Eine proximale Kultur-Methode zu studieren, Parakrine Signale zwischen Zellen

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der interzellulären Kommunikation über reziproke parakrine versus juxtacrine Wechselwirkungen zwischen zwei Zelltypen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass es sich um eine sehr einfache und reproduzierbare Technik handelt, die die parakrine Signalgebung unter typischen Kulturbedingungen genau erfasst und gleichzeitig eine effektive juxtacrine Signalgebung verhindert. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf ein besseres Verständnis des Mechanismus der Wechselwirkung zwischen den Krebszellen und der Tumormikroumgebung.

Diese Methode kann zwar Aufschluss über die Wechselwirkungen zwischen den Krebszellen und dem Tumorstroma geben, kann aber auch auf andere Systeme wie die Wundheilung und die Angiogenese angewendet werden. Beginnen Sie damit, die Eierstockkrebszellen aus einer 80%igen konfluenten Mischung mit einem Milliliter 0,25%Trypsin für 40 bis 60 Sekunden zu lösen, gefolgt von der Neutralisierung der Reaktion mit sechs Millilitern vollständigem Wachstumsmedium. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern frischem vollständigem Wachstumsmedium.

Nach der Zählung verdünnen Sie die Zellen auf 100.000 Eierstockkrebszellen pro Milliliter vollständiger Wachstumsmediumkonzentration und legen Sie drei invertierte 0,4 Mikrometer Poren-Gewebekultur-behandelte Polycarbonat-Membran-Zellkultureinsätze pro Versuchsbedingung in eine sterile Gewebekulturschale geeigneter Größe. Beschriften Sie die Einsätze entsprechend der Versuchsbedingung und pipettieren Sie die Krebszellen vorsichtig in konzentrischen Kreisen auf die Unterseite jedes Einsatzes, beginnend in der Mitte der Membran und nach außen, um eine 800-Mikroliter-Kuppel zu bilden. Seien Sie äußerst vorsichtig, wenn Sie die Zellen auf die Unterseite des Einsatzes säen, damit die Kuppel des Mediums, das die Zellen enthält, während der Inkubation nicht von den Rändern des Einsatzes abläuft.

Wenn alle Einsätze ausgesät sind, decken Sie die Schale ab und legen Sie die Einsätze vorsichtig in den Zellkultur-Inkubator. Nach etwa vier Stunden lösen Sie das HPMC mit zwei Millilitern 0,25 % Trypsin für ein bis zwei Minuten, gefolgt von einer Neutralisation der Reaktion mit 12 Millilitern vollständigem Wachstumsmedium. Sammeln Sie das HPMC durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern vollständigem Wachstumsmedium zum Zählen.

Verdünnen Sie die Zellen auf 300.000 HPMC pro Milliliter vollständiges Wachstumsmedium und geben Sie 2,5 Milliliter frisches vollständiges Wachstumsmedium in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Kulturplatte. Platzieren Sie jeden Einsatz mit einer sterilen Pinzette mit der rechten Seite nach oben in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte, so dass die an den unteren Eierstockkrebszellen befestigten Oberflächen in das Medium eintauchen. Säen Sie dann 1,5 Milliliter HPMC in die Vertiefung jedes Einsatzes.

Legen Sie die Platte dann für 72 Stunden in den Zellkultur-Inkubator. Entfernen Sie am Ende der Inkubation vorsichtig die Einsätze aus jeder Vertiefung und spülen Sie beide Seiten der Einsätze mit PBS aus. Legen Sie jeden Einsatz in eine neue Sechs-Well-Platte und geben Sie 0,5 Milliliter Trypsin in die Einsatzvertiefungen und zwei Milliliter Trypsin in die unteren Wells.

Geben Sie nach zwei Minuten bei 37 Grad Celsius einen Milliliter vollständiges Wachstumsmedium in jeden Einsatz und pipettieren Sie die Lösung vorsichtig einige Male, ohne die Membran zu zerreißen oder die Zellsuspension in die darunter liegende Vertiefung zu verschütten. Beim Pipettieren sollte darauf geachtet werden, dass die Zellen aus einer Kammer mit den anderen nicht kontaminiert werden. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein markiertes Sammelröhrchen und neutralisieren Sie das Trypsin mit weiteren zwei Millilitern vollständigem Wachstumsmedium.

Um die Zellen am Boden der Einsätze zu sammeln, spülen Sie die Böden der Membranen zwei- bis dreimal mit den zwei Millilitern Trypsin aus der entsprechenden Vertiefung der Sechs-Well-Platte, so dass die abgelösten Zellen in den entsprechenden Vertiefungsböden aufgefangen werden. Wenn alle Zellen abgelöst wurden, neutralisieren Sie das Trypsin in jeder Vertiefung mit sechs Millilitern frischem Wachstumsmedium und überführen Sie die Zellsuspensionen in markierte Sammelröhrchen. Sammeln Sie dann alle Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in 0,7 Millilitern Phenol- und Guanidinthiocyanat-basiertem Lysereagenz pro Röhrchen für die RNA-Extraktion und Isolierung gemäß den Standardprotokollen.

Die proximale Kultur von HPMC mit Eierstockkrebszellen führt zu einer erhöhten Expression von Fibronektin und Transforming Growth Factor oder TGF beta One im Vergleich zu Kontroll-HPMC, das in Abwesenheit von Krebszellen auf Inserts ausgesät wird. Die Expression von Fibronektin und TGF beta 1 steigt auch in Eierstockkrebszellen nach proximaler Kultur mit HPMCs im Vergleich zu Kontroll-Eierstockzellen an, die in Abwesenheit von HPMC kultiviert wurden. Umgekehrt zeigen Eierstockkrebszellen, die mit HPMC-konditioniertem Medium behandelt wurden, eine signifikant reduzierte Fibronektinexpression ohne Veränderung der TGF-beta-1-Expression.

Die Blockierung von TGF beta one mit einem neutralisierenden Antikörper führt jedoch zu einer signifikanten Abnahme der TGF beta 1-Expression in Eierstockkrebszellen in proximalen Kulturen mit HPMCs. Interessanterweise wird ein leichter Anstieg der TGF beta 1-Expression in Kontroll-nicht-proximal kultivierten Ovarialkarzinomzellen beobachtet, wahrscheinlich als kompensatorische Reaktion. Proximale Kultur mit Eierstockkrebszellen erhöht leicht die E-Cadherin-Expression in HPMCs, während eine deutliche Abnahme von E-Cadherin in Eierstockkrebszellen beobachtet wird, die in der Nähe von HPMCs im Vergleich zu Kontrollen gezüchtet wurden, was die Wirksamkeit des proximalen Kultursystems zur Untersuchung der parakrinen Signalübertragung zwischen Eierstockkrebszellen und normalen Zellen an der Stelle der Metastasierung weiter demonstriert.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Anzahl der ausgesäten Zellen und die Dauer der proximalen Kultur zu optimieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Immunblotting durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Veränderungen der Proteinexpression und der Aktivierung von nachgeschalteten Prozessionssignalwegen während der Co-Kultur der Mesothelzellen der Tumorzellen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Tumormikroumgebung, Immunologie und Entwicklungsbiologie, um reziproke parakrine Wechselwirkungen zwischen Zellen durch sezernierte Faktoren zu erforschen.