Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im Bereich der Efferozytose zu beantworten, wie z.B. die Rolle von Signalmolekülen bei der Vermittlung der Aufnahme apoptotischer Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine klare Quantifizierung der apoptotischen Zellaufnahme ermöglicht, einschließlich teilweiser oder stückweiser apoptotischer Zellaufnahme, was bei anderen Methoden nicht immer der Fall ist. Obwohl diese Methode Aufschluss über die Efferozytose von Immunzellen geben kann, kann sie auch auf andere Zelltypen wie Epithel- oder Krebszellen angewendet werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, die Mikroskopaufnahmeeinstellungen zu optimieren. Nach der Präparation von menschlichen Makrophagen und apoptotischen Jurkat-Zellen wird ein Hämozytometer verwendet, um die apoptotischen Zellen zu zählen. Übertragen Sie dann eine ausreichende Menge apoptotischer Zellen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Pelletieren Sie die Jurkat-Zellen durch Zentrifugation bei 500-facher g für fünf Minuten. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern PBS. Während sich die Jurkat-Zellen in der Zentrifuge befinden, aliquotieren Sie 10 Mikroliter DMSO in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.

Als nächstes lösen Sie eine minimale Menge NHS-Biotin im DMSO auf. Übertragen Sie danach 500 Mikroliter der apoptotischen Zelle und die PBS-Suspension in das Röhrchen, das DMSO und NHS-Biotin enthält. Verdünnen Sie dann einen geeigneten Zellverfolgungsfarbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Inkubieren Sie die Zellsuspension bei Raumtemperatur für 20 Minuten im Dunkeln. Fügen Sie dann ein gleiches Volumen RPMI 1640 mit 10 % FBS hinzu und inkubieren Sie die Suspension weitere fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Danach pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 mal g für fünf Minuten.

Verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die gefärbten Zellen in 100 Mikrolitern RPMI 1640 mit 10 % FBS. Geben Sie 100 Mikroliter gefärbte Zellsuspension tropfenweise in jede Vertiefung der Makrophagen. Dann zentrifugieren Sie die Platte eine Minute lang bei 200 mal g.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 in einem Gewebekultur-Inkubator. Nehmen Sie nach der entsprechenden Inkubationszeit die Zellen aus dem Inkubator. Waschen Sie dann die Zellen zweimal mit einem Milliliter PBS.

Geben Sie danach verdünntes FITC-konjugiertes Streptavidin in jede Vertiefung. Und inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter PBS und schütteln Sie die Proben nach jedem Spülen fünf Minuten lang vorsichtig.

Fixieren Sie dann die Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen einmal mit PBS, um überschüssiges PFA zu entfernen. Montieren Sie Deckgläser auf einem Objektträger und übertragen Sie den Objektträger in ein Fluoreszenzmikroskop.

Erfassen Sie Z-Stapel mit einer ausreichenden Anzahl von Zellen für die Quantifizierung. Es ist entscheidend, den Abstand zwischen diesen Abschnitten so einzustellen, dass das gesamte verschlungene apoptotische Material erkannt wird. Der maximale Abstand zwischen diesen Abschnitten sollte nicht größer sein als die Brenntiefe Ihres Objektivs, normalerweise 0,5 bis ein Mikrometer.

Laden Sie einen der Z-Stapel mit der Importfunktion in die Software. Wählen Sie dann im Bereich "Messungen festlegen" die Option "Integrierte Dichte" als Messoption aus. Die Analyse ist am einfachsten durchzuführen, wenn sowohl der Streptavidin- als auch der Zellverfolgungsfarbstoffkanal als Overlay angezeigt werden.

Jedes Objekt mit einer Streptavidin-Färbung entlang eines Umfangs sollte als Streptavidin-positiv betrachtet werden und sollte daher nicht als Streptavidin-negativ quantifiziert werden. Nachdem das Bild geladen ist, kreisen Sie mit dem Streptavidin und dem Freihand- oder Polygonauswahlwerkzeug das gesamte negative Material mit Zellverfolgungsfarbstoff in einer einzigen Ebene des Z-Stapels ein. Messen Sie dann die integrierte Intensität des Zellverfolgungsfarbstoffs in der Region.

Verwenden Sie im selben Z-Abschnitt die Streptavidin-Färbung und das Freihand- oder Polygonauswahlwerkzeug, um das gesamte Streptavidin-positive Material mit Zellverfolgungsfarbstoff einzukreisen. Messen Sie abschließend die integrierte Intensität dieses Bereichs. Mit diesem Verfahren durchliefen mehr als 95 % der mit Staurosporin behandelten Jurkat-Zellen eine Apoptose.

In den meisten Experimenten stieg der Anteil der apoptotischen Zellen, die efferozytiert werden, zeitabhängig an. Bei der Optimierung dieses Protokolls für verschiedene efferozytäre Zelltypen oder verschiedene apoptotische Zellziele ist es wichtig, den Bereich des Verhältnisses von apoptotischen Zellen zu efferozytären Zellen zu testen. Normalerweise funktionieren Verhältnisse von 10 zu eins oder 30 zu eins am besten.

Dieses Verfahren kann leicht modifiziert werden, um die Aktivierung von Signalmolekülen oder den intrazellulären Transport zu verfolgen, indem fluoreszierende Reportergene in den efferozytären Zellen exprimiert werden, wodurch diese Prozesse während der Efferozytose abgebildet werden können.