Name: Einsatz von hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu beurteilen, den Ursprung des myelodysplastischen Syndroms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Erfahren Sie die hämatopoetische Stammzelltransplantation zur Bewertung maligner Potenziale genetisch veränderter Blutzellen. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Analyse von Krebsstammzellen und die Identifizierung krankheitsauslösender Zellen bei myelodysplastischen Syndromen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch intramurale Research Program des National Cancer Institute, National Institutes of Health (Zuschuss Zahlen ZIA SC 010378 und v. 010983).

Die Tieren in diesem Artikel beschriebenen Verfahren wurde vom National Cancer Institute in Bethesda Animal Care und Use Committee genehmigt, und entsprechen den Richtlinien enthaltenen The Public Health Service Policy auf Humane Pflege und Verwendung von Labortieren, die Tierschutzgesetz und die Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
1. Zelle-Vorbereitung
<ol><li>Ernte des Knochenmarks kernhaltigen Zelle (BMNC)<ol>
<li>Verwenden Sie nur sterile Materialien. Sterilisieren Sie wiederverwendbare Instrumente mit einem Dampf-Autoklaven. Nadeln, Spritzen und Kunststoff-Ware in Einzelnutzung sterile Behälter zu kaufen. Führen Sie alle Tier- und Zelle Manipulationen in einer Klasse II, Typ A2 biologischen Sicherheitsschrank.</li>
		<li>BMNCs in 14 mL Runde Unterrohr mit 3 mL HF2 vorbereiten (Hank es ausgeglichen Salzlösung mit 2 % fötalen Rinderserum ergänzt).</li>
		<li>Einschläfern Sie C57Bl6 Spender Mäuse (positiv für CD45 Allel CD45.2), Alter in der Regel 2-6 Monate, mit einer CO2 Kammer.</li>
		<li>Sterilisieren Sie die Maus-Karkasse durch Besprühen 70 % igem Ethanol über den gesamten Körper mit einer Sprühflasche. Schälen Sie die Haut von den Beinen, vom Becken bis zum Knöchel.</li>
		<li>Entfernen Sie die Oberschenkelknochen und Tibiae vom Schlachtkörper mit sterilen Schere (gerade, scharf/scharf, 11,5 cm) und Zange (Graefe, gezahnt, Tipp 0,8 mm Breite). Schneiden Sie angehängte Muskeln deutlich.</li>
		<li>Die proximalen und distalen Enden des Schienbeins mit der Schere ausschneiden. Sie Tibia mit Zange halten, legen Sie eine 27-Gauge 3 mL Spritze mit 2,5 mL HF2 in den Hohlraum der tibiale Knochenmark am distalen Ende des Schienbeins (Knöchel). Spülen Sie die Knochenmarkzellen aus der Tibia mit leichtem Druck in die 14 mL Runde Unterrohr.<ol>
<li>Wiederholen Sie für die anderen Tibia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Durchschneiden Sie die proximalen und distalen Enden des Oberschenkelknochens mit einer Schere. Spülung der Femur Knochenmark Hohlraum durch eine 20-Gauge Nadel befestigt eine 3 mL Spritze mit 2,5 mL HF2 in das distale Ende des Femur Knochenmark Hohlraum und sanften Druck auf die Spritze.<ol>
<li>Wiederholen Sie für die anderen Femur, sammeln alle Knochenmark aus beide Tibiae und Oberschenkelknochen in der gleichen 14 mL Runde Unterrohr.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zerstreuen Sie die Knochenmark-Masse von oben und unten mehrmals mit der gleichen 20-Gauge-Nadel befestigt, die 3 mL Spritze absaugen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antikörper Färbung des BMNC<ol>
<li>Graf BMNC. 20 µL der BMNC Suspension in Schritt 1.1.8 generierten fügen Sie 20 µL einer 3 % igen Essigsäure Lösung hinzu. Dann zählen Sie mit einer Hemocytometer und einem inversen Mikroskop.</li>
		<li>Pellet-die BMNC durch sanfte Zentrifugation bei 450 X g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der Pellet mit HF2 mit 90 µL pro 107 Zellen und die Zellsuspension 10 µL biotinylierte Anti-Linie Antikörper cocktail hinzufügen.</li>
		<li>Nach Inkubation für 20 min bei 4 ° C, Waschen der gefärbten Zellen mit 3 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
		<li>Die BMNC mit 100 µL HF2 pro 107 Zellen aufzuwirbeln. Fügen Sie 2 µL Allophycocyanin (APC) Anti-Biotin Antikörper gegen die Zellsuspension, gefolgt von Inkubation bei 4 ° C für 20 min konjugiert.</li>
		<li>Spülen Sie den gefärbten BMNC mit 3 mL PBS und Aufschwemmen Sie der BMNC mit HF2 mit 0,2 µg/mL Propidium Jodid (PI) für Flow Cytometry Zellsortierung ergänzt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flow Cytometry Zelle Sortierung von BMNC<ol>
<li>Flow Cytometry Zelle Sorter zu kalibrieren. Optimieren Sie alle Photomultiplier Tubes (PMTs), Streuung und Fluoreszenz-Parameter mit ungefärbten Zellen und innerhalb des linearen Bereichs jedes Melders.</li>
		<li>Bereiten Sie ungefärbt, PI-gefärbten und APC Bezeichnung Linie cocktail Zellen parallel ab Schritt 1.2. Spektrale Schadensersatz zu analysieren.</li>
		<li>Diskriminieren Sie Wams Zellen durch sequentielle Anspritzung von FSC-H vs. SSC-H, 640-SSC-A vs. 640-SSC-H und 640-SSC-S vs. 640-SSC-W.</li>
		<li>Schließen Sie aus, lebensschwache Zellen mit PI aufgeregt auf 561 nm und Emission mit einem 614/20 Band-Pass-Filter gesammelt. Begeistern Sie Linie APC Zellen bei 640 nm und sammeln Emission mit einem 671/30 Bandfilter beschriftet.</li>
		<li>Nehmen Sie Fluoreszenz-Werte als Spannung Höhe auf und sammeln Sie mindestens 100.000 Veranstaltungen in Liste Modus Datendateien, die Bevölkerungen zu sortierende zu visualisieren.</li>
		<li>Spektrale Entschädigung nach der Übernahme von drei Proben von 10.000 Zellen für Folgendes zu berechnen: stumme Zellen, PI beschriftet Zellen und Antikörper Anti-Linie Cocktail konjugiert mit APC Zellen beschriftet.</li>
		<li>Legen Sie drei Regionen, Linie negativ (LN), Linie positiv (LP) mit dim Fluoreszenzintensität (LP1) und LP Bevölkerung mit hellen Fluoreszenz (LP2) in 5 mL Röhrchen mit 0,5 mL der 10 % FBS Medien zu sortieren.</li>
		<li>Art-Zellen mit einem Tropfen umhüllen und Abbruch-Modus zu reinigen.</li>
		<li>Führen Sie Post-Art-Analyse mit insgesamt 1.000 Zellen auf jede sortierte Probe, die Reinheit und die Lebensfähigkeit der sortierten Zellen zu bestätigen.</li>
		<li>Sammeln Sie sortierte Zellen durch Zentrifugation bei 450 X g für 5 min bei 4 ° C und aufzuwirbeln Sie Zelle Pellet mit 0,5 mL HF2.</li>
		<li>Bestätigen Sie mit Hemocytometer und Trypan blau sortierten Zelle. Anzahl von Zellen mit HF2 für Transplantationen anpassen. Hinweis: Ein breites Spektrum an BMNC Populationen kann für die Transplantation mit zusätzlichen Kombinationen von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern in Schritt 1.2.2 oben isoliert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Empfänger Mäuse Vorbereitung und hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT)
<ol><li>Vorbereitung der Transplantation Empfänger<ol>
<li>Veterinär- und Haltung Pflege Congenic Empfänger Mäuse (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in einen spezifischen Erreger (SPF) Tierhaltung zu erhalten.</li>
		<li>Für prophylaktische Dekontamination des Magen-Darm-Tracks bieten steriles Wasser mit 100 mg/L von Ciprofloxacin an die Empfänger für 7 Tage vor tödliche Dosis (9 Gy) Bestrahlung und pflegen für 14 Tage nach der Bestrahlung.</li>
		<li>Bieten Sie eine tödliche Dosis (9 Gy) Bestrahlung aus einer Cs-Quelle wie folgt. Verwenden Sie einen ausgebildeten und zertifizierte Cs-Operator. Legen Sie Cs Source Instrument, 70 cGy/min Ganzkörper-Gamma-Bestrahlung zu liefern. 10 Mäuse in eine speziell angefertigte Halterung und schieben Sie den Halter in die Kammer Brutapparat. 9 Gy-Ganzkörper-Bestrahlung in 13 min. zu liefern und die Mäuse in ihren Käfigen zurück.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transplantation von Hämatopoetischen Stammzellen<ol>
<li>Mischen Sie Wildtyp (WT) BMNC von einer Congenic Empfänger Maus (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in einer Zelle-Dosis von 2 x 105 Zellen pro Maus mit 2 bis 5 x 104 Zellen des gereinigten Tests erstellten BMNC mit Flow Cytometry Sortierung wie oben beschrieben in 1.3. Mischen Sie Zellen in derselben Spritze. Hinweis: Der WT-BMNC bieten eine Strahlung verschont-Wirkung auf der Empfänger Maus und für das Überleben der Empfänger Maus zu ermöglichen, wenn die Testzellen Hämatopoese nicht unterstützen. Die WT-BMNC verwendet in dieser Art von Experiment ausdrücklich das CD45.1 Allel und somit aus den Testzellen mit Antikörpern, die Unterscheidung zwischen CD45.1 und CD45.2 unterschieden werden. Die WT-BM-Zellen werden als "Helferzellen", "Strahlung-schonende Zellen" oder "Mitbewerber-Zellen" bezeichnet.</li>
		<li>Passen Sie das Zellvolumen Mischung zu 200 µL pro Empfänger mit sterilen HF2 zur Erleichterung der Injektion.</li>
		<li>Die Zelle-Mischungen, die letal bestrahlten Empfänger Mäuse über intravenöse Schweif Vene Injektion mit Hilfe einer 1 mL Spritze und 28-Gauge-Nadel, innerhalb von 24 Stunden nach der Bestrahlung zu verpflanzen. Platzieren Sie die Maus Rute unter einer Wärmelampe, wie Hitze führt zu Vene Dilatation Endstück. Hinweis: Einschläfern Sie die Empfänger Mäuse am Ende der Studie und bewerten Sie das Fortschreiten der Erkrankung durch Autopsie, Histologie und Durchflusszytometrie zu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Engraftment Assay mit Flow Cytometry
<ol><li>Um Spender Zelle Engraftment bewerten, sammeln Sie peripherem Blut (PB) von den Empfänger Mäusen am 6. Woche, 12. und 16. Woche nach der Transplantation.</li>
	<li>Wärmen Sie die Empfänger in den Käfig mit Wärmelampe für ca. 1 min und eine einschränkende setzen Sie Maus.</li>
	<li>Schneiden Sie die Rute Vene mit einem Skalpell (Klinge 10, #3 Skalpell Griff) und sammeln Sie PB 100 µL pro Empfänger mit einem Microcapillary Rohr mit EDTA als ein Antigerinnungsmittel zu.</li>
	<li>Teilen Sie die gesammelten PB in zwei gleiche Aliquote, indem man 50 µL in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch. Verwenden Sie einen aliquoten für eine automatisierte komplettes Blutbild (CBC) (durchgeführt im NCI Histopathologie Kern) und die zweite aliquoten für Antikörper Färbung und flow Cytometry.</li>
	<li>Um Spender Engraftment durch Durchflusszytometrie erkennen, lyse der Erythrozyten (RBC) durch Zugabe von 1 mL Hypotonische RBC Lyse Puffer (8,29 g/L NH4Cl, 1 g/L KHCO3, 0,037 g/L Na2EDTA, pH 7,2) zu 50 µL der gesammelten PB. Wirbel der Probe zu mischen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den lysierten PB bei 4.600 x g für 1,5 min. vorsichtig Aspirieren überstand und entsorgen.</li>
	<li>Stören Sie teilweise die Zelle Pellet durch sanft tippen oder "flicking" der Boden des Röhrchens. Fügen Sie 1,3 mL PBS in das Pellet in Rohr und Zentrifuge bei 4.600 x g für 1,5 min. sorgfältig Absaugen und entsorgen der Überstand entfernt.</li>
	<li>Stören Sie die Zelle Pellet durch Tippen oder streichen, und fügen Sie 200 µL HF2 ergänzt mit 5 % Ratte Serum zum Zelle Pellet.</li>
	<li>Fügen Sie Anti-CD45.2 Antikörper (1 µL) konjugiert mit Allophycocyanin (APC), die Zellsuspension hinzu. Bei 4 ° C für mindestens 30 min, kurz und Wirbel die Mischung inkubieren.</li>
	<li>Nach der Färbung der Zellen zweimal, wie oben beschrieben waschen und Aufschwemmen mit 400 µL HF2 ergänzt mit 1 µg/mL von PI.</li>
	<li>Mit einem 4-Farb-Durchflusszytometer Engraftment zu erkennen. Erhalten Sie weitere Informationen zu Arten von Zellen im peripheren Blut durch das Hinzufügen von zusätzlichen Antikörper, die bestimmte Zelltypen, wie B oder T-Lymphozyten erkennen.</li>
	<li>Notieren Sie serielle Engraftment Daten mithilfe einer Tabellenkalkulation zur weiteren Analyse der Daten zu ermöglichen.</li>
</ol>

<ol><li>Corey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+the+complexity+of+stem-cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).</li>
<li>Garcia-Manero, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+2015+Update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).</li>
<li>Heaney, M. L., Golde, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10341278">Myelodysplasia.</a> The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).</li>
<li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18467609">Myelodysplastic syndromes.</a> Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).</li>
<li>Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+features+of+myelodysplastic+syndromes%3A+results+from+regional+cancer+surveys+and+hospital-based+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics.</a> International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).</li>
<li>Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+genetic+pathways+and+cooperating+genetic+abnormalities+in+the+pathogenesis+of+therapy-related+myelodysplasia+and+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).</li>
<li>Uy, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+clonal+structure+of+MDS+and+AML+in+response+to+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy.</a> Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).</li>
<li>Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98+gene+fusions+and+hematopoietic+malignancies%3A+common+themes+and+new+biologic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights.</a> Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).</li>
<li>Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXD13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant%2C+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li>
<li>Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. <a target="_blank" href="https://jamanetwork.com/journals/jama/article-abstract/286455">Preleukemic acute human leukemia.</a> Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).</li>
<li>Thanopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+NOD%2FSCID-beta2+microglobulin+null+mice+with+multilineage+neoplastic+cells+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).</li>
<li>Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+distinct+clonal+MDS-derived+hematopoietic+precursors+in+NOD%2FSCID-beta2-microglobulin-deficient+mice+after+intramedullary+transplantation+of+hematopoietic+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells.</a> Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).</li>
<li>Benito, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID+mice+transplanted+with+marrow+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome+%28MDS%29+show+long-term+propagation+of+normal+but+not+clonal+human+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors.</a> Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).</li>
<li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li>
<li>Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+myelodysplastic+syndrome+by+a+long-term+repopulating+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+Distinct+Subsets+of+Lineage-Biased+Multipotent+Progenitors+Control+Blood+Production+in+Normal+and+Regenerative+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+hematopoietic+stem+cell+transplantation+improves+survival+but+is+not+curative+in+a+pre-clinical+model+of+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome.</a> PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu veröffentlichen.

Zwar MDS eine klonale hämatopoetische Stammzell-Störung, mdb "Stamm", oder initiierende Zellen wurden noch nicht charakterisiert. Wir zuvor nachweislich MDS transplantierbaren WT-Mäusen mit dem Knochenmark aus NHD13 Mäusen durch HSZT, gekennzeichnet durch macrocytic Anämie, Leukopenie, Neutropenie und morphologische Nachweis der Dysplasie15sein können. Darüber hinaus identifiziert wettbewerbsfähige Wiederbesiedlung Assays einen Vorteil Wachstum von Zellen aus dem Knochenmark NHD13 MDS. Zusammengen...

Myelodysplastischen Syndromen (MDS) repräsentieren eine vielfältige Reihe von klonalen Blutkrankheiten, gekennzeichnet durch ineffektive Hämatopoese, morphologische Nachweis der Dysplasie und einer Neigung für die Transformation auf akute myeloische Leukämie (AML)1,2 ,3,4. Ineffektive Hämatopoese ist anerkannt als eine Verhaftung Reifung im Knochenmark und Ergebnisse im peripheren Blut zytopenien trotz hyperzelluläres Knochenmark1,3. Die Inzidenz von MDS wurde verschiedentlich als 2-12 Fälle pro 100.000 Personen pro Jahr in den Vereinigten Staaten geschätzt, und die Inzidenz von MDS steigt mit dem Alter, so dass dies eine wichtige Voraussetzung, angesichts der alternden Bevölkerung US3zu verstehen, 5. Obwohl die meisten Fälle von MDS keine klare Ursache haben, sind einige Fälle von MDS vermutlich aufgrund der Exposition gegenüber bekannten genotoxischen Agenzien, einschließlich Lösungsmittel wie Benzol und Krebs-Chemotherapie-6.
MDS-Patienten haben in der Regel Mutationen in der MDS Zellen7erworben. Obwohl relativ selten, haben eine Reihe von MDS-Patienten ausgewogenere chromosomale Translokationen Gene z. B. EVI1, NUP98, RUNX1 und MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) erworben. Unser Labor hat ein langjähriges Interesse an Chromosom Translokationen, die NUP98 gen8beinhalten. Transgene Mäuse, express, ein NUP98-HOXD13 (NHD13)-Transgen geregelt durch den Projektträger Vav1 und Enhancer-Elemente zeigt alle Schlüsselfunktionen der MDS, einschließlich der peripheren Blut Leukopenie, morphologische Nachweis der Dysplasie und Transformation zu AML9 .
Obwohl MDS für mehr als 60 Jahren10anerkannt wurden und gelten als eine klonale Stammzell-Störung, wurden Bemühungen zur menschlichen MDS-Zelle in immungeschwächte Mäuse weiterhin weitgehend erfolglos, weil die MDS-Zellen schlecht11weiterhin, 12,13,14 und die Mäuse entwickeln keine klinischen Erkrankung. In einer Bemühung zu identifizieren, welche hämatopoetischen Zellen MDS übertragen können, wir wandte sich an das NHD13-Modell, und zeigte, dass wir MDS als Krankheit Einheit, die alle Merkmale der Kardinal menschlichen MDS weiterhin könnte, einschließlich der peripheren Blut zytopenien zeigten Dysplasie, und Transformation, AML15. In diesem Bericht stellen wir die technischen Details dieser Experimente sowie Ansätze für weitere fraktionieren Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen (HSPC), in einer Bemühung, MDS-initiierenden Zellen zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>14 mL Röhrchen mit rundem Boden</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Hank's ausgewogene Salzlösung</td><td>Lonza</td><td>10-527F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.2 Antikörper</td><td>Southern Biotech</td><td>1800-15</td><td>LOT# A077-T044O</td></tr><tr><td>3 mL Spritze</td><td>Monoject</td><td>8881513934</td><td></td></tr><tr><td>27-G-Nadel</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>20-G-Nadel</td><td>BD</td><td></td><td></td>305176</tr><tr><td>Lineage Cocktail</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-858</td><td>LOT# 5170418221</td></tr><tr><td>Anti-Biotin Antikörper</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-288</td><td>LOT# 5171109046</td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>Excelint</td><td>26027</td><td>Insulinspritze</td></tr><tr><td>Heizlampe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E70001901</td><td></td></tr><tr><td>FACS Gerät</td><td>Cytec</td><td>FACScan</td><td>2 Laser, 5 Farbdetektoren</td></tr><tr><td>FACS-Sortierinstrument</td><td>Beckman Coulter</td><td>MOFLO ASTRIOS</td><td>5 Laser, 23 Parameter, 6 Populationssortierung gleichzeitig</td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Gamma-Bestrahlung</td><td>Beste Theratronics</td><td>Gammacell 40</td><td></td></tr><tr><td>Blutentnahmeröhrchen</td><td>RAM scientific</td><td>76011</td><td></td></tr><tr><td>Empfänger Mäuse</td><td>Charles River</td><td>B6-LY5.1/Cr, CD45.1</td><td></td></tr><tr><td>NUP98-HOXD13 Mäuse</td><td>n/a</td><td>C57Bl/6, CD45.2</td><td>Kolonie im NIH gehalten</td></tr><tr><td>5 mL Rundbodenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr></tbody></table>

einsatz von hämatopoetischen stammzelltransplantation zu beurteilen, den ursprung des myelodysplastischen syndroms

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Myelodysplastischen Syndromen (MDS) sind eine heterogene Gruppe von Hämatopoetischen Stammzellen-Störungen, die durch ineffektive Hämatopoese, peripherem Blut Leukopenie, Dysplasie und eine Neigung für die Transformation zu akuter Leukämie definiert sind. NUP98-HOXD13 (NHD13) Transgene Mäuse rekapitulieren menschlichen MDS in Bezug auf die peripheren Blut Leukopenie, Dysplasie und Transformation zu akuter Leukämie. Wir zeigten bisher, dass MDS von gentechnisch hergestellten Maus mit MDS an Wildtyp Empfänger übertragen werden könnte, durch die Transplantation von MDS Knochenmark kernhaltigen Zellen (BMNC). Mehr die MDS-Zelle Herkunft klar zu verstehen, haben wir Konzepte für spezifische verpflanzen, immunophenotypisch definiert hämatopoetische Teilmengen. In diesem Artikel beschreiben wir den Prozess der Isolierung und Transplantation bestimmte Populationen von Hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen. Nach Transplantation beschreiben wir Ansätze zur Beurteilung der Effizienz der Transplantation und Persistenz der MDS Spenderzellen.

Wir zeigen repräsentative Zahlen für Ergebnisse mehrerer Experimente. Abbildung 1 zeigt eine repräsentative Durchflusszytometrie Sortierung Experiment. Während normaler Hämatopoetischer Differenzierung wie Zellen mit einer bestimmten hämatopoetischen Linie engagieren sie erwerben Linie definieren Zelle oberflächenmarker und das Potenzial für Selbsterneuerung zu verlieren. Daher ist in Wildtyp Mäusen, Stammzell-Selbsterneuerung auf Linie-Negative BMNC beschrän...

Wir beschreiben die Verwendung von hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Das maligne Potential der gentechnisch veränderten blutbildenden Zellen zu beurteilen. HSCT ist nützlich für die Bewertung der verschiedenen malignen hämatopoetischen Zellen in Vivo sowie die Generierung einer großen Kohorte von Mäusen mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) oder Leukämie um neue Therapien zu bewerten.

Einsatz von hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu beurteilen, den Ursprung des myelodysplastischen Syndroms

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Diese Methode kann helfen, einige Fragen in der Methode der Bösartigkeit Feld über die Charakterisierung einer Zelle, die eine Malignität initiieren zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine Grundlage für die funktionelle Analyse dieser Krebsstammzellen bietet. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf den Ort, an dem die Therapie von myelodysplastischen Syndromen oder MDS hilft, da sie bei der Identifizierung der Krankheit helfen kann, die Zellen ausihrittiert.Um die Empfänger auf den Adoptivtransfer vorzubereiten, stellen Sie eine Woche vor der Transplantation steriles Wasser zur Verfügung, das mit 100 Milligramm pro Liter Ciprofloxacin ergänzt wird, um den Empfänger ANIMALS für sieben Tage in einer bestimmten, pathogenfreien Tieranlage zu erhalten. Am siebten Tag haben sie einen geschulten, zertifizierten Cäsium-17-Operator eingestellt, der das Cäsium-Quellinstrument so eingestellt hat, dass 70 CentigrayS der gesamten Körpergamma-Bestrahlung pro Minute bereitgestellt werden. Platz 10 Mäuse in einem maßgeschneiderten Halter.Setzen Sie den Halter in die Bestrahlungskammer ein, liefern Sie 9 Graustufen gesamtkörperbestrahlung in 13 Minuten. Dann bringen Sie die Tiere in ihre Käfige zurück. Am nächsten Morgen sprühen Sie 70 Prozent Ethanol über ganze zwei bis sechs Motten alte C57 schwarze Sechsmaus und verwenden Sie eine Schere, um die Haut aus dem Becken zu den Knöcheln zu entfernen.Verwenden Sie Zangen mit der Schere, um die Femora und Tibiae zu entfernen. Schneiden Sie die Muskeln sauber von den Knochen. Schneiden Sie die proximalen und distalen Enden für die Tibiae und nehmen Sie eine Tibia mit Zange.Legen Sie eine Drei-Milliliter-Spritze mit einer 27-Gage-Nadel in die Knochenmarkhöhle ein und spülen Sie das Knochenmark in ein 14 Milliliter rundes Unterrohr mit 2,5 Millilitern Hanks gepufferter Salinelösung, ergänzt mit 2%fetalem Rinderserum oder HF2. Wenn das gesamte Mark gesammelt wurde, saugen Sie das Gewebe mehrmals durch die 20-Gage-Nadelspitze, um die Markmasse in eine einzige Suspension zum Zählen zu zerstreuen. Um die Knochenmarkkernzellen (BMNC) für die Durchflusssortierung zu kennzeichnen, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugalisierung und setzen Sie das Pellet um ein mal zehn bis siebtes BMNC pro 90 Mikroliter HF2-Konzentration wieder auf.Als nächstes fügen Sie zehn Mikroliter eines biotinylierten Anti-Lineage-Antikörpercocktails für eine 20-minütige Inkubation bei 4 Grad Celsius in die Zellsuspension. Gefolgt von einer Zentrifuge waschen in drei Milliliter PBS. Das Pellet in 100 Mikroliter HF2 pro zehn mal bis zur siebten Zelle aussetzen.Etikettieren Sie die Zellen sekundär mit zwei Mikrolitern konjugierten Antibiotin-Antikörpers. Nach 20 Minuets bei vier Grad Celsius, vor Licht geschützt, waschen Sie die Zellen in drei Milliliter nfrischem PBS. Das Pellet in HF2, ergänzt um 0,2 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumjodid auf Eis, wird wieder ausgesetzt.Kalibrieren Sie nun den Flow-Zytometrie-Zellsortierer mit ungefärbten Zellen, um alle Photomultiplier-Röhren, Streu- und Fluoreszenzparameter innerhalb des linearen Bereichs jedes Detektors zu optimieren. Erwerben Sie drei Proben von 10.000 Zellen für die nicht beschrifteten, PI-beschrifteten und Anti-Lineage-APC-markierten Zellen. Analysieren Sie am Ende der Sortierung 1 000 Zellen aus jeder Probe, um die Reinheit und Lebensfähigkeit der sortierten Zellen zu bestätigen.Drehen Sie die Proben in der Zentrifuge nach unten. Dann die Pellets in 0,5 Milliliter HF2 zum Zählen wieder aussetzen. Für die Adoptivübertragung der sortierten Zellen 100 Mikroliter des zweifachen bis fünften Wildtyp-BMNC von einem kongenen Empfängertier in sterilem HF2 mischen.Mit 100 Mikrolitern von zwei bis fünf Mal zehn bis vier interessierte sich der sortierte Spender BMNC für steriles HF2 in einem Mikrozentrifugenrohr pro Empfängertier. Laden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, ausgestattet mit einem 28-gage pro Empfänger mit 200 Mikroliter Zellen. Legen Sie dann die Empfängermäuse unter eine Wärmelampe, um eine Schwanzvenendilatation zu induzieren.Liefern Sie die Zellmischungen über die Schwanzvene an jedes tödlich bestrahlte Empfängertier. Da die Stammzell-Selbsterneuerung auf Linien negative Sendeart BMNC beschränkt ist, werden Liniennegativ, niedrige Abstammung positive und hohe Abstammung positive Zellen sortiert und in Wildtyp-Empfänger transplantiert, um die Selbsterneuerungskapazität jeder Zellpopulation zu bestimmen. Adoptiert transplantierte Spender transgenetische BMNC von MDS-Modelltieren kann ex vivo durch ihre CD45.2-Zell-Oberflächenmarker-Expression unterschieden werden.16 Wochen nach der Transplantation von leinennegativem BNMC oder unsortiertem BMNC von transgenen MDS-Spendertieren konkurrieren die transgenen Zellen mit den Wildtypzellen, wie ein zunehmender Prozentsatz von CD45.2-positiven Spenderzellen zeigt, die im peripheren Blut der tödlich bestrahlten Empfängertiere beobachtet werden. Hier werden Zellen aus einer leukämischen Transformation einer Maus gezeigt, die mit transgenen MDS-Zellen transplantiert wurde. Beachten Sie das Vorhandensein zahlreicher Explosionen und unreifer Formen.Beim Versuch des Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Zeit der Ex-vivo-Manipulation zu begrenzen, da es übermäßige Belastung der Zellen setzen kann, was zu Zelltod oder Funktionsverlust führt. Nach der Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für die Forscher im Feldprogramm, für die Anwendung von Malignität, um die Quelle der Krankheit bei gentechnisch veränderten Mäusen zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Dieses Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Einrichtung kompetitiver Knochenmarktransplantationsexperimente an Mäusen, um die Funktion hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen ohne vorherige Reinigung von Stammzellen durch Zellsortierung zu untersuchen.

Competitive Transplantationen Blutstammzell-Fitness zur Bewertung

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Erkennung von passives Spender erythroiden Vorläuferzellen nach hämatopoetische Stammzell-Transplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien

Nachweis von minimal oder messbare Resterkrankung (MRD) ist eine wichtige prognostische Biomarker für die Verfeinerung der Risikobewertung und Vorhersage von Rückfällen bei akuter myeloischer Leukämie (AML). Diese umfassende Leitlinien und Empfehlungen mit best Practices für konsistente und genaue Identifizierung und Nachweis von MRD, können helfen, effektive Entscheidungen für AML-Behandlung.

Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

Wir skizzieren ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck der Leukämie Stammzell-Marker auf primäre akute myeloische Leukämie-Zellen durch Durchflusszytometrie zu erkennen. Wir zeigen, wie Sie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate.

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Die MDS-Diagnose ist schwierig bei fehlender morphologischer Kriterien oder nicht-informativen Zytogenetik. MFC könnte dazu beitragen, den MDS diagnostischen Prozess zu verfeinern. Nützlich für die klinische Praxis zu werden, die MFC-Analyse muss auf Parametern beruhen mit ausreichender Spezifität und Sensitivität und Daten sollten zwischen verschiedenen Betreibern reproduzierbar sein.

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In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen aus murinen Modellen myelodysplastischer Syndrome und akuter myeloischer Leukämie vorgestellt. Mit dieser Technik werden Veränderungen in der nicht-hämatopoetischen Knochenmarknische, einschließlich der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, mit Fortschreiten der Erkrankung identifiziert.

Identifizierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen beim myelodysplastischen Syndrom und der akuten myeloischen Leukämie

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Intrafemorale Injektion von humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in immungeschwächte Mäuse 

Erfahren Sie die hämatopoetische Stammzelltransplantation zur Bewertung maligner Potenziale genetisch veränderter Blutzellen. Diese Methode ermöglicht die funktionelle Analyse von Krebsstammzellen und die Identifizierung krankheitsauslösender Zellen bei myelodysplastischen Syndromen.

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