In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Wir bieten ein Protokoll für in-vitro- Assays der Selbstorganisation von Verstand und mir auf einem unterstützten Lipid Bilayer in eine offene Kammer. Darüber hinaus beschreiben wir, wie der Assay in Lipid-plattiert PDMS Microcompartments in Vivo -Bedingungen durch Reaktion Entbindung imitieren einzuschließen.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über die Organisation und die Membranen von Zellen zu beantworten, z. B. welche Rolle geometrische Hinweise dabei spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine präzise Kontrolle über alle Aspekte ermöglicht, die die Musterbildung beeinflussen, wie z. B. die Proteinkonzentrationen. Generieren Sie zunächst mehrlamelläre Vesikel, wie im Textprotokoll beschrieben.

Gefrieren und tauen Sie nun die Lipide für sieben bis 10 Zyklen auf, indem Sie zuerst ein Becherglas mit 70 bis 99 Grad Celsius heißem Wasser auf einer heißen Platte sowie einen Behälter mit flüssigem Stickstoff vorbereiten. Halten Sie die Durchstechflasche mit einer großen Pinzette in flüssigen Stickstoff, bis der Stickstoff aufhört zu sieden. Füllen Sie dann die Durchstechflasche in heißes Wasser, bis die Lösung vollständig aufgetaut ist.

Wiederholen Sie diese Schritte, bis das Lipidgemisch je nach Mischung klar für das Auge erscheint. Als nächstes montieren Sie einen Lipid-Extruder und spülen das System mit Min-Puffer vor. Extrudieren Sie das Lipidgemisch zwischen 35 und 41 Mal durch eine Membran von 50 Nanometern Porengröße.

Achten Sie darauf, dass Sie mit einer ungeraden Anzahl von Durchgängen enden, um Aggregate zu vermeiden, die die Membran nie durchlaufen haben. Verteilen Sie Glasdeckgläser auf einer Petrischale aus umgekehrtem Glas oder einer anderen inerten Oberfläche. Geben Sie mit einer Glaspipette sieben Tropfen konzentrierte Schwefelsäure in die Mitte jedes Deckglases.

Geben Sie dann zwei Tropfen 50%iges Wasserstoffperoxid in die Mitte der Säuretropfen. Die Reaktion abdecken und mindestens 45 Minuten inkubieren. Nehmen Sie nun die Deckgläser einzeln mit einer Pinzette auf und spülen Sie die Säure mit Reinstwasser ab.

Legen Sie die gewaschenen Deckgläser in antihaftbeschichtete Halterungen oder ein ähnliches Transportmittel. Spülen Sie nun jedes Deckglas ausgiebig mit Reinstwasser ab und trocknen Sie die Oberfläche mit Druckgas. Markieren Sie die saubere Seite des Deckglases mit einem Permanentmarker.

Um die Kammer zusammenzubauen, schneiden Sie zuerst den Deckel und den konischen Teil eines 0,5-Milliliter-Reaktionsröhrchens mit einer scharfen Schere ab und entsorgen Sie es. Tragen Sie dann UV-Kleber auf den oberen Rand der Tube auf und verteilen Sie den Kleber gleichmäßig mit einer Pipettenspitze. Kleben Sie die Tube kopfüber auf die saubere Seite des Deckglases.

Zum Schluss härten Sie den UV-Kleber aus, indem Sie mehrere Kammern fünf bis 15 Minuten lang unter eine 360-Nanometer-Lampe oder LED legen. Für eine unterstützte Lipid-Doppelschichtbildung heizen Sie einen Wärmeblock auf 37 Grad Celsius vor und inkubieren zwei Milliliter-Reaktionsröhrchen mit Min- oder SLB-Puffer bei einem Röhrchen pro Kammer. Blasen Sie Stickstoff in die zusammengebauten und ausgehärteten Kammern, um Staub oder andere Partikel zu entfernen, die sich während der UV-Härtung und Montage abgesetzt haben könnten.

Stellen Sie dann die Kammern auf den Heizblock. Verdünnen Sie ein Aliquot von 20 Mikrolitern klarer Lipide mit 130 Mikrolitern Min-Puffer und bilden Sie eine Arbeitskonzentration von 0,53 Milligramm pro Milliliter. Geben Sie 75 Mikroliter der Lipidmischung in jede Kammer.

Stellen Sie nun einen Timer auf drei Minuten. Während der Inkubationszeit platzen die Vesikel auf der hydrophilen Glasoberfläche und verschmelzen zu einem kohärenten SLB. Nach Ablauf von 60 Sekunden geben Sie 150 Mikroliter Min-Puffer in jede Kammer.

Waschen Sie nach den verbleibenden 120 Sekunden jede Kammer, indem Sie 200 Mikroliter Min- oder SLB-Puffer hinzufügen, einige Male vorsichtig auf und ab pipettieren, weitere 200 Mikroliter entfernen und hinzufügen. Nachdem jede Kammer einmal gewaschen wurde, waschen Sie die erste Kammer gründlich, bis die zwei Milliliter Puffer aufgebraucht sind. Das Waschen von gestützten Lipiddoppelschichten erfordert etwas Erfahrung, um das Ausmaß der Bewegungen in der Kammer zu perfektionieren und die richtige Waschintensität zu finden.

Um PDMS-Mikrostrukturen aus strukturierten Siliziumwafern herzustellen, verwenden Sie zunächst einen Kunststoffbecher, um 10 Gramm PDMS-Basis und ein Gramm PDMS-Vernetzer zu wiegen. Verwenden Sie ein Mischgerät, um das PDMS-Gemisch zu mischen und zu entgasen. Verwenden Sie nun eine Pipettenspitze, um eine kleine Menge PDMS direkt auf die Struktur auf dem Siliziumwafer zu tropfen.

Setzen Sie sofort ein Deckglas 1 auf den PDMS-Tropfen und nehmen Sie das obere Ende einer sauberen Pipettenspitze, um das Deckglas vorsichtig auf den Silikonwafer zu drücken. Das PDMS sollte sich dünn zwischen dem Deckglas und dem Siliziumwafer verteilen. Legen Sie den Wafer mit den Deckgläsern in einen Ofen und härten Sie das PDMS drei bis vier Stunden oder über Nacht bei 75 Grad Celsius aus.

Als nächstes nimmst du die Waffel aus dem Ofen und lässt sie auf Zimmertemperatur abkühlen. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge vorsichtig das Deckglas mit dem beigefügten PDMS vom Silikonwafer. Befestigen Sie nun eine Kunststoffkammer an das PDMS, wie zuvor für Glas beschrieben.

Nehmen Sie die Deckgläser mit der beigefügten Kammer und legen Sie sie in den Plasmareiniger mit Sauerstoff als Prozessgas. Reinigen Sie die Deckgläser mit Plasma. Bei dieser Arbeit wurde eine Minute lang eine Leistung von 30 % und ein Sauerstoffdruck von 0,3 Millibar verwendet.

Bereiten Sie nun in der Kammer einen SLB vor, wie zuvor auf Glas beschrieben. Um den Selbstorganisations-Assay durchzuführen, stellen Sie das Puffervolumen in der Kammer auf 200 Mikroliter Min-Puffer ein, abzüglich der Menge an Protein und ATP-Lösung. Fügen Sie dann MinD, mit MinD, MinE und falls gewünscht MinC hinzu und mischen Sie die Komponenten vorsichtig durch Pipettieren.

Fügen Sie nun 2,5 millimolares ATP hinzu, um die Selbstorganisation von MinDE zu starten. Überprüfen Sie in den nächsten 10 bis 30 Minuten mit einem Fluoreszenzmikroskop die regelmäßige MinDE-Musterbildung und die korrekt gebildeten Mikrostrukturen. Wenn sich regelmäßige MinDE-Muster gebildet haben, pipettieren Sie zweimal vorsichtig auf und ab, um die Komponenten zu mischen.

Entfernen Sie den großen Teil des Puffers mit einer 100-Mikroliter-Pipette und entfernen Sie dann vorsichtig den Rest mit einer 10-Mikroliter-Pipette. Um längere Bildgebungszeiten zu ermöglichen, stecken Sie ein angefeuchtetes Stück Schwamm in die Kammer. Achten Sie darauf, dass der Schwamm nicht mit der Oberfläche des Deckglases in Berührung kommt.

Verschließen Sie die Kammer sofort mit einem Deckel, um ein Austrocknen des Restpuffers in den Mikrostrukturen zu vermeiden. Bevor Sie die Mikrostrukturen abbilden, bestätigen Sie, dass die MinDE-Selbstorganisation auf der PDMS-Mikrostruktur gestoppt wird, während die Proteine in den Mikrokavitäten oszillieren. In diesem repräsentativen Video zeigt die zweifarbige Bildgebung, wie sich MinD und MinE selbst zu wandernden Oberflächenwellen organisieren, die spiralförmigen Mustern auf gestützten Lipiddoppelschichten entsprechen.

Hier zeigt die einfarbige Bildgebung, dass MinD und MinE Pol-zu-Pol-Oszillationen in PDMS-Mikrostrukturen ausführen. Die Oszillationen bilden einen zeitlich gemittelten MinD-Konzentrationsgradienten mit maximaler Konzentration an den Kompartimentpolen und minimaler Konzentration in der Mitte des Kompartiments. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Einzelpartikelverfolgung, durchgeführt werden, um die Kinetik der Membranbindung und die Verweilzeiten zu bestimmen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Piranha-Lösung äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie persönliche Schutzausrüstung getroffen werden sollten.