden Tag-Sequenz als Donorplasmid durch Elektroporation abgegeben.

Muttativ editierte Zellen, die das fluoreszierende, markierte Protein exprimieren, werden mit FACS angereichert. Anschließend werden klonale Linien generiert, um die präzisen Bearbeitungsergebnisse zu analysieren. Dieses Gen-Editing-Protokoll hat viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Überexpressionskonstrukten.

Da ein fluoreszierender Tag in das Genom eingeführt wird, können die subzelluläre Lokalisation und Dynamik des resultierenden Fusionsproteins unter endogener regulatorischer Kontrolle untersucht werden. Hier verwenden wir induzierte pluripotente Stammzellen als Modellsystem, da es uns ermöglicht, die markierten Proteine in diploiden nicht-transformierten Zellen zu untersuchen. Da die Zellen in mehrere Zelltypen differenziert werden können, wie die hier gezeigten Kardiomyozytenzellen, bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, markierte Proteine in einer Vielzahl von isogenen zellulären Kontexten zu erzeugen und zu untersuchen.

Bei sorgfältiger Optimierung könnte dieses Protokoll jedoch für die Bearbeitung der Genome anderer Säugetierzelltypen angepasst werden. Hallo, ich bin Amanda Haupt, ich bin Teil des Stammzellen- und Gen-Editing-Teams hier am Allen Institute for Cell Science. Heute haben wir mit diesem Ansatz über 35 verschiedene Zelllinien erzeugt, die endogene Fusionsproteine exprimieren.

Wir nutzen diese, um eine Vielzahl einzigartiger zellulärer Strukturen und Prozesse zu untersuchen. Dieser Ansatz war für bis zu 95% der Loci, die bisher mit unserer Gruppe versucht wurden, erfolgreich. Diese Methode wird besonders nützlich für Zellbiologen sein, die daran interessiert sind, die Dynamik eines Proteins in lebenden Zellen besser zu verstehen.

Sobald jedoch die editierten klonalen Linien generiert sind, sind die Möglichkeiten für Studien endlos. Mit dieser Methode sind wir in der Lage, Klone mit monoallelischen fluoreszierenden Proteinmarkierungen konsistent zu identifizieren, ohne dass es zu weiteren Unterbrechungen in der Genomsequenz kommt. Gelegentlich sind wir auch in der Lage, biallelisch editierte Klone zu erhalten.

In diesem Video zeigen wir einige der wichtigsten Schritte bei der Transfektionierung, FACS-Anreicherung und Isolierung klonaler Zelllinien, die endogen regulierte fluoreszierende Fusionsproteine exprimieren. Behandeln Sie die hiPS-Zellen zwei bis drei Stunden vor der Transfektion mit zehn mikromolaren ROCK-Inhibitoren, die in Wachstumsmedien supplementiert werden. Dies fördert das Überleben nach der Elektroporation.

Die Zellen werden nach dieser Behandlung ein stacheliges Aussehen haben. Die Zellen sollten vor der Transfektion unter Verwendung einer einzelnen Zelldissoziationsregion aus der Gewebeverschlussplatte entnommen und die Zellsuspension in einem konischen Röhrchen gesammelt werden. Bereiten Sie für jede zu transfizierende Versuchsbedingung ein Aliquot von 1,84 mal 10 für die sechs Zellen vor.

Bereiten Sie Ribonukleoprotein-Komplexröhrchen für jede Transfektion vor, indem Sie 2,88 Mikroliter 10 mikromolare Guide-RNA und 2,88 Mikroliter 10 mikromolare Cas9 in ein 1,5-mil-Röhrchen geben. Bei Raumtemperatur mindestens 10 Minuten, maximal eine Stunde inkubieren. Das im vorigen Schritt hergestellte Zellaliquot wird drei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 211-facher G pelletiert.

Saugen Sie dann den Überstand an und drehen Sie das Zellpellet in 220 Mikrolitern Elektroporationspuffer. Geben Sie 220 Mikroliter resuspendierter Zellen in das zuvor vorbereitete 1,5 mil RNP-Komplexröhrchen. Fügen Sie 4,6 Mikroliter eines Mikrogramms pro Mikroliter Donorplasmid hinzu.

Mischen Sie die beiden Inhalte mit der Nukleofektionsspitze und der Pipette zwei- bis dreimal und geben Sie dann hundert Mikroliter Suspension in das vorbereitete Elektroporationsgerät. Vermeiden Sie es, Blasen in die Spitze zu bringen. Legen Sie dreizehnhundert Volt für einen Impuls von dreißig Millisekunden an.

Übertragen Sie die Suspension vorsichtig mit einer Schwenkbewegung in eine vorbereitete Sechs-Well-Platte. Dispergieren Sie die Zellen, indem Sie die Platte vorsichtig von einer Seite zur anderen und von vorne nach hinten bewegen. Nach der Wiederholung aller experimentellen Bedingungen und Kontrollen werden die transfizierten Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubiert und das Medium nach 24 Stunden auf reguläres Wachstumsmedium ohne ROCK-Inhibitor umgestellt.

Füttern Sie die hiPSCs dann weiterhin alle 24 Stunden für 72 bis 96 Stunden und überwachen Sie ihre Konfluenz. Wenn die HiPS-Zellen eine Konfluenz von 68 bis 80 % erreichen, fahren Sie mit der FACS-Anreicherung fort. Zwei bis drei Stunden vor der Transfektion behandeln Sie hiPS-Zellen mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, die in das Wachstumsmedium supplementiert werden, um das Überleben nach der FACS-Anreicherung zu fördern.

Um die Zellen zu sortieren, entfernen Sie sie mit dem Einzelzell-Dissoziationsreagenz von der Platte und filtrieren Sie dann die hiPSC-Suspension durch einen 35-Mikron-Maschenfilter in Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden. Sortieren Sie Zellen mit Vorwärts- und Seitenstreuung, einschließlich: Höhe versus Breite, Tripletts, Ablagerungen und Dubletten. Verwenden Sie Steuerzellen nur mit Live-Puffer, um das positive FP-Gate so einzustellen, dass weniger als 1,1 % der Zellen, die nur Puffer sind, innerhalb des Gates liegen.

Bei der Sortierung von Stammzellen passen Sie die Geräteeinstellungen an, um das Überleben der Zellen zu fördern, wie im Diskussionsteil vorgeschlagen. Die typische Klopfeffizienz, die durch den Prozentsatz der FP-positiven Zellen durch FACS bestimmt wird, kann zwischen 0,1 % und 5 % liegen. Sortieren Sie die Zellen in ein 1,5 bis 15 mil Polypropylen-Röhrchen, das 0,5 bis 2 mil Wachstumsmedium bei Raumtemperatur enthält, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren. Die gesammelten Zellen werden bei 211-facher G drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Den Überstand vorsichtig aspirieren und das Zellpellet in 200 Mikrolitern Wachstumsmedium, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, resuspendieren. Übertragen Sie bis zu dreitausend verschiedene Zellen in eine einzelne Vertiefung einer frischen, mit Matrigel beschichteten 96-Well-Platte. Inkubieren Sie sortierte Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 und wechseln Sie das Medium nach 24 Stunden auf Wachstumsmedien, die mit 5 mikromolaren ROCK-Inhibitoren ergänzt werden.

Dann, nach 48 Stunden, füttern Sie die Zellen weiterhin mit regulären Wachstumsmedien, ohne ROCK-Inhibitor alle 24 Stunden für 72 bis 96 Stunden, um die Konfluenz zu überwachen. Sobald die Zellen reif genug sind, um aus der 96-Well-Platte herausgenommen zu werden, empfehlen wir, sie schrittweise in größere Platten zu überführen. Verschieben Sie sie beispielsweise von einer Vertiefung einer 96-Well-Platte auf ein bis zwei Vertiefungen einer 24-Well-Platte.

Und dann von dort aus in eine 6-Well-Platte usw., bis Sie genügend Zellen für nachgelagerte Zwecke haben. In der Regel mindestens drei bis vier Millionen Zellen. Um klonale Linien aus der FACS-angereicherten Population von strafeditierten Zellen zu erzeugen, werden zehntausend Zellen in eine Einzelzellsuspension überführt und auf eine 10 Zentimeter dicke Platte aufgebracht, um die Kolonien fünf bis sieben Tage lang wachsen zu lassen.

Wenn die Kolonien makroskopisch sichtbar sind, sind sie groß genug, um isoliert zu werden. Verwenden Sie an einem Präpariermikroskop eine P200-Pipette, um einzelne Kolonien vorsichtig von der Plattenoberfläche abzukratzen und abzusaugen. Übertragen Sie das Volumen mit der Kolonie in eine einzelne Vertiefung der 96-Well-Platte.

Nachdem alle Kolonien übertragen wurden, inkubieren Sie die Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für 24 Stunden. Wechseln Sie das Medium nach 24 Stunden auf ein normales Wachstumsmedium ohne ROCK-Inhibitor. Füttern Sie die Zellen dann alle 24 Stunden für 72 bis 96 Stunden, bis sich die Kolonien ungefähr verdreifacht haben.

Die Zellen müssen gezüchtet und in 96-Well-Platten passaget werden, um genügend Zellen für die Kryokonservierung von Antalis für die genomische DNA-Extraktion zu haben. Weitere Informationen finden Sie im schriftlichen Protokoll. Für den Durchgang in 96-Well-Platten wird ein Achtkanal-Aspirator verwendet, um das Medium aus der ersten Säule zu entfernen und zu entsorgen.

Geben Sie mit einer P200-Mehrkanalpipette etwa 200 Mikroliter DPBS in die erste Säule der Platte, um die Zellen zu waschen. Entfernen Sie dann mit einem Achtkanal-Aspirator die DPBS-Wäsche aus der ersten Säule und entsorgen Sie sie. Geben Sie dann 40 Mikroliter Dissoziationsreagenz in die erste Spalte.

Wiederholen Sie diese Schritte, indem Sie jeweils eine Säule für bis zu sechs Säulen der 96-Well-Platte bearbeiten. Wechseln Sie die Spitzen, um sicherzustellen, dass Sie die Bohrlöcher nicht kreuzen. Legen Sie die Platte für drei bis fünf Minuten in den Inkubator, nachdem das Dissoziationsreagenz in die erste Säule gegeben wurde.

Wenn die Zellen in der ersten Säule der Platte begonnen haben, sich vom Boden abzuheben, verwenden Sie eine P200-Mehrkanalpipette, um 160 Mikroliter DPBS in die erste Säule zu geben, und zerreiben Sie die Zellen in den Positionen 12 Uhr, 3 Uhr, 6 Uhr und 9 Uhr jeder Vertiefung vorsichtig. Übertragen Sie das gesamte Volumen mit der Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden. Wiederholen Sie diese Schritte für die verbleibenden Säulen, die Dissoziationsreagenz enthalten, und ändern Sie die Spitzen, um die Vertiefungen nicht zu verunreinigen.

Die V-Bodenplatte in der Zentrifuge bei 385-facher G für drei Minuten bei Raumtemperatur drehen. Die bis zu diesem Zeitpunkt gezeigten Subs für die 96-Well-Passage werden jedes Mal auf die gleiche Weise durchgeführt, wenn die Zellen in diesem Plattenformat durchlaufen werden. Als nächstes zeigen wir Ihnen, wie Sie vorgehen müssen, wenn Sie bereit sind, die Zellen im 96-Well-Format zu kryokonservieren.

Weitere Informationen finden Sie im schriftlichen Protokoll. Nach dem im vorherigen Abschnitt gezeigten Zentrifugationsschritt wird der Überstand mit einer P200-Mehrkanalpipette aspiriert und dann in 60 Mikrolitern Wachstumsmedium, ergänzt mit einem 10-mikromolaren ROCK-Inhibitor, erneut suspendiert. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Vertiefungen und ändern Sie die Spitzen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.

Übertragen Sie 30 Mikroliter Zellsuspension auf eine mit Nicht-Matrigel beschichtete 96-Well-Gewebekulturplatte. Übertragen Sie die restlichen 30 Mikroliter Suspension in eine Schwesterplatte und geben Sie dann schnell 170 Mikroliter Gefrierpuffer in jede Vertiefung, ohne zu mischen. Beachten Sie, dass dieser Prozess in doppelten Schwesterplatten durchgeführt wird, so dass nach dem Auftauen einer der einzelnen Platten eine Backup-Population von Zellen vorhanden ist.

Das Einsetzen von kryokonservierten Zellen in nur jede zweite Säule der 96-Well-Platte ermöglicht ein schnelleres Auftauen. Wickeln Sie die Platte mit Parafilm ein und legen Sie sie in eine Styropordose mit Deckel bei Raumtemperatur. Lege die ganze Box in den minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank.

Nach 24 Stunden können die Platten aus der Styroporbox umgefüllt und bis zu vier Wochen lang bei minus 86 Grad Celsius sortiert werden. Die Kryokonservierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen im 96-Well-Format ermöglicht eine zeitliche Pause in der Zellkultur. Der Forscher kann genomische Validierungsassays an den klonalen Minen durchführen, um die genetisch erwünschten Klone zu identifizieren, die für zukünftige Studien aufgetaut werden sollen.

Vier Tage nach der Transfektion der WTC-hiPSC-Linie mit einem zielspezifischen Guide-RNA-Cas9-Protein und einem sorgfältig entworfenen Donor-Template-Plasmid wurde beobachtet, dass 0,95% der Zellen GFP exprimierten. FACS wurde verwendet, um alle GFP-positiven Zellen als angereicherte Population auszusortieren. Vorläufige mikroskopische Untersuchungen zeigten die erwartete Lokalisation des mEGFP-Kernlamin-B1-Fusionsproteins in der Kernhülle.

Das fluoreszenzmarkierte Protein wurde in etwa 95% der Zellen mit unterschiedlicher Intensität beobachtet. Nach der Generierung klonaler Linien wurden Klone mit einheitlicher mEGFP-Intensität erhalten und für eine präzise Editierung weiter analysiert. Abschließend haben wir eine Transfektionsmethode zur Geneditierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen für die Expression endogen regulierter fluoreszierender Fusionsproteine gezeigt.

Da typische Klopfineffizienzen gering sind, führt eine Anreicherungsstrategie wie die hier gezeigte FACS-Methode zu einer Population von mutmaßlich editierten Zellen, die das Fusionsprotein exprimieren. Die angereicherte Population kann für biologische Studien verwendet werden oder es können klonale Linien erzeugt werden, wie in dieser Methode beschrieben, wodurch es möglich ist, Zelllinien zu identifizieren, die präzise geneditiert sind. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Cas9-induzierte Doppelstrangbrüche im Genom oft ungenau repariert werden, obwohl der Tag am vorgesehenen Locus eingebaut wurde.

Darüber hinaus enthält das nicht getaggte Allel in monoallelisch editierten Klonen häufig Indels, die höchstwahrscheinlich durch eine nicht-homologe Endverbindungsreparatur verursacht werden. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der genetischen Validierung nach einem CRISPR-Cas9-Knock-in, der erst durch die Analyse des Genoms klonaler Zelllinien aufgedeckt wurde. Die Expression des erwarteten Fusionsproteins allein garantiert keine präzise Editierung.

Wenn Sie dieses Protokoll für die Editierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen verwenden, achten Sie darauf, die im schriftlichen Protokoll aufgeführten Empfehlungen zu befolgen, um eine schonende Behandlung der Zellen für ein optimales Zellüberleben und eine minimale spontane Differenzierung zu gewährleisten. Wir hoffen, dass dieses Video und das dazugehörige Protokoll und die Materialliste Ihnen helfen, ähnliche Experimente in Ihrem eigenen Labor an Ihrem Lieblingsprotein durchzuführen. Danke fürs Zuschauen.