Name: In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Lernen Sie die In-vitro-Rekonstitution selbstorganisierender MinDE-Proteinmuster auf unterstützten Lipid-Bilayern in PDMS-Mikrokompartimenten. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle über Proteinkonzentrationen und geometrische Bedingungen für Studien zur Zellbiologie und Membranbiophysik.

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Wir bedanken uns bei Michael Heymann und Frank Siedler für die Herstellung von Silizium-Wafer, Core Facility MPI-B um Hilfe bei der Proteinreinigung und Simon Kretschmer und Leon Harrington für Kommentare auf das Manuskript.

<ol><li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li>
<li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ParA%2FMinD+family+puts+things+in+their+place%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li>
<li>Shih, Y. -L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li>
<li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li>
<li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li>
<li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li>
<li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli%3A+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li>
<li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+Escherichia+coli%3A+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949(2014).</li>
<li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+biological+surfaces%3A+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MipZ%2C+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758(2014).</li>
<li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li>
<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li>
<li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li>
<li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271(2016).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li>
<li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE%27s+membrane+targeting+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582(2017).</li>
<li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li>
<li>Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li>
<li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li>
<li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li>
<li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845(2018).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116(2013).</li>
<li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li>
<li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis%3A+fabrication%2C+system+setup%2C+and+operation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21545286">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li>
<li>Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir haben ein Protokoll beschrieben für die in-vitro- Rekonstruktion des MinCDE Selbstorganisation auf planaren Lipid Bilayer unterstützt und im Lipid Bilayer bedeckt 3D-Strukturen, am Beispiel von stabförmigen PDMS Mikrostrukturen. Um wertvolle Daten aus diesen Proben zu erhalten, sind die wichtigsten Faktoren zur Steuerung Protein und Membran Qualität.
Eiweiß Protein Qualität Masse sollte mittels SDS-PAGE und Massenspektrometrie bestätigt werden. Darüber hinaus sollte überprüft werden, dass Proteine löslich und nicht aggregierten mithilfe von analytischen Gel Filtration oder dynamische Lichtstreuung. Gel-Filtration kann verwendet werden, um aggregierten Bruchteil der Proteine zu entfernen. Sorgfältige pH-Einstellung und die Qualität der zusätzlichen Nukleotiden ist wichtig, wie der Zusatz nicht angepasste oder teilweise abgebauten Nukleotids an Protein Aktien oder selbstorganisierenden Assays ausreichend proteinaktivität, also die Abschaffung zu beseitigen Selbstorganisati on.
Neben Proteinqualität Membran-Qualität ist sehr kritisch und unsachgemäße Membran Formation ist in den meisten Fällen die Ursache für mangelhafte Selbstorganisation und die Herkunft der artifizielle Oberflächenstrukturen.
Wenn Sie das Protokoll zum ersten Mal durchführen, ist es hilfreich, die unterstützten Lipid Bilayer Etikett nach einschließlich beschrifteten Lipide wie Atto-655-SCHMIERE oder DiI an niedrigen molaren Prozentsätze (0,05 %). Dadurch können die Eigenschaften und die Qualität der Membran direkt beurteilt werden. Verwendung von FRAP, kann die Fluidität der Membran beurteilt werden. Darüber hinaus kann man direkt die Qualität des Waschens der SLB, beurteilen, wie entweder es zu viele Bläschen, keine flüssige Membran oder keine Membran sein, wird wenn sie abgewaschen. Die offene Kammer-Ansatz ermöglicht die Membran, gründlich waschen und damit auch zu Bläschen zu entfernen, die auf der Oberfläche der SLB kleben. Wichtigsten Faktoren für den Erhalt der Flüssigkeit und homogene unterstützten Lipid Bilayer sind die Reinigung und Hydrophilie der Auflagefläche und die richtige Größe und Homogenität der SUVs. kann es helfen SUV Größe und Größe Distribution verwenden überprüfen dynamische Lichtstreuung. Engen Größenverteilung empfehlen wir Extrudieren die Vesikel, anstatt ihnen beschallen. Andere Methoden der Reinigung Deckgläsern, z. B. Behandlungen mit starken Basen, grundlegenden Reinigungsmittel oder mit Deckgläsern direkt nach dem Abspülen mit Wasser, können gute Ergebnisse, je nach Anwendung und Lipid Mischung erzielt werden.
Im erste Halbjahr das Protokoll hier vorgestellten, in-vitro- Wiederherstellung auf planaren unterstützten Lipid Bilayer in offenen Kammern hat den Vorteil der Erbringung der Oberfläche zugänglich für optische Microscopies, z. B. TIRF-Mikroskopie30, FRAP Analyse6,34, sowie Oberflächen-Temperaturfühler Techniken wie atomic Force Microscopy26Single-Teilchen. Die große homogene Fläche ermöglicht bessere Statistiken bei definierten Konzentrationen. Außerdem ermöglicht die offene Kammer Ansatz, um Proteinkonzentration und eine schnelle und einfache Zugabe von weiteren Komponenten, daher erlauben um zu titrieren Proteinkonzentration in einem Einkammer-20genau zu kontrollieren. Der Test kann auch durch Zugabe von anderen bakteriellen Divisome Komponenten wie FtsZ22,35, ZipA22 oder chimäres Protein FtsZ-YFP-MTS10,35erweitert werden.
Andere Gruppen haben einen ähnlichen Ansatz Neuaufbau der Min-System in Vitro, aber Verwendung einer Durchflusszelle statt eine offene Kammer17,18,19. Durchflusszellen haben gewisse Vorteile, insbesondere, wenn eine komplett geschlossene 3D-Umgebung benötigten18, den Einfluss der Strömung17,19,23 oder Membran Zusammensetzung23 auf MinCDE Muster ist untersucht, ob Proteinmuster sollen unter Bedingungen19Begrenzung Protein beobachtet werden. Lokale Steuerung der molekularen Konzentration ist jedoch schwieriger. Eiweißbausteinen, besonders Geist, stark an die Membran binden sie erste Begegnung18,19. Nach unserer Erfahrung zeigen die Proteine häufig unspezifische Bindung an Schläuche, Buchten, Spritzen und anderen mikrofluidischen teilen. Daher lokale proteinkonzentrationen von Eingabe Konzentrationen18 unterscheiden und auch über die Länge der Messzelle, was zu einer Vielzahl von verschiedenen Proteinmuster auf der Membran zwischen Einlass und Auslass, wie von anderen19beobachtet variieren.
Die zweite Hälfte des Protokolls hier präsentiert, die in-vitro- Rekonstitution in stabförmigen Mikrostrukturen erneut mit dem offenen Kammer Ansatz auf einem gemusterten Träger fallenden Lipid Bilayer ermöglicht eine einfache Imitation von in Vivo Protein Verhalten Obwohl ist präzise Steuerung über proteinkonzentrationen durch Puffer Entfernung verloren. Beachten Sie, dass weil die Wellenlänge der MinDE ist etwa eine Größenordnung größer in Vitro als in Vivo die stabförmigen Microcompartments sind auch über eine Größenordnung größer (10 x 30 µm) als eine stabförmige E. Coli Zelle.
Insgesamt ermöglicht dieses Protokoll für die präzise Steuerung aller Bedingungen einschließlich der Proteinkonzentration, Puffer Zusammensetzung und Eigenschaften der Membran. Der Einsatz von 3D strukturierte unterstützt ermöglicht die Reaktion unter räumliche Beengtheit, imitiert in Vivo Verhalten ohne die Notwendigkeit für komplexe Mikrofluidik Geräte untersucht werden.

Räumlich-zeitliche Muster sind unerlässlich in der Natur, Regulierung von komplexen Aufgaben auf der vielzelligen und zellulären Ebene von Morphogenese geregelte Zellteilung1,2. Reaktion-Diffusions-Systeme spielen eine wichtige Rolle bei der Etablierung dieser Muster, aber noch nicht gut verstanden. Ein Paradebeispiel für eine Reaktion-Diffusion-System und dadurch biologische System ist bisher die Escherichia coli MinCDE System3,4,5,6,7. Das MinCDE System schwankt von Zelle Pol Pol der Zelle in E. Coli in der Mitte der Zelle als künftige Gliederung Standort zu bestimmen. Dieses System basiert auf der ATPase Verstand, die ATPase Protein MinE und die Membran als eine räumliche Reaktion Matrix8aktivieren. MinC ist nicht Bestandteil der bildungsmechanismus Muster, aber ist die eigentliche funktionelle Agent: ein Inhibitor der wichtigsten Divisome Protein FtsZ5,6. MinC bindet an Geist und deshalb folgt die Schwingungen führt ein Konzentrationsgradient Zeit gemittelt Protein, das an den Polen der Zelle maximale und minimale in der Mitte der Zelle, ist nur erlaubt FtsZ polymerisieren bei midcell9,10 . Das MinCDE-System ist Teil der größeren Familie von Walker A ATPases, die Schlüssel für die räumlich-zeitliche Organisation in Bakterien2, zum Positionieren und den Transport von Protein-komplexe11 und Plasmide12 und für die Regulierung der Zelle Abteilung13 und Chromosom Abtrennung14. Daher die MinCDE-Reaktion-Diffusion-System nicht nur eine archetypische Reaktion-Diffusion-System darstellt, sondern hat auch Aufmerksamkeit wegen ihrer Relevanz für die räumlich-zeitliche Organisation in Bakterien.
Funktionellen Detailstudien des MinCDE Systems in Vivo sind kompliziert, da Manipulation der Proteine und gen Löschung führen in der Regel in Zellteilung Mängel. Darüber hinaus ändern die Zusammensetzung der Membran oder die Eigenschaften der Zellflüssigkeit in Vivo ist sehr anspruchsvoll15,16. Änderungen am System und beeinflussende Faktoren sind schwer, umso mehr im komplexen Umfeld der Zelle, zu interpretieren, wenn es in eine wichtige Funktion als Zellteilung gestört ist. Wir und andere haben daher wandte sich an eine in-vitro- Rekonstitution Ansatz, reduziert das System auf seine Kernkomponenten: Geist, MinE, ATP als Energiequelle und die unterstützten Lipid Bilayer als eine Reaktion Matrix6,17, 18. dieser Bottom-Up-Ansatz ermöglicht es, um den Mechanismus der Selbstorganisation in Detail, ohne die Komplexität einer lebenden Zelle zu erforschen. Reisen Oberfläche Proteine Form Wellen6 und andere Arten von Mustern17,19 unter diesen Bedingungen, wenn auch mit einer Wellenlänge, die in der Regel etwa eine Größenordnung größer als in Vivoist. Die Verwendung von eine offene Kammer ermöglicht präzise Kontrolle über alle Aspekte, die Einfluss auf Musterbildung: Protein Konzentrationen6, Protein Eigenschaften20Membran Zusammensetzung10, Puffer Zusammensetzung und ATP-Konzentration 6, sowie die Zugabe von anderen Faktoren wie engstand Agenten21 und anderen Divisome Proteinen22. Im Vergleich dazu die in-vitro- Rekonstitution des MinCDE Systems in eine-Durchflusszelle18,19,23 lässt sich den Einfluss der Strömung17,23, Protein Sonde Begrenzung der Bedingungen19, Membran Zusammensetzung19 und 3D Entbindung18 auf Proteinmuster, aber macht eine genaue Kontrolle der Protein/Komponente Konzentration und sequentielle Komponente zusätzlich viel mehr kompliziert.
Mit diesem offenen Saal, wir auch die Unterstützung der planaren Lipid Bilayer mit denen kann man wie geometrische Grenzen Einfluss Muster Bildung21, ein Phänomen, das vor kurzem Sonde gemustert auch untersucht worden in Vivo mit Hilfe von Bakterien in Mikrostrukturen7geformt. Wir beschäftigten auch dieser Assay zu untersuchen, wie definierte Mutationen in meinem Affekt Musterbildung der System-20. Darüber hinaus wurde das gleiche grundlegende Assay-Format eingesetzt, um zu untersuchen, wie Musterbildung durch Licht, Einführung einer Azobenzol-vernetzt-MinE-Peptid in der Assay und imaging mit TIRF-Mikroskopie24gesteuert werden kann.
Wir fanden, dass um das MinDE-Muster zu replizieren Bildung beobachtet, in Vivo in einer in-vitro- System, Haft Schlüssel war. Mit stabförmigen Microcompartments mit Dimensionen angepasst, um die größere Wellenlänge der MinDE in Vitro (10 x 30 µm), bekleidet mit einem unterstützten Lipid Bilayer erlaubt die Rekonstitution der MinDE Pol zu Pol Schwingungen und Proteinbildung gradient 10,25. In diesem Test sind unterstützten Lipid Bilayer auf einem gemusterten PDMS Substrat hinterlegt, die mehrere hundert Repliken von stabförmigen Microcompartments enthält, die oben offen bleiben. Dadurch kann die Reaktion in eine offene Kammer eingerichtet werden, und anschließend der Puffer wird abgesenkt, um den Rand des Microcompartments, damit die Reaktion auf ein kleines Volumen zu beschränken. Obwohl diese Fächer ein Luftpuffer Interface auf der einen Seite haben und damit keine volle 3D Entbindung durch Membran repräsentieren, ahmte die Proteindynamik in Vivo Schwingungen10,25. Im Vergleich zu 3D Beengtheit, zeigt die sehr ähnliche Ergebnisse18, die offene Mikrostrukturen-Assay ist relativ einfach und leicht zu handhaben und kann auch durchgeführt werden, von Laboratorien, die nicht mit speziellen Mikrofluidik Equipment ausgestattet sind und Reinraum-Einrichtungen.
Hier präsentieren wir Ihnen ein experimentelles Protokoll für Neuaufbau MinCDE Musterbildung auf Lipid Bilayer in-vitro unterstützt- über eine offene Kammer, die für die Steuerung aller Komponenten und einfachen Zugang durch optische Mikroskopie und mit Minderjährigen erlaubt Modifikationen, ist auch für die Oberfläche-Sonde Techniken26anpassungsfähig. Neben planaren unterstützten Lipid Bilayer, wir auch zeigen, wie Protein Entbindung mit einfachen gemusterten unterstützten Lipid Bilayer auf stabförmige PDMS Mikrostrukturen erzielt. Diese Tests können zwar für das MinCDE-System optimiert auch zu anderen Protein-Systemen übertragen werden, die in ähnlicher Weise mit der Membran, wie FtsZ27 oder eine minimale Aktin Kortex28interagieren.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>E.coli Polar Lipid Extrakt</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 5&prime;-triphosphat Dinatriumsalztrihydrat</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 5&prime;-diphosphat monokaliumsalzdihydrat</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraacetat</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure 98%</td><td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid 50%</td><td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Glycerin 86%</td><td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Base</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>PDMS-Vernetzer</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 und #63 funktionieren beide gut</td></tr><tr><td>Deckgläser #1,5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td>wird nur für PDMS-Mikrostrukturen</td></tr><tr><td>verwendet 0,5 ml Reaktionsgefäß</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td>0030123301</tr><tr><td>Kulturkolben 2L</td><td>Corning</td><td>z.B. 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfiltrationssäule: HiLoad Superdex 75 PG oder 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG Entsalzungssäule vorgepackte Säule</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>Dialysegerät: Slide-A-Lyzer Dialysekassetten, 3,5 K MWCO, 0,1 - 0,5 mL oder 0,5-3 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 oder 66330</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser: Milli-Q Typ 1 Reinstwassersysteme</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automatisiertes Proteinreinigungssystem: &Auml; kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Badsonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>z.B. Modell 1510</td></tr><tr><td>ARE-250 Mischer</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmareiniger Zepto</td><td>Diener electronic</td><td></td><td>verwenden Sauerstoff als Prozessgas</td></tr><tr><td>Verdrängerpipetten</td><td>Marke</td><td></td><td>Transferpettor Modelle mit Glasspitzen</td></tr><tr><td>LSM780 konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Ausgestattet mit Zeiss C-Apochromat 40X/1,20 Wasser-Immersionsobjektiv</td></tr><tr><td>Plasmiden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Department für Zelluläre und Molekulare Biophysik, MPI für Biochemie, Prof. Schwille</td><td></td><td>Plasmid-kodierendes His-MinD und nicht markiertes MinE zur Verbesserung der Ausbeute</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Abteilung für Zelluläre und Molekulare Biophysik, MPI für Biochemie, Prof. Schwille</td><td></td><td>Plasmid kodiert für His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Abteilung für Zelluläre und Molekulare Biophysik, MPI für Biochemie, Prof. Schwille</td><td></td><td>Plasmid kodiert für His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Abteilung für Zelluläre und molekulare Biophysik, MPI für Biochemie, Prof. Schwille</td><td></td><td>Plasmidkodierung His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinC</td><td>Abteilung für Zelluläre und Molekulare Biophysik, MPI für Biochemie, Prof. Schwille</td><td></td><td>Plasmid-kodierung His-MinC</td></tr></tbody></table>

in-vitro- rekonstitution der selbstorganisierenden proteinmuster auf unterstützten lipid bilayer

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Viele Aspekte der grundlegenden räumlich-zeitliche Organisation der Zellen werden durch Reaktion-Diffusion Schriftsysteme geregelt. In-vitro- Wiederherstellung solcher Systeme ermöglicht die detaillierte Studien der ihr zugrunde liegenden Mechanismen, die nicht machbar wäre in-vivo. Hier bieten wir ein Protokoll für die in-vitro- Wiederherstellung des MinCDE Systems von Escherichia coli, die die Zellteilung Septum in der Mitte der Zelle positioniert. Der Test soll nur die notwendigen Komponenten zur Selbstorganisation, nämlich eine Membran, die beiden Proteine Verstand und mir und Energie in Form von ATP liefern. Wir fertigen daher eine offene Reaktionskammer auf einem deckgläschen, auf dem eine unterstützte Lipid Bilayer gebildet wird. Die offene Bauweise der Kammer ermöglicht eine optimale Vorbereitung von Lipid Bilayer und kontrollierte Manipulation der Massen Inhalte. Die beiden Proteine, Verstand und mir, sowie ATP, werden dann in der Bulk-Volumen oberhalb der Membran hinzugefügt. Bildgebung ist durch viele optische Microscopies, als die Gestaltung unterstützt Konfokale, Weitfeld- und TIRF-Mikroskopie gleichermaßen möglich. In einer Abwandlung des Protokolls wird die Lipid-Bilayer auf einem gemusterten Träger auf Zelle-förmigen PDMS Mikrostrukturen, anstelle von Glas gebildet. Senkung der Bulk-Lösung bis zum Rand dieser Abteilungen umschließt die Reaktion in einem kleineren Fach und Grenzen, die es ermöglichen, Nachahmung von in Vivo oszillierende Verhalten bietet. Zusammengenommen, beschreiben wir Protokolle, um das MinCDE-System, sowohl mit als auch ohne räumliche Beengtheit rekonstruieren erlauben Forschern genau steuern alle Aspekte Musterbildung, wie Konzentrationsbereiche und Zugabe von anderen Faktoren beeinflusst oder Proteine und Komplexität der Systeme in einer relativ einfachen Versuchsaufbau systematisch zu erhöhen.

Proteinreinigung nach unserem Protokoll sollte min. Proteine ausreichende Reinheit Ausbeute. Als Referenz bietet Abbildung 1 ein SDS-PAGE-Bild des Geistes, eindringmittel Geist, MinE und MinC gekennzeichnet. Die einzelnen Schritte des Verfahrens durchführen einen MinDE-Selbstorganisation-Assay auf nicht gemustert unterstützten Lipid Bilayer sind in Abbildung 2beschrieben. Unter Verwendung dieses Protokolls, kann regelmäßige MinDE Reisen Oberflächenwellen in der Kammer (Abbildung 3) beobachtet werden. Die Wellenlänge kann innerhalb der Kammer leicht variieren, aber im allgemeinen Muster ähnlich aussehen. Die Kanten der Kammer sollte nicht für quantitative Vergleiche verwendet werden, wie Membranen, dass Formular auf den UV-Kleber scheinen andere Eigenschaften als auf dem Glas haben Oberfläche (siehe Abbildung 3). Reisen Oberflächenwellen können analysiert werden, durch die Intensität entlang der Ausbreitungsrichtung (Bild 3 b) auftragen. Während Geist Fluoreszenz Hochebenen ziemlich schnell von der Vorderkante der Welle und sinkt dann scharf an der Hinterkante, MinE Fluoreszenz steigt nahezu linear von der Beginn der MinD-Welle und erreicht sein Maximum nach Geist an der Hinterkante, wo es fällt deutlich6.
Neben Protein-Qualität ist die Qualität der unterstützten Lipid Bilayer kritischsten für eine regelmäßige Selbstorganisation von MinCDE. Einerseits wenn die Membran auch übermäßig gewaschen ist oder die darunter liegende Fläche gereinigt und somit zu stark aufgeladen wurde, können Löcher in der Membran bilden (Abb. 6A, oben). Auf der anderen Seite die Membran wird nicht richtig gewaschen oder die darunter liegende Fläche nicht gereinigt/hydrophilierten, Vesikel werden halten Sie sich an die Membran oder die membranfluidität beeinträchtigt wird (Abbildung 6A, unten). Obwohl nicht so offensichtlich wie bei der Beobachtung der Membran direkt über beschriftete Lipide, diese Probleme auch aus dem Geist-Fluoreszenz-Signal erkannt werden können als Muster nicht regelmäßig sind und die Fluoreszenz in der Maxima ist nicht homogen, sondern enthält "Löcher" oder helle Flecken wie in der mittleren Spalte der Abbildung 6Adargestellt.
Das Verfahren ist für die Selbstorganisation von MinDE in stabförmigen PDMS Mikrostrukturen in Abbildung 4zusammengefasst. Mehreren Protokoll Schritte müssen nicht wiederholt werden, da Proteine und Lipide wiederverwendet werden können. Wie auf Substraten nicht gemustert, das Substrat wird gereinigt und hydrophilierten (durch Plasmareinigung), eine unterstützte Lipid Bilayer sich auf dem PDMS bildet und Selbstorganisation Assay in einem Volumen von 200 µL eingerichtet ist. Um zu überprüfen, dass eine ordnungsgemäße Membran gebildet hat und MinDE selbst, auf der Membran organisiert, sind die Kammern abgebildet. Wenn eine geeignete Membran gebildet worden, MinDE Formen regelmäßig Reisen Oberflächenwellen auf der Oberfläche der PDMS zwischen den einzelnen Mikrostrukturen und auch am unteren Rand der Mikrostrukturen selbst organisiert, wie die Wellen frei können zu bewegen, über die gesamte Membran-bedeckten Oberfläche (Abb. 5A). Nach dem Puffer entfernen sollte die Fläche zwischen den Abteilen keine verbreitende MinDE-Muster (Abbildung 5 b), zeigen, wie es ganz trocken sein sollte. Wenn MinDE Muster noch in Bewegung sind, muss mehr Puffer entfernt werden. Die Proteine sind jetzt in den stabförmigen Microcompartments beschränkt, durch die Membran gekleidete PDMS und auf dem Luftweg auf die obere Schnittstelle (Abbildung 5), in der sie selbst organisieren. Unter diesen Bedingungen können die beiden Proteine Pol zu Pol Schwingungen ausführen, wie in Abbildung 5dargestellt. Wie ein Bruchteil des Geistes und mir immer Membrane-springen, sind auch beim Puffer entfernen, die Konzentrationen nach der Entfernung der Puffer nicht vergleichbare Konzentrationen eingeben. Wegen dieses Effekts variieren die Konzentrationen auch zwischen einzelnen Mikrostrukturen auf der gleichen Deckglas, da sie abhängig von der Position der Muster vor dem Puffer entfernen. Silizium-Wafer-Produktion oder PDMS Formgebung aus der Silizium-Wafer kann unvollständig Mikrostrukturen führen, die für die Analyse (Abb. 6 b) verwendet werden kann. Darüber hinaus aufgrund der Puffer Entfernung Mikrostrukturen könnte während des Prozesses austrocknen und sollte daher von der weiteren Analyse (Abb. 6 b) ausgeschlossen werden. Als Ergebnis zeigt nur einen Bruchteil von Mikrostrukturen in einer Kammer die gewünschten Schwingungen von Pol zu Pol. Um Proteindynamik in die Mikrostrukturen zu analysieren, erhalten Sie eine Glomeruli durch Zeichnen eine Auswahl über die gesamte Struktur (Abb. 5E). Beim MinCDE oszillieren von Pol zu Pol, erscheinen MinC und Geist ein Konzentrationsgradient Zeit gemittelt mit maximaler Konzentration an den Fach-Polen und minimale Konzentration in der Mitte des Fachs (Abbildung 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Abbildung 1: SDS-PAGE zeigt die finalen Produkte von Protein Reinigungen. Seinen Verstand (33,3 kDa), His-eGFP-MinD (60,1 kDa), seine-mRuby3-Geist (59,9 kDa), His-MinE (13,9 kDa) und seine MinC (28,3 kDa) werden in der Reihenfolge angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Abbildung 2: Prozess-Flow-Diagramm zeigt die einzelnen Schritte und das Timing des Protokolls für eine Selbstorganisation auf nicht-gemusterten unterstützten Lipid Bilayer (Schritte 1 bis 6). Gestrichelte Kästchen zeigen an, dass eine der folgenden zwei Optionen zur Reinigung verwendet werden kann. Mit Kreisen markierten Pfeile zeigen wo das Protokoll angehalten und später fortgesetzt werden kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Abbildung 3: Imaging von MinDE-Assay konfokalen Mikroskopie. A) regelmäßige Min Spirale, von Geschwindigkeit, die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Welle und Intensität Grundstück Messungen erhalten werden können. Konzentrationen verwendet: 0,6 µM MinD (30 % eGFP-Geist), 1,8 µM sein-MinE (30 % seiner-MinE-Alexa647) B) Beispiel normalisierte Intensität Plot für die Region gekennzeichnet in A. C) Überblick über die gesamte Assay Kammer (Maßstabsleiste: 1 mm, gleiche proteinkonzentrationen als siehe oben). Spiralen drehen beide Richtungen sowie Ziel Muster beobachtet werden können. Die vergrößerte Region zeigt Unterschiede zwischen Wellenmuster auf der UV-Kleber. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Abbildung 4: Prozessfluss-Diagramm zeigt die einzelnen Schritte und das Timing des Protokolls zur Selbstorganisation in stabförmigen Mikrostrukturen (Schritte 1 bis 5, 7, 8). Graue Kästchen zeigen Schritte aus dem Protokoll auf nicht-gemusterten unterstützten Lipid Bilayer wo Produkte wiederverwendet werden können. Mit Kreisen markierten Pfeile zeigen wo das Protokoll angehalten und später fortgesetzt werden kann. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse für MinDE Muster Bildung in stabförmigen PDMS Microcompartments. (A) MinDE selbst zu organisieren, auf der Oberfläche der PDMS bilden Reisen Oberflächenwellen (MinD 1 µM (30 % EGFP-Geist), 2 µM MinE und 2,5 mM ATP). B) nach der Puffer auf die Höhe der Mikrostrukturen gesenkt wird, stoppt die Selbstorganisation von Protein auf der Ebenen Oberfläche zwischen den Microcompartments. C) Stromlaufplan von einem stabförmigen Microcompartment. D) repräsentative Bilder von MinDE Pol zu Pol Schwingungen nach dem Puffer entfernen. E) Glomeruli der Schwingungen entlang der markierten Linie gezeigt in D). F) Image und Profil der durchschnittliche Fluoreszenzintensität der Zeitreihen dargestellt in D) klar hervorgeht, das Protein Gefälle, das maximale an Microcompartment Polen und Fach Mitte minimal ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Abbildung 6: Beispiele für negative experimentelle Ergebnisse. A) übermäßig gewaschene Membranen akkumulieren Löcher, während suboptimale Vesikel Vorbereitungen und Lipid-Kompositionen zu kleben Bläschen führen. Die beiden mittleren Platten zeigen eine Kombination von Problemen und wie werden sie sichtbar, wenn Min Schwingungen zu beobachten. Membranen wurden beschriftet mit 0,05 % Atto655-SCHMIERE. (Skalieren Bars: 50 µm) B) Oberseite: ausgetrocknet Microcompartments kann verursacht werden durch zu viel Puffer entfernen, oder wenn der Puffer im Laufe der Zeit verdunstet. Bodenplatte: unvollständige Fächer während der Produktion von Wafern oder PDMS Formteil gebildet werden können. (Skalieren Bars: 30 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Datei 1: Plasmid-Karte für seinen Verstand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Plasmid-Karte für seinen EGFP Verstand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 3: Plasmid-Karte für sein mRuby3 Geist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 4: Plasmid-Karte für seine MinE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 5: Plasmid-Karte für seine MinC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 6: CAD-Datei für Silizium-Wafer von stabförmigen Microcompartments. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Wir bieten ein Protokoll für in-vitro- Assays der Selbstorganisation von Verstand und mir auf einem unterstützten Lipid Bilayer in eine offene Kammer. Darüber hinaus beschreiben wir, wie der Assay in Lipid-plattiert PDMS Microcompartments in Vivo -Bedingungen durch Reaktion Entbindung imitieren einzuschließen.

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über die Organisation und die Membranen von Zellen zu beantworten, z. B. welche Rolle geometrische Hinweise dabei spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine präzise Kontrolle über alle Aspekte ermöglicht, die die Musterbildung beeinflussen, wie z. B. die Proteinkonzentrationen. Generieren Sie zunächst mehrlamelläre Vesikel, wie im Textprotokoll beschrieben.Gefrieren und tauen Sie nun die Lipide für sieben bis 10 Zyklen auf, indem Sie zuerst ein Becherglas mit 70 bis 99 Grad Celsius heißem Wasser auf einer heißen Platte sowie einen Behälter mit flüssigem Stickstoff vorbereiten. Halten Sie die Durchstechflasche mit einer großen Pinzette in flüssigen Stickstoff, bis der Stickstoff aufhört zu sieden. Füllen Sie dann die Durchstechflasche in heißes Wasser, bis die Lösung vollständig aufgetaut ist.Wiederholen Sie diese Schritte, bis das Lipidgemisch je nach Mischung klar für das Auge erscheint. Als nächstes montieren Sie einen Lipid-Extruder und spülen das System mit Min-Puffer vor. Extrudieren Sie das Lipidgemisch zwischen 35 und 41 Mal durch eine Membran von 50 Nanometern Porengröße.Achten Sie darauf, dass Sie mit einer ungeraden Anzahl von Durchgängen enden, um Aggregate zu vermeiden, die die Membran nie durchlaufen haben. Verteilen Sie Glasdeckgläser auf einer Petrischale aus umgekehrtem Glas oder einer anderen inerten Oberfläche. Geben Sie mit einer Glaspipette sieben Tropfen konzentrierte Schwefelsäure in die Mitte jedes Deckglases.Geben Sie dann zwei Tropfen 50%iges Wasserstoffperoxid in die Mitte der Säuretropfen. Die Reaktion abdecken und mindestens 45 Minuten inkubieren. Nehmen Sie nun die Deckgläser einzeln mit einer Pinzette auf und spülen Sie die Säure mit Reinstwasser ab.Legen Sie die gewaschenen Deckgläser in antihaftbeschichtete Halterungen oder ein ähnliches Transportmittel. Spülen Sie nun jedes Deckglas ausgiebig mit Reinstwasser ab und trocknen Sie die Oberfläche mit Druckgas. Markieren Sie die saubere Seite des Deckglases mit einem Permanentmarker.Um die Kammer zusammenzubauen, schneiden Sie zuerst den Deckel und den konischen Teil eines 0,5-Milliliter-Reaktionsröhrchens mit einer scharfen Schere ab und entsorgen Sie es. Tragen Sie dann UV-Kleber auf den oberen Rand der Tube auf und verteilen Sie den Kleber gleichmäßig mit einer Pipettenspitze. Kleben Sie die Tube kopfüber auf die saubere Seite des Deckglases.Zum Schluss härten Sie den UV-Kleber aus, indem Sie mehrere Kammern fünf bis 15 Minuten lang unter eine 360-Nanometer-Lampe oder LED legen. Für eine unterstützte Lipid-Doppelschichtbildung heizen Sie einen Wärmeblock auf 37 Grad Celsius vor und inkubieren zwei Milliliter-Reaktionsröhrchen mit Min- oder SLB-Puffer bei einem Röhrchen pro Kammer. Blasen Sie Stickstoff in die zusammengebauten und ausgehärteten Kammern, um Staub oder andere Partikel zu entfernen, die sich während der UV-Härtung und Montage abgesetzt haben könnten.Stellen Sie dann die Kammern auf den Heizblock. Verdünnen Sie ein Aliquot von 20 Mikrolitern klarer Lipide mit 130 Mikrolitern Min-Puffer und bilden Sie eine Arbeitskonzentration von 0,53 Milligramm pro Milliliter. Geben Sie 75 Mikroliter der Lipidmischung in jede Kammer.Stellen Sie nun einen Timer auf drei Minuten. Während der Inkubationszeit platzen die Vesikel auf der hydrophilen Glasoberfläche und verschmelzen zu einem kohärenten SLB. Nach Ablauf von 60 Sekunden geben Sie 150 Mikroliter Min-Puffer in jede Kammer.Waschen Sie nach den verbleibenden 120 Sekunden jede Kammer, indem Sie 200 Mikroliter Min- oder SLB-Puffer hinzufügen, einige Male vorsichtig auf und ab pipettieren, weitere 200 Mikroliter entfernen und hinzufügen. Nachdem jede Kammer einmal gewaschen wurde, waschen Sie die erste Kammer gründlich, bis die zwei Milliliter Puffer aufgebraucht sind. Das Waschen von gestützten Lipiddoppelschichten erfordert etwas Erfahrung, um das Ausmaß der Bewegungen in der Kammer zu perfektionieren und die richtige Waschintensität zu finden.Um PDMS-Mikrostrukturen aus strukturierten Siliziumwafern herzustellen, verwenden Sie zunächst einen Kunststoffbecher, um 10 Gramm PDMS-Basis und ein Gramm PDMS-Vernetzer zu wiegen. Verwenden Sie ein Mischgerät, um das PDMS-Gemisch zu mischen und zu entgasen. Verwenden Sie nun eine Pipettenspitze, um eine kleine Menge PDMS direkt auf die Struktur auf dem Siliziumwafer zu tropfen.Setzen Sie sofort ein Deckglas 1 auf den PDMS-Tropfen und nehmen Sie das obere Ende einer sauberen Pipettenspitze, um das Deckglas vorsichtig auf den Silikonwafer zu drücken. Das PDMS sollte sich dünn zwischen dem Deckglas und dem Siliziumwafer verteilen. Legen Sie den Wafer mit den Deckgläsern in einen Ofen und härten Sie das PDMS drei bis vier Stunden oder über Nacht bei 75 Grad Celsius aus.Als nächstes nimmst du die Waffel aus dem Ofen und lässt sie auf Zimmertemperatur abkühlen. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge vorsichtig das Deckglas mit dem beigefügten PDMS vom Silikonwafer. Befestigen Sie nun eine Kunststoffkammer an das PDMS, wie zuvor für Glas beschrieben.Nehmen Sie die Deckgläser mit der beigefügten Kammer und legen Sie sie in den Plasmareiniger mit Sauerstoff als Prozessgas. Reinigen Sie die Deckgläser mit Plasma. Bei dieser Arbeit wurde eine Minute lang eine Leistung von 30 % und ein Sauerstoffdruck von 0,3 Millibar verwendet.Bereiten Sie nun in der Kammer einen SLB vor, wie zuvor auf Glas beschrieben. Um den Selbstorganisations-Assay durchzuführen, stellen Sie das Puffervolumen in der Kammer auf 200 Mikroliter Min-Puffer ein, abzüglich der Menge an Protein und ATP-Lösung. Fügen Sie dann MinD, mit MinD, MinE und falls gewünscht MinC hinzu und mischen Sie die Komponenten vorsichtig durch Pipettieren.Fügen Sie nun 2,5 millimolares ATP hinzu, um die Selbstorganisation von MinDE zu starten. Überprüfen Sie in den nächsten 10 bis 30 Minuten mit einem Fluoreszenzmikroskop die regelmäßige MinDE-Musterbildung und die korrekt gebildeten Mikrostrukturen. Wenn sich regelmäßige MinDE-Muster gebildet haben, pipettieren Sie zweimal vorsichtig auf und ab, um die Komponenten zu mischen.Entfernen Sie den großen Teil des Puffers mit einer 100-Mikroliter-Pipette und entfernen Sie dann vorsichtig den Rest mit einer 10-Mikroliter-Pipette. Um längere Bildgebungszeiten zu ermöglichen, stecken Sie ein angefeuchtetes Stück Schwamm in die Kammer. Achten Sie darauf, dass der Schwamm nicht mit der Oberfläche des Deckglases in Berührung kommt.Verschließen Sie die Kammer sofort mit einem Deckel, um ein Austrocknen des Restpuffers in den Mikrostrukturen zu vermeiden. Bevor Sie die Mikrostrukturen abbilden, bestätigen Sie, dass die MinDE-Selbstorganisation auf der PDMS-Mikrostruktur gestoppt wird, während die Proteine in den Mikrokavitäten oszillieren. In diesem repräsentativen Video zeigt die zweifarbige Bildgebung, wie sich MinD und MinE selbst zu wandernden Oberflächenwellen organisieren, die spiralförmigen Mustern auf gestützten Lipiddoppelschichten entsprechen.Hier zeigt die einfarbige Bildgebung, dass MinD und MinE Pol-zu-Pol-Oszillationen in PDMS-Mikrostrukturen ausführen. Die Oszillationen bilden einen zeitlich gemittelten MinD-Konzentrationsgradienten mit maximaler Konzentration an den Kompartimentpolen und minimaler Konzentration in der Mitte des Kompartiments. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Einzelpartikelverfolgung, durchgeführt werden, um die Kinetik der Membranbindung und die Verweilzeiten zu bestimmen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Piranha-Lösung äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie persönliche Schutzausrüstung getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Untersuchung der Immunsynapsenbildung zwischen primären menschlichen T-Zellen und gestützten Lipiddoppelschichten (SLB). T-Zell-Oberflächenproteine interagieren mit den jeweiligen Liganden, die auf SLB immobilisiert sind, um eine Immunsynapse zu bilden, gefolgt von der Bewegung der lytischen Granula in Richtung der Synapse, die mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht wird.

Eine In-vitro-Technik zur Untersuchung der T-Zell-Interaktion mit gestützten planaren Lipid-Doppelschichten

Wir stellen ein Protokoll Glas mit nanometrischer Proteinflecken von einem Fluid Lipiddoppelschicht umgeben funktionalisieren. Diese Substrate sind kompatibel mit den fortschrittlichen optischen Mikroskopie und sollen als Plattform für die Zelladhäsion und Migration Studien dienen.

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Hier präsentieren wir zwei ultraschnelle Protokolle zur Rekonstitution von Membranproteinen in Fusogenic Proteoliposomes und Verschmelzung von solchen Proteoliposomes mit Ziel Lipid Bilayer für Waschmittel-freie Lieferung dieser Membran Proteine in der postfusion Bilayer. Die Kombination dieser Ansätze ermöglicht schnelle und leichtführig Montage von komplexen Mehrkomponenten Membransystemen.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Solide unterstützt, eiweißfreie, doppelte Phospholipid Bilayer Membranen (DLBM) können in komplexen und dynamischen Lipid Nanotube Netze umgewandelt werden und können als 2D Bottom-up-Modellen von dem endoplasmatischen Retikulum dienen.

Spontane Bildung und Neuordnung der künstlichen Lipid Nanotube Netze als Bottom-Up-Modell für endoplasmatische Retikulum

Mitochondriale Fusion ist eine wichtige panostatische Reaktion, die der mitochondrialen Dynamik zugrunde liegt. Hier wird ein In-vitro-Rekonstitutionssystem beschrieben, um die mitochondriale Innenmembranfusion zu untersuchen, die Membran-Tethering, Andocken, Hämifusion und Porenöffnung auflösen kann. Die Vielseitigkeit dieses Ansatzes bei der Erforschung von Zellmembransystemen wird diskutiert.

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von Zell-imitierenden Uni-Lipid- und Multi-Lipid-Vesikeln, unterstützten Lipiddoppelschichten und suspendierten Lipiddoppelschichten. Diese In-vitro-Modelle können angepasst werden, um eine Vielzahl von Lipidtypen zu integrieren und können verwendet werden, um verschiedene Molekül- und Makromolekül-Interaktionen zu untersuchen.

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten und die Zugabe von Zytoskelettfilamenten und Motorproteinen, um die Dynamik rekonstituierter, membrangebundener Zytoskelettnetzwerke mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

In diesem Manuskript demonstrieren wir die experimentellen Techniken zur Verkapselung des F-Aktin-Zytoskeletts in riesige unilamellare Lipidvesikel (auch Liposomen genannt) und die Methode zur Bildung einer Kortex-bioimitierenden F-Aktin-Schicht am inneren Blättchen der Liposomenmembran.

In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln

Die zellfreie Rekonstitution war ein Schlüsselwerkzeug, um die Zytoskelett-Montage zu verstehen, und die Arbeit in den letzten zehn Jahren hat Ansätze zur Untersuchung der Septindynamik in minimalen Systemen etabliert. Hier werden drei komplementäre Methoden zur Beobachtung der Septinmontage in verschiedenen Membrankontexten vorgestellt: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen.

Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Erzeugung lichtregulierter und reversibler Proteinmuster mit hoher raumzeitlicher Präzision an künstlichen Lipidmembranen beschrieben. Die Methode besteht aus der lokalisierten Photoaktivierung des Proteins iLID (improved light-inducible dimer), das auf Modellmembranen immobilisiert ist und unter blauem Licht an sein Partnerprotein Nano (Wildtyp-SspB) bindet.

Dynamische lichtinduzierte Proteinmuster an Modellmembranen

Lernen Sie die In-vitro-Rekonstitution selbstorganisierender MinDE-Proteinmuster auf unterstützten Lipid-Bilayern in PDMS-Mikrokompartimenten. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle über Proteinkonzentrationen und geometrische Bedingungen für Studien zur Zellbiologie und Membranbiophysik.

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

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