Azelluläre und zellulären Lunge Modell Tumor Metastasen zu studieren
19. August 2018
Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine ex Vivo Lunge Krebs Modell, die imitiert die Schritte der Tumorprogression und hilft, um einen Primärtumor zu isolieren, zirkulierende Tumorzellen und metastatischen Läsionen.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Zusammenhang mit der Tumorprogression zu beantworten. Das ex vivo azelluläre und zelluläre Lungenmodell ermöglicht die Bildung von Primärtumoren, die im Laufe der Zeit wachsen und zirkulierende Tumorzellen und metastasierende Läsionen bilden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung des Fortschreitens der Krebserkrankung in verkürzter Zeit und des Wachstums verschiedener Arten von Krebszellen ermöglicht.
Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf unsere personalisierte Therapie, da Tumorzellen von Patienten im Modell verwendet werden können, um die Wirksamkeit von therapeutischen Medikamenten, einschließlich Immunzellen, zu bewerten. Beginnen Sie mit einer tief betäubten Ratte. Rasieren Sie Brust und Bauch und wischen Sie die Haut mit einem Chlorhexidin-Tupfer ab.
Nach dem Öffnen der Brusthöhle führen Sie eine bilaterale Thorakotomie durch, indem Sie die vordere Seite des Brustkorbs links in die rechte Seite des Zwerchfells schneiden. Halten Sie den Brustkorb hoch und injizieren Sie mit einer 27-Gauge-Nadel zwei Milliliter Heparin zu 1000 Einheiten pro Milliliter in den rechten Ventrikel des schlagenden Herzens, um die Bildung von Blutgerinnseln in der Lunge zu verhindern. Nachdem Sie den Brustkorb entfernt haben, platzieren Sie eine 18-Gauge-Nadel in den linken Ventrikel als Entlüftung, um Blut abfließen zu lassen, und injizieren Sie dann mit einer 25-Gauge-Nadel 15 Milliliter 12,5 Einheiten pro Milliliter heparinisiertes PBS in den rechten Ventrikel.
Als nächstes schneiden Sie die Luftröhre an der Basis der Schilddrüse und entfernen vorsichtig die absteigende Aorta auf Höhe der Vene hemiazygos und die Äste der Aorta am Bogen. Nachdem Sie den Herz-Lungen-Block aus der Brusthöhle entfernt haben, schneiden Sie die Hälfte des rechten und linken Ventrikels ab und führen Sie dann eine maßgefertigte 18-Gauge-Nadelkanüle aus Edelstahl durch den rechten Ventrikel in die Lungenhauptarterie ein. Befestigen Sie die Kanüle mit dem 2-0 Seidenband und legen Sie vorsichtig die rechte Herzkammer und den Vorhof frei.
Beginnen Sie damit, heparinisiertes PBS bei einem physiologischen Perfusionsdruck von 30 Millimeter Quecksilber laufen zu lassen, bis es frei in die Flasche der Dezellularisierungseinheit fließt, und befestigen Sie dann den Herz-Lungen-Block an der Dezellularisierungseinheit am Ende der Lungenarterie durch die Lungenarterienkanüle. Ersetzen Sie nach 15-minütigem Waschen mit heparinisiertem PBS die heparinisierte PBS-Flasche durch eine Flasche mit 0,15 % Natriumdodecylsulfat und deionisiertem Wasser und perfundieren Sie die Lunge zwei Stunden lang zur Dezellularisierung. Nach der Dezellularisierung perfundieren Sie 15 Minuten lang deionisiertes autoklaviertes Wasser durch das Lungengerüst, gefolgt von 1 % nichtionischem Detergens in deionisiertem Wasser für 10 Minuten.
Ersetzen Sie schließlich die Flasche durch 500 Milliliter autoklaviertes PBS, das mit Antibiotika ergänzt wird. Lassen Sie die Pumpe mit sechs Millilitern pro Minute laufen und perfundieren Sie die Lunge 72 Stunden lang, danach ist die azelluläre Lunge sofort einsatzbereit. Sprühen Sie 70 % Ethanol auf die Pumpenpatrone und richten Sie den Oxygenator ein, indem Sie das Auslassende des Oxygenators mit dem Pumprohr und das andere Ende mit einem 1,5-Fuß-Rohr im Bioreaktor verbinden.
Stellen Sie die Bioreaktorflasche unter aseptischen Bedingungen in einer Biosicherheitswerkbank auf. Befestigen Sie einen Drei-Wege-Absperrhahn am Kopf einer weiblichen Luer-Lock, um den Fluss durch die Lungenarterie zu kontrollieren, und verbinden Sie dann einen Einweg-Absperrhahn mit einer anderen weiblichen Luer-Lock-Trennwand, um die Zellen durch die Luftröhre zu bepflanzen. Verbinden Sie einen Zwei-Zoll-Schlauch an der Außenseite und einen 6-Zoll-Schlauch an der Innenseite der Flasche, um das Medium zu zirkulieren.
Bereiten Sie den Schlauch vor, um die Bioreaktorflasche mit dem Oxygenator zu verbinden. Montieren Sie einen männlichen Luer-Lock an einem Zwei-Fuß-Schlauch und befestigen Sie eine weibliche Luer-Öse Typ T, um die Zugänglichkeit zu gewährleisten, und befestigen Sie einen männlichen Luer-Lock und einen weiblichen Luer-Lock an zwei Fußschläuchen. Geben Sie Zellkulturmedium hinzu und überführen Sie den Bioreaktor in den Inkubator.
Verbinden Sie das Oxygenatorrohr mit den beiden offenen Enden, um es zu einem Bioreaktor mit geschlossenem Kreislauf zu machen. Lassen Sie die Pumpe mit sechs Millilitern pro Minute vorlaufen, um den Oxygenator und die Schläuche mit Nährmedium zu füllen, damit keine Luftblasen in den Schläuchen vorhanden sind. Sobald die Röhrchen mit Medium gefüllt sind, schließen Sie den Absperrhahn und trennen Sie die Oxygenatoren von beiden Enden der Bioreaktorflasche.
Legen Sie die Bioreaktorflasche in die Biosicherheitswerkbank, führen Sie das Nährmedium durch den Absperrhahn und befestigen Sie die Lungenkanüle des Lungengerüsts. Wenn Sie mit dem zellulären Lungenmodell arbeiten, überspringen Sie die Dezellularisierung. Die entnommene Lunge kann dyadisch im Bioreaktor fixiert werden.
Führen Sie das Kulturmedium erneut durch den Einweg-Absperrhahn, um jegliche Luft zu entfernen, binden Sie die Trachealkanüle mit einem Seidenfaden an die Luftröhre und schließen Sie dann den Verschluss der Bioreaktorflasche. Bringen Sie den Bioreaktor in den Inkubator und starten Sie die Pumpe. Lassen Sie das Kulturmedium 10 bis 15 Minuten lang laufen, um sicherzustellen, dass alle Lappen aufgebläht werden und die Lunge in gutem Zustand aussieht.
Modifizieren Sie das azelluläre oder zelluläre Lungengerüst wie folgt für das metastasierende Modell. Öffnen Sie die Bioreaktorkappe mit dem hängenden Lungengerüst und führen Sie mit einer Luer-Lock-Spritze fünf Milliliter Kulturmedium durch die Luftröhre. Führen Sie mit einer Winkelzange 2-0 Seide durch die Luftröhre an der Bifurkationsstelle.
Binden Sie die Luftröhre zur rechten Lunge an der Bifurkationsstelle ab und überprüfen Sie den freien Fluss des Mediums durch die Luftröhre zur linken Lunge, indem Sie Kulturmedium passieren. Bereiten Sie ein Volumen von 50 Millilitern Lungenkrebszellen wie A549 oder H1299 in RPMI 1640 Komplettkulturmedien in einer Konzentration von zwei bis drei Millionen Zellen pro Milliliter vor. Setzen Sie eine 20-Milliliter-Luer-Lock-Spritze auf die Trachealkanüle und geben Sie 15 Milliliter Zellen in die Spritze.
Lassen Sie die Zellsuspension durch die Schwerkraft durch die Lungenlappen gelangen. Füge den Rest der Zellen hinzu, bevor Luftblasen durchdringen. Entfernen Sie nach der Aussaat die Spritze und warten Sie 15 Minuten, dann geben Sie frisches Medium in den Bioreaktor.
Stellen Sie es wieder in den Inkubator und perfundieren Sie das Lungengerüst nach dem Entfernen aller Luftblasen mit sechs Millilitern pro Minute. Die Histopathologie einer intakten Lunge zeigt die Lungenbläschen und Pneumozyten. Wie hier zu sehen ist, führt die Dezellularisierung zur vollständigen Entfernung der Lungenzellen, und die Histopathologie der azellulären Lunge zeigt eine intakte Basalmembran
.Der Movat-Pentachrom- und Elastin-Fleck einer dezellularisierten Lunge zeigt das Vorhandensein von Kollagen, Fibrin und Elastin bei intakten Gefäßen und Bronchus. Die DNA-Analyse der dezellularisierten Lunge zeigt eine Reduktion des DNA-Gehalts um mehr als 99%Die azelluläre Lunge kann direkt im Bioreaktor für die Zellkultur verwendet werden. Eine histologische Analyse zeigt das Vorhandensein von Tumorwachstum.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Heparin in den rechten Ventrikel des Herzens zu injizieren. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebsforschung, um die genetischen und epigenetischen Veränderungen zu erforschen, die zur Metastasierung von Tumorzellen im Lungenkrebs führen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für ein ex vivo Lungenkrebsmodell vor, das die Tumorentwicklung simuliert. Es ermöglicht die Isolierung von primären Tumoren, zirkulierenden Tumorzellen und metastatischen Läsionen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Onkologie
- Zellbiologie
- Translationale Medizin
Hintergrund
- Das ex-vivo-Modell ermöglicht die Untersuchung des Krebsfortschritts.
- Es erlaubt die Bildung von Primärtumoren und zirkulierenden Tumorzellen.
- Mit dieser Technik kann die therapeutische Wirksamkeit bewertet werden.
- Sie liefert Erkenntnisse zur personalisierten Therapie unter Verwendung von patientenabgeleiteten Tumorzellen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Modells, das die Tumorprogression nachahmt.
- Isolierung und Untersuchung verschiedener Krebszelltypen.
- Beurteilung der Wirksamkeit therapeutischer Arzneimittel.
Verwendete Methoden
- Verwendung eines tief anästhesierten Rattenmodells.
- Vorbereitung von Brust- und Bauchhöhle zur Tumorimplantation.
- Anwendung von Chlorhexidin zur Hautdesinfektion.
- Überwachung des Tumorwachstums und der Tumorprogression über die Zeit.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Bildung von Primärtumoren und zirkulierenden Tumorzellen.
- Nachweis des Potenzials zur Untersuchung metastatischer Läsionen.
- Bereitstellung eines Rahmens zur Bewertung individualisierter Krebstherapien.
- Herausstellung der Vorteile eines beschleunigten Studienzeitplans.
Schlussfolgerungen
- Das ex-vivo-Lungenkrebsmodell eignet sich zur Untersuchung der Tumordynamik.
- Diese Methode kann die Krebsforschung und die Entwicklung von Therapien erheblich unterstützen.
- Zukünftige Anwendungen könnten personalisierte Behandlungsstrategien verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses ex vivo-Lungenmodell ermöglicht es Biopharma-F&E-Teams, die Tumormetastasierung in einem physiologisch relevanten System mit kontrolliertem Nährstofffluss und Matrixinteraktion zu untersuchen. Es unterstützt die mechanistische Risikominderung, indem es Variablen wie die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix und die zelluläre Kommunikation beim Tumorfortschritt isoliert. Das Modell bietet eine prädiktive Aussagekraft für die Zielvalidierung und die Assay-Entwicklung in onkologischen Arzneimittelentdeckungs-Pipelines.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Tumor-Wirt-Wechselwirkungen in einer natürlichen Matrix zur Validierung metastasierungsbezogener Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung therapeutischer Kandidaten durch Modellierung der Freisetzung zirkulierender Tumorzellen und der Bildung metastatischer Läsionen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare Ergebnisse wie die Anzahl zirkulierender Tumorzellen und das Ausmaß der Metastasierung zur Standardisierung von Assays.
- Operativer Wert: Bietet eine reproduzierbare Plattform zur Untersuchung von Substanzen, die die Extravasation oder das Überleben von Tumorzellen im Lungengewebe hemmen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die Krankheitsrelevanz durch intakte Gefäß- und Bronchialarchitektur, wodurch eine Korrelation von Biomarkern mit histopathologischen Ergebnissen ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem Schlüsselschritte der metastatischen Kaskade modelliert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Modell integriert sich in den Onkologie-Entdeckungsworkflow von der Target-Validierung bis hin zur Leitstruktur-Identifizierung und liefert Zwischenphänotypen, die Entscheidungen über Fortsetzung oder Abbruch vor In-vivo-Studien unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Metastasen-Treibern, indem die Migration von Tumorzellen und deren Kolonisation im Lungengewebe beobachtet werden können.
- Screening: Ermöglicht quantitative Messungen abhängiger Variablen wie der Konzentration zirkulierender Tumorzellen und der Bildung metastatischer Läsionen zur Bewertung von Wirkstoffen.
- Analytik: Ermöglicht die statistische Analyse von Metriken zum Tumorprogress, um experimentelle Bedingungen zu vergleichen und den therapeutischen Effekt zu bewerten.
- Translationale Forschung: Passt an die präklinische Kontinuität an, indem die Lungenarchitektur erhalten bleibt und histopathologische Validierung von Tumorwachstum und Metastasierung ermöglicht wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Kann auf verschiedene Krebsarten und Zelllinien übertragen werden und unterstützt die Wiederverwendung der Plattform in onkologischen Entdeckungsprogrammen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Uneindeutigkeit in der Metastasenforschung, indem Tumorzellen in einer kontrollierten ex vivo-Umgebung von systemischen Variablen isoliert werden.
- Operativer Wert: Standardisiert die Modellierung des Tumorprogresses durch reproduzierbare Dekellularisierungs- und Perfusionsprotokolle.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühzeitige Risikominderung von Metastasen-zielgerichteten Therapien vor kostspieligen in-vivo-Studien ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf deren Einfluss auf die Bildung zirkulierender Tumorzellen und das metastatische Wachstum.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Chirurgie an Nagetieren, Perfusionsmethoden und steriler Gewebehandhabung.
- Setzt eine Bioreaktor-Infrastruktur voraus, die pulsatile Strömungsbedingungen und sterile Umgebungen aufrechterhalten kann.
- Erfordert die Standardisierung von Protokollen zur Zellseeding und zur Zusammensetzung der Kulturmedien über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg.
- Die Anpassung an humane oder andere säugetierliche Lungen-Scaffolds könnte eine Optimierung der Dekellularisierungsparameter erfordern.
- Eingeschränkt durch den ex vivo-Charakter des Modells, das systemische immunologische oder hormonelle Einflüsse über längere Zeiträume nicht erfasst.
