Name: Luminophor Bildung in verschiedenen Konformationen von Rinderserumalbumin durch Bindung von Gold(III) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie, wie Au(III)-Bindung an BSA in Abhängigkeit vom pH-Wert rote Fluoreszenz induziert. Diese Methode identifiziert spezifische Bindungsstellen und konformationsabhängige Fluorophorbildung in Proteinen.

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S.E anerkennt die Unterstützung von Duke Stiftungsfonds besondere Initiative, Wells Fargo Fonds, PhRMA Stiftung sowie Startup-Fonds von der University of North Carolina, Charlotte.

(1) Synthese von BSA-Au(III) Komplex
<ol><li>25 mg der BSA in 1 mL Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Grade Wasser in einer 5 mL Reaktion Phiole zu lösen. Hinweis: Die Lösung sollte klar angezeigt werden.</li>
	<li>Gold (III) chlorid Trihydrate (chlorogoldsäure) zu einer Konzentration von 5 mM in HPLC Grade Wasser auflösen. Hinweis: Die Lösung sollte gelb angezeigt. Chloroauric Säure Lösung vorbereitet bei dieser Konzentration führt zu einem BSA in Au Verhältnis von 01:13.<ol>
<li>Alternativ bereiten Sie eine Lösung von chlorogoldsäure mit einer Konzentration von überall zwischen 0,38 mM (BSA:Au = 1:1) bis 20 mM (BSA:Au = 01:50) in HPLC Grad Wasser. Hinweis: Unterschiedliche Verhältnisse der BSA Gold drastisch unterschiedlich rote Fluoreszenz-Muster der Erregung-Emission Karte führt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Reaktion Phiole der BSA in einem 37 ° C Wasserbad legen und kräftig rühren bei 750 u/min mit einem Magnetrührer.</li>
	<li>Unmittelbar nach der Aufregung beginnt, fügen Sie 1 mL der chlorogoldsäure der Projektmappe hinzu. Die Farbe der Lösung sollte von klar bis gelb verwandeln.</li>
	<li>Rühren Sie die Mischung für 2 min bei 37 ° C und bei 750 u/min mit einem Magnetrührer.</li>
	<li>Fügen Sie in das Fläschchen Reaktion 100 μL 1 M NaOH Lösung bringen den pH-Wert auf 12 hinzu. Hinweis: Unmittelbar nach NaOH hinzugefügt wird, die Lösung sollte leicht zu einem gelb-braun zu verdunkeln und dann zurückdrehen bis gelb.</li>
	<li>Weiterhin rühren bei 750 u/min für 2 h und bei 37 ° C. Die Lösung sollte langsam von Gelb in eine dunkle gelb/braun Farbe ändern. Diese Farbveränderung zeigt die Bildung der roten fluoreszierenden BSA-Au(III) komplexe.</li>
	<li>Lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur für 2 Tage und die Lösung zu sitzen wird weiterhin ein Bernstein Braun verdunkeln und die Fluoreszenzintensität erhöht.<ol>
<li>Alternativ lassen Sie die Probe bei 37 ° C für 12 rühren mehr h wie die Farbe der Lösung zu einem braunen Bernstein entwickelt sich weiter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Synthese von BSA-Cu(II)-Au(III)
<ol><li>25 mg der BSA in 1 mL HPLC Grade Wasser auflösen. Die Lösung sollte klar erscheinen.</li>
	<li>Kupfer (II)-chlorid-Dihydrat in HPLC Grade Wasser zu einer Konzentration von 5 mM zu lösen. Die Lösung sollte Licht erscheinen blau.</li>
	<li>Eine Reaktion Ampulle 5 mL 1 mL der wässrigen BSA-Lösung hinzu und legen Sie in einem Wasserbad bei 37 ° C. Rühren Sie die Mischung bei 750 u/min.</li>
	<li>Sofort die Reaktion Phiole 0,5 mL Kupfer (II)-chlorid-Dihydrat-Lösung hinzu und mischen Sie 2 min. lang. Die Lösung bleibt Licht blau.</li>
	<li>Fügen Sie 75 μL 1 M NaOH bis pH 12 und 2 h zu mischen. Die Lösung wird lila werden.</li>
	<li>Lösen Sie chlorogoldsäure in HPLC Grade Wasser zu einer Konzentration von 5 mM auf.</li>
	<li>Die Reaktion Phiole 0,5 mL wässrige chlorogoldsäure hinzu und passen Sie den pH-Wert wieder auf 12 mit 1 M NaOH.</li>
	<li>Rühren Sie das Reaktionsgemisch für 2 h. Hinweis: Die Lösung sollte auf eine braune Farbe zu entwickeln.</li>
</ol>(3) Synthese von BSA-Ni(II)-Au(III)
<ol><li>25 mg der BSA in 1 mL HPLC Grade Wasser auflösen. Die Lösung sollte klar erscheinen.</li>
	<li>Nickel (II)-Chlorid-Hexahydrat in HPLC Grade Wasser zu einer Konzentration von 5 mM zu lösen. Die Lösung sollte Licht erscheinen grün.</li>
	<li>Eine Reaktion Ampulle 5 mL 1 mL der wässrigen BSA-Lösung hinzu und legen Sie in einem Wasserbad bei 37 oC. rühren die Mischung bei 750 u/min.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 mL der Nickel (II)-Chlorid-Hexahydrat-Lösung sofort die Reaktion Phiole und Mischung für 2 min hinzu. Hinweis: Die Lösung bleibt Licht grün.</li>
	<li>Fügen Sie 75 μL 1 M NaOH bis pH 12 und 2 h zu mischen. Hinweis: Die Lösung werden dunkelgelb.</li>
	<li>Lösen Sie chlorogoldsäure in HPLC Grade Wasser zu einer Konzentration von 5 mM auf.</li>
	<li>Die Reaktion Phiole 0,5 mL der wässrigen chlorogoldsäure hinzu und passen Sie den pH-Wert wieder auf 12.</li>
	<li>Rühren Sie das Reaktionsgemisch für 2 h. Hinweis: Die Lösung sollte auf eine braune Farbe zu entwickeln.</li>
</ol>4. Synthese von [Cys34-capped-BSA]-Au(III)
<ol><li>2 mg N-Ethylmaleimide (NEM) in 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) auflösen.</li>
	<li>2 mg der BSA in 1 mL PBS-NEM Lösung zu lösen.</li>
	<li>Die Lösung zu einem 5 mL Reaktion Fläschchen zu übertragen und bei 20 ° C bei 500 u/min für 1 h rühren.</li>
	<li>Dialyse der Lösung mit 12 kDa Dialyse Schläuche in 500 mL PBS, bei 50 u/min unter Rühren mit einem Magnetrührer über Nacht nicht umgesetztes NEM entfernen.</li>
	<li>Lösen Sie chlorogoldsäure mit PBS-Puffer zu einer Konzentration von 0,4 mM auf. Hinweis: Die Lösung wird ein schwaches gelb sein.</li>
	<li>Übertragung der Reaktion Fläschchen in einem Wasserbad bei 37 ° C. Bei 750 u/min rühren.</li>
	<li>Sofort die Reaktion Ampulle 1 mL Chloroauric Säure-Lösung hinzufügen und für 2 min mischen lassen.</li>
	<li>Das Fläschchen Reaktion den pH 12 und für 2 h mischen fügen Sie 75 μL 1 M NaOH hinzu.</li>
</ol>5. Synthese von [all-thiol-capped-BSA]-Au(III)
<ol><li>Bereiten Sie eine Lösung von 2 M Harnstoff und 50 mM Ammonium Bicarbonat (NH4HCO3, pH 8,0) in HPLC Grade Wasser.</li>
	<li>3,3 mg der BSA in 1 mL der obigen Lösung und Transfer zu einem 5 mL-Fläschchen Reaktion auflösen.</li>
	<li>Machen Sie eine Stammlösung von 0,25 M tris(2-carboxyethyl) Phosphin (DÄMMUND) durch DÄMMUND 62,5 mg in 1 mL HPLC Wasser auflösen.</li>
	<li>Die Reaktion Phiole fügen Sie der Stammlösung DÄMMUND bis die Endkonzentration von DÄMMUND 8 mM ist hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Lösung in einem Wasserbad für 1 h bei 50 ° c Rühren Sie bei 500 u/min mit einem Magnetrührer.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung vollständig auf Zimmertemperatur abkühlen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Stammlösung von 100 mM NEM durch NEM 12,5 mg in 1 mL HPLC Grade Wasser auflösen.</li>
	<li>Die Reaktion Phiole fügen Sie der Stammlösung von NEM bis die Endkonzentration von NEM 16 mM ist hinzu.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung verbinden für 2 h bei 20 ° C. Bei 500 u/min rühren.</li>
	<li>Dialyse die Lösung unter Verwendung eines 12 kDa Dialyse Schlauchs, rühren die Lösung bei 50 u/min mit einem Magnetrührer über Nacht in 500 mL 50 mM NH4HCO3 , überschüssige DÄMMUND, NEM und Harnstoff zu entfernen.</li>
	<li>Bewegen Sie die Reaktion Phiole in einem Wasserbad bei 37 ° C und bei 750 u/min rühren.</li>
	<li>Chlorogoldsäure in HPLC Grade Wasser zu einer Konzentration von 0,66 mM auflösen.</li>
	<li>Sofort die Reaktion Ampulle 1 mL Chloroauric Säure-Lösung hinzufügen und für 2 min mischen lassen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 M NaOH bis pH der Lösung 12 und lassen Sie die Lösung weiterhin für 2 h mischen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die BSA-Au(III) Verbindungen vorbereitet bei pH 12 weisen rote Fluoreszenz bei einer Emissionswellenlänge λEm= 640 nm bei Erregung mit ultravioletten (UV) Licht λex= 365 nm (Abbildung 1A). Die Entstehung der rote Fluoreszenz ist ein langsamer Prozess und dauert ein paar Tage bei Raumtemperatur bis zu einer maximalen Intensität zu erhöhen. Läuft die Reaktion bei 37 ° C wird die optimale Ergebnisse liefern, obwohl höherer Temperatur verwendet werden kann, um die ...

Eine BSA-Au-Verbindung Ausstellen einer Ultraviolett (UV)-leicht erregbaren rote Fluoreszenz, mit bemerkenswerten schürt Verschiebung, wurde ursprünglich von Xie Et al.synthetisiert worden. 1. einzigartige und stabile rote Fluoreszenz finden Sie verschiedene Anwendungen in den Bereichen Fernerkundung,2,3,4, bildgebenden5,6,7oder Nanomedizin8 ,9,10,11,12,13. Diese Verbindung wurde von vielen Forschern auf dem Gebiet der Nano-Wissenschaft in den letzten Jahren14,15,16ausgiebig untersucht. Die BSA-Au-Verbindung wurde als Au25 nanocluster interpretiert. Das Ziel der vorgestellten Methode ist, diese Verbindung im Detail zu untersuchen und zu verstehen, die Herkunft der rote Fluoreszenz. Den vorgestellten Ansatz folgend können das Vorhandensein von mehreren Au Bindungsstellen, und die Herkunft der Fluoreszenz, Alternative zu einem Standort Nukleation von Au25 nanocluster dargestellt werden. Der gleiche Ansatz kann eingesetzt werden, zu studieren, wie andere Proteine17,18,19 komplexiert mit Au(III) ihren fluoreszierenden Eigenschaften ändern können.
Die Synthese der BSA-Au rot fluoreszierende Verbindung erfordert eine enge Kontrolle über das molare Verhältnis von BSA, Au (BSA:Au), die Intensität der Fluoreszenz und die Lage der Gipfel der Erregung-Emission Karte (EEM)20zu maximieren. Es kann gezeigt werden, dass mehrere Bindungsstellen für Au(III) zu binden, gibt es einschließlich der Asparagin-Fragment (oder Asp-Fragment, die ersten vier Aminosäurereste am N-Terminus des BSA)21,22. Die 34th Aminosäure der BSA (Cys-34) zeigt sich auch, Au(III) zu koordinieren und in den Mechanismus der roten fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))20einbezogen werden. Auf alle Cys-Cys-Disulfid-Bindungen zu Spalten und verschließen alle Thiole, rote Fluoreszenz ist nicht produziert ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Dies weist auf die Notwendigkeit der Cys-Cys Disulfid Anleihen als die Au(III)-Bindungsstelle, die rote Fluoreszenz zu produzieren.
Protein-Chemie-Techniken haben nicht weit verbreitet, um die BSA-Au(III)-komplexe in der Nano-Science-Community zu studieren. Allerdings wäre es wertvoll, um diese Techniken zu verstehen, bestimmte Aspekte dieser komplexe, Detailwissen über die Au(III)-Bindungsstellen im BSA zu gewinnen. Dieser Artikel soll einige dieser Techniken zu zeigen.

<table><tbody><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA), 96 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5611</td><td></td></tr><tr><td>Gold (III)-chlorid-Trihydrat, 99,9 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer (II)-chlorid-Dihydrat, 99,999 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>459097</td><td></td></tr><tr><td>Nickel (II)-chlorid-Hexahydrat, 99,9 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>654507</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimid (NEM), >99,0 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP), >98,0 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid, >98,0 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff, 99,5 %</td> <td>Chem-Implex Int'l</td><td>30142</td><td></td></tr><tr><td>Phospat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Corning</td><td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat, 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr></tbody></table>

luminophor bildung in verschiedenen konformationen von rinderserumalbumin durch bindung von gold(iii)

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

Die vorgestellten Protokolle soll den Prozess der Au(III) Bindung an die BSA, nachgiebig Konformation bedingte rote Fluoreszenz (λEm = 640 nm) der BSA-Au(III)-komplexe. Die Methode stellt den pH-Wert zu zeigen, dass die Entstehung der rote Fluoreszenz mit der pH-induzierte Gleichgewicht Übergänge von der BSA Konformationen korreliert ist. Rot fluoreszierende BSA-Au(III)-komplexe können nur mit einer Einstellung des pH-Wertes bei oder über 9,7, das entspricht der "A-Form" Konformation der BSA gebildet werden. Das Protokoll die BSA, Au Molverhältnis anpassen und den zeitlichen Verlauf des Prozesses der Au(III) Bindung zu überwachen ist beschrieben. Die minimale Anzahl von Au(III) pro BSA, der rote Fluoreszenz zu produzieren ist weniger als sieben. Wir beschreiben das Protokoll in Schritten, um das Vorhandensein von mehreren Au(III)-Bindungsstellen im BSA zu veranschaulichen. Erstens, durch Zugabe von Kupfer (Cu(II)) oder Nickel (Ni(II)) kationen gefolgt von Au(III), zeigt diese Methode eine Bindungsstelle für Au(III), die nicht das rote Fluorophor. Zweitens wird durch BSA von Thiol Deckelung Agenten ändern, ein anderes Nonfluorophore bilden Au(III) Bindungsstelle aufgedeckt. Drittens sind ändern die BSA-Konformation durch Spaltung und Begrenzung der Disulfid-Bindungen, die mögliche Au(III) Bindung Webseite(n) illustriert. Das Protokoll beschrieben, zur Steuerung der BSA Konformationen und Au(III) Bindung, kann in der Regel angewendet werden, um die Wechselwirkungen von anderen Proteinen und Metallkationen zu studieren.

Aus der Fluoreszenz des BSA-Au(III) komplexes, es wurde beobachtet, dass die Umwandlung der inneren blauen Fluoreszenz der BSA (λEm = 400 nm), rote Fluoreszenz (λEm = 640 nm) tritt bei etwa pH 9,7 durch ein Gleichgewicht Übergang (Abbildung 1). EEM BSA-Au(III) bei verschiedenen BSA Au molare Verhältnis ist in Abbildung 2dargestellt, und diese Daten zeigt, wie die gleichen Emissionswellenlän...

Die Protokolle für das Studium der Bindung von gold-Kationen (Au(III)) zu verschiedenen Konformationen der Rinderserumalbumin (BSA) wie auch für die Charakterisierung der Konformationsänderungen abhängigen einzigartige BSA-Au Fluoreszenz dargestellt werden.

Luminophor Bildung in verschiedenen Konformationen von Rinderserumalbumin durch Bindung von Gold(III)

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Nanowissenschaften zu beantworten, wie z. B. die Bildung von Fluorophoren und mittlere Proteinkomplexe. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hilft, spezifische Metallbindungsstellen und Proteine darzustellen. Zuerst werden 25 Milligramm BSA in einem Milliliter Wasser in HPLC-Qualität in einem Fünf-Milliliter-Reaktionsfläschchen gelöst, das einen magnetischen Rührstab enthält.Bereiten Sie als Nächstes eine fünf Millimolare Lösung aus Chloraurinsäure und Wasser in HPLC-Qualität vor. Stellen Sie das Reaktionsgefäß mit der BSA-Lösung in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad und rühren Sie mit einem Magnetrührer bei 750 U/min. Unmittelbar nach Beginn des Rührens geben Sie einen Milliliter der Chloraurinsäurelösung in die BSA-Lösung.Nachdem Sie zwei Minuten lang gerührt haben, fügen Sie der Lösung 100 Mikroliter eines molaren Natriumhydroxids hinzu, um den PH-Wert auf 12 zu bringen. Lösen Sie 25 Milligramm BSA in einem Milliliter Wasser in HPLC-Qualität in einem Reaktionsgefäß auf. Bereiten Sie als Nächstes eine fünf Millimolare Lösung von Kupferchlorid-Dihydrat in Wasser in HPLC-Qualität vor.Geben Sie einen Milliliter der BSA-Lösung in ein Fünf-Milliliter-Reaktionsfläschchen mit einem magnetischen Rührstab und stellen Sie es in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Rühren Sie die Lösung bei 750 U/min. Geben Sie sofort 0,5 Milliliter der Kupferchlorid-Dihydratlösung in das Reaktionsgefäß.Nachdem Sie zwei Minuten lang gerührt haben, fügen Sie der Lösung 75 Mikroliter eines molaren Natriumhydroxids hinzu, um den PH-Wert auf 12 zu bringen, und rühren Sie zwei Stunden lang. Bereiten Sie anschließend eine fünf Millimolare Lösung von Chloraurinsäure in Wasser in HPLC-Qualität vor. Geben Sie 0,5 Milliliter der Chloraursäurelösung in das Reaktionsgefäß.Stellen Sie dann den pH-Wert mit einem molaren Natriumhydroxid auf 12 ein und rühren Sie die Lösung zwei Stunden lang um. Geben Sie einen Milliliter BSA-Lösung in ein Fünf-Milliliter-Reaktionsfläschchen mit einem magnetischen Rührstab und stellen Sie es in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Rühren Sie die Lösung bei 750 U/min.Sofort werden 0,5 Milliliter einer zuvor hergestellten fünf Millimolar Nickelchlorid-Hexahydratlösung in das Reaktionsgefäß gegeben. Nach zweiminütigem Rühren 75 Mikroliter eines molaren Natriumhydroxids hinzufügen, um den PH-Wert auf 12 zu bringen, und zwei Stunden lang rühren. 0,5 Milliliter Chloraurinsäurelösung mit fünf Millimolen in das Reaktionsgefäß geben.Stellen Sie dann den PH-Wert mit einem molaren Natriumhydroxid auf 12 ein und rühren Sie das Reaktionsgemisch zwei Stunden lang um. Lösen Sie zwei Milligramm N-Ethylmaleimid in einem Milliliter PBS auf. Lösen Sie dann zwei Milligramm BSA in einem Milliliter der Maleimidlösung auf.Die Lösung wird in ein Fünf-Milliliter-Reaktionsgefäß mit einem magnetischen Rührstab umgefüllt und eine Stunde lang bei 20 Grad Celsius und 500 U/min gerührt. Nach einer Stunde dialysieren Sie die Lösung mit einem 12-Kilodalton-Dialyseschlauch in 500 Millilitern PBS. Über Nacht bei 50 U/min mit einem Magnetrührer rühren, um nicht umgesetztes und Ethylmaleimid zu entfernen.Am nächsten Tag wird das Reaktionsgefäß mit der Maleimidlösung in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius überführt und bei 750 U/min gerührt. Sofort wird eine zuvor vorbereitete 0,4 millimolare Chloraurinsäurelösung in das Reaktionsgefäß gegeben. Nachdem Sie zwei Minuten lang gerührt haben, fügen Sie der Lösung 75 Mikroliter eines molaren Natriumhydroxids hinzu, um den PH-Wert auf 12 zu bringen, und rühren Sie zwei Stunden lang.Bereiten Sie eine Lösung aus zwei molaren Harnstoff und 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat in Wasser in HPLC-Qualität vor. Lösen Sie dann 3,3 Milligramm BSA in einem Milliliter der Harnstofflösung auf und geben Sie es in ein Fünf-Milliliter-Reaktionsfläschchen, das einen magnetischen Rührstab enthält. Als nächstes bereiten Sie eine Stammlösung von 0,25 molaren TCEP her, indem Sie 62,5 Milligramm TCEP und einen Milliliter Wasser in HPLC-Qualität auflösen.Die Stammlösung wird in das Reaktionsgefäß gegeben, bis die Endkonzentration von TCEP acht Millimolar beträgt. Dann die Lösung eine Stunde lang in einem Wasserbad bei 50 Grad Celsius unter Rühren bei 500 U/min inkubieren. In der Zwischenzeit bereiten Sie eine 100 nanomolare Stammlösung von N-Ethylmaleimid vor, indem Sie 12,5 Milligramm N-Ethylmaleimid in einem Milliliter Wasser in HPLC-Qualität auflösen.Die Stammlösung in das abgekühlte Reaktionsgefäß geben, bis die Endkonzentration von N-Ethylmaleimid 16 Millimolar beträgt. Dann bei 20 Grad Celsius und 500 U/min zwei Stunden lang rühren. Dialysieren Sie die Lösung mit einem Dialyseschlauch von 12 Kelodalton in 500 Millilitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat und rühren Sie über Nacht bei 50 U/min mit einem Magnetrührer um, um überschüssige Reagenzien zu entfernen.Am nächsten Tag das Reaktionsgefäß in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius überführen und bei 750 U/min umrühren. Sofort wird ein Milliliter der zuvor hergestellten 0,66 millimolaren Chloraurinsäurelösung in das Reaktionsgefäß gegeben. Nachdem Sie zwei Minuten lang gerührt haben, fügen Sie der Lösung ein molares Natriumhydroxid hinzu, bis der pH-Wert 12 beträgt, und rühren Sie zwei Stunden lang.Aus der Fluoreszenz des BSA-Gold-Drei-Komplexes wurde beobachtet, dass die Umwandlung der intrinsischen blauen Fluoreszenz von BSA in die rote Fluoreszenz bei etwa PH 9,7 durch einen Gleichgewichtsübergang erfolgt. Anregungs-Emissions-Karten von BSA Gold drei bei unterschiedlichen molaren Verhältnissen von BSA zu Gold zeigen, wie die Änderung der molaren Verhältnisse die gleiche Emissionswellenlänge bei unterschiedlichen Anregungswellenlängen ergibt. Kupfer, Nickel und Gold binden kompetitiv an eine bekannte Fundstelle in BSA.Die mit Cystein 34 verkappte BSA zeigt eine Veränderung der Peakmuster der Anregungs-Emissions-Karte bei der Goldbindung und diese Ergebnisse zeigen, wie die Veränderung spezifischer Bindungsstellen die Fluoreszenzmuster verändert. Das all-thiol-capped-BSA zeigt keine rote Fluoreszenz und zeigt Cystein-Cystein-Disulfid-Bindungen als mögliche Bindungsstellen zur Herstellung des roten Fluorophors. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den PH-Wert wie beschrieben einzustellen oder den richtigen Puffer zu verwenden, da die Fluorophorbildung von der PH-induzierten Änderung der Proteinbestätigungen abhängt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

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