Vorbereitung einer qualitativ hochwertigen Primärzelle Kultur von Fisch Hypophysen
28. August 2018
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Hypophyse primären Zellkulturen von Medaka (Oryzias Latipes) zu erhalten. Die optimierte Bedingungen in diesem Protokoll nehmen wichtige Parameter wie Temperatur, Osmolalität und pH berücksichtigt durch die Nachahmung der physiologischen Bedingungen der Fische, wodurch es physiologisch mehr aussagekräftige Ergebnisse.
Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Endokrinologie zu beantworten, wie Hypophysenzellen in einer kontrollierten Umgebung funktionieren und interagieren. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie physiologisch bedeutsame Ergebnisse für Medaka fördert und einen Referenzleitfaden für die Herstellung von primären Zellkulturen aus anderen Spezies bietet. Beginnen Sie damit, den Kopf des Medaka mit einer feinen Nadel über dem Mund und einer auf jeder Seite des Kopfes hinter dem Gehirn auf der Wachsplatte zu befestigen.
Legen Sie den Fisch unter ein Seziermikroskop und kratzen Sie mit einer feinen Pinzette mit abgewinkelter Spitze vorsichtig die Schuppen von der Oberseite des Kopfes ab. Führen Sie die Pinzette vorsichtig unter die Haut an der Seite des Kopfes ein und bewegen Sie die Pinzette langsam in Richtung Mund, um das Schädeldach zu entfernen. Schneiden Sie das Rückenmark mit der Pinzette vollständig ab und drehen Sie das Gehirn vorsichtig in Richtung Mund, um die Hypophyse freizulegen.
Ernten Sie die Drüse mit einer sauberen Pinzette mit gerader Spitze in ein Plastikröhrchen mit 1,5 Millilitern modifiziertem DPBS auf Eis. Wenn alle Hypophysen entnommen wurden, schleudern Sie das Gewebe mit einer Mikrozentrifuge für ein bis zwei Sekunden bei Raumtemperatur herunter und verwenden Sie eine Glaspipette, um das DPBS vorsichtig zu entfernen, wobei Sie darauf achten, das Hypophysenpellet nicht zu stören. Waschen Sie das Gewebe mit einem Milliliter Trypsinlösung für weitere ein bis zwei Sekunden in der Mikrozentrifuge und saugen Sie mit der Glaspipette den größten Teil des Überstands ab.
Wenn das gesamte Trypsin entfernt wurde, fügen Sie der Probe einen weiteren Milliliter Trypsin hinzu und inkubieren Sie das Gewebe 30 Minuten lang in einem 26 Grad Celsius warmen Wasserbad mit gelegentlichen sanften Schnippen. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Hypophysen für ein bis zwei Sekunden und entfernen Sie mit einer Glaspipette den größten Teil des Trypsins, ohne das Gewebe zu stören. Waschen Sie dann die Probe mit einem Milliliter Trypsin-Inhibitorlösung, um das Trypsin zu inaktivieren, und zentrifugieren Sie sie für ein bis zwei Sekunden.
Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, geben Sie einen weiteren Milliliter Trypsin-Inhibitor-Lösung in das Röhrchen und inkubieren Sie die Probe 20 Minuten lang in einem 26 Grad Celsius warmen Wasserbad unter Schnippen. Während das Gewebe inkubiert, geben Sie zwei Milliliter L-15-Medium in eine 35 Millimeter große Poly-D-Lysin-kodierte Zellkulturschale mit zentralem Glasboden und äquilibrieren Sie die Platte mindestens 10 Minuten lang bei 26 Grad Celsius und 1 % Kohlendioxid. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Hypophysen für ein bis zwei Sekunden und aspirieren Sie vorsichtig die gesamte Trypsin-Inhibitor-Lösung aus dem Röhrchen.
Geben Sie in einer Laminar-Flow-Haube einen Milliliter eiskaltes modifiziertes DPBS zu den Gewebestücken der Hypophyse und verwenden Sie eine feuerpolierte Glaspipette, um das Gewebe sechs bis sieben Mal sanft auf Eis zu zerreiben, wobei Sie darauf achten, Blasen zu vermeiden. Nach einer weiteren Zentrifugation von ein bis zwei Sekunden wird etwa ein Milliliter der dissoziierten Zelle, die die obere Schicht DPBS enthält, vorsichtig in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis überführt. Wiederholen Sie die Verreibung und die Entnahme dissoziierter Zellen neun weitere Male, bis alle 10 Milliliter des DPBS verwendet wurden, beginnend mit der Pipettenspitze mit einer mittelgroßen Öffnung und wechseln Sie zu einer Pipettenspitze mit der kleineren Öffnung für die letzten drei bis vier Milliliter DPBS.
Die mechanische Dissoziation mit einer Glaspipette ist ein kritischer Schritt dieses Protokolls und erfordert einige Übungen, um ein gutes Ergebnis zu erzielen. Pipettieren Sie die Zelllösung vorsichtig, um eine Beschädigung der zerbrechlichen dissoziierten Zellen zu vermeiden. Markieren Sie nach der 10. Verreibung die Seite jedes Röhrchens, an der sich das Pellet befindet, und schleudern Sie die Probe in einer vorgekühlten Zentrifuge nach unten.
Am Ende der Zentrifugation nehmen Sie das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge und übertragen den Überstand mit einer Glaspipette sofort, aber vorsichtig in ein 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen, wobei Sie darauf achten, dass der größte Teil des Überstands entfernt wird, ohne das kleine, häufig unsichtbare Pellet zu stören, und dann das Pellet vorsichtig in 50 bis 100 Mikrolitern L-15-Nährmedium resuspendieren. Lassen Sie die dissoziierten Zellen vorsichtig in die Mitte der zuvor vorbereiteten Zellkulturschale tropfen und lassen Sie die Zellen etwa fünf Minuten lang auf den Boden der Schale sinken, bevor Sie die Schale in den Inkubator stellen, um zu vermeiden, dass sich die Zellen außerhalb des eingesunkenen Bereichs des Glasbodens verteilen. Nach 30 Minuten bei 26 Grad Celsius und 1 % Kohlendioxid überprüfen Sie die Zellen lichtmikroskopisch, um zu bestätigen, dass sie sich am Boden der Schale festgesetzt haben, und stellen Sie die dissoziierte Hypophysenzellkultur nicht länger als sieben Tage in den Inkubator zurück.
Die Ernte von etwa 10 erwachsenen Medaka-Hypophysen führt in der Regel zu einer Dichte von etwa 50.000 bis 100.000 Zellen pro Schale nach der Aussaat. Die Anzahl der sterbenden Zellen ist im Laufe der Zeit nahezu konstant, wobei über 95 % der Zellen nach einem Tag lebensfähig und über 90 % nach drei Tagen noch am Leben sind, wobei nach einer Woche Kultur ein leichter Rückgang der Lebensfähigkeit zu beobachten ist. Elektrophysiologische Ableitungen von GFP-exprimierenden luteinisierenden Hormongonadotropen zeigen, dass die dissoziierten Hypophysenzellen in der Lage sind, nach vier Tagen in Kultur spontan Aktionspotentiale abzufeuern.
Des Weiteren folgt auf eine anfängliche vorübergehende Hyperpolarisation der Zellmembran nach Stimulation des Gonadotropin-Releasing-Hormons eine dramatische Erhöhung der Feuerfrequenz, die mit der Depolarisation und der verlängerten Dauer der Aktionspotentiale einhergeht. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, präzise und effizient zu arbeiten, um die Hypophysenzellen in einem gesunden Zustand zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie qPCR oder fortschrittliche bildgebende Verfahren durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie bestimmte Behandlungen die Physiologie der Hypophysenzellen verändern können.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Herstellung und Kultivierung von primären Hypophysenzellkulturen aus dem Medaka-Fisch (Oryzias latipes) vorgestellt. Die Methode optimiert die Bedingungen hinsichtlich Temperatur, Osmolalität und pH, um physiologische Umgebungen nachzuahmen, und ermöglicht so aussagekräftige Erkenntnisse zur Hypophysenfunktion.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Endokrinologie
- Zellkultivierungstechniken
- Physiologische Modellierung
Hintergrund
- Primäre Hypophysenzellkulturen von Fischen sind bisher nicht weit verbreitet.
- Das Protokoll zielt darauf ab, physiologische Bedingungen nachzuahmen, um aussagekräftigere Daten zu erhalten.
- Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Hypophysenzellen ist für die Endokrinologie von entscheidender Bedeutung.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung der Physiologie von Hypophysenzellen.
- Einrichtung einer Referenz für die Erstellung von Kulturen aus anderen Arten.
- Ermöglichung der Forschung zur Hormonregulation und Zellinteraktion.
Verwendete Methoden
- Zellkulturmethode, speziell angepasst für Medaka-Hypophysengewebe.
- Beinhaltet sorgfältige Dissektion und enzymatische Dissoziation des Gewebes.
- Die Zellen werden in einer kontrollierten Umgebung bei 26 °C und 1 % CO2 kultiviert.
- Kritische Arbeitsschritte umfassen die mechanische Dissoziation und schonende Handhabung zur Aufrechterhaltung der Vitalität.
Hauptergebnisse
- Lebensfähigkeitstests zeigen eine Zellviabilität von über 90 % bis zu drei Tage im Kulturansatz.
- Dissoziierte Zellen zeigen Aktionspotentiale und Reaktionen auf hormonelle Stimulierung.
- Die Methode ermöglicht anschließende Analysen wie die qPCR, um die Zellphysiologie weiter zu untersuchen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie etabliert ein zuverlässiges Protokoll zur Untersuchung der Hypophysenfunktion bei Medaka.
- Die Methodik liefert Erkenntnisse, die auf andere Arten übertragbar sind und für die Erforschung endokriner Funktionen relevant sind.
- Die Ergebnisse unterstützen die Erforschung von Hormonwirkungen und vertiefen das Verständnis der Zelldynamik in der Endokrinologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Einrichtung physiologisch relevanter Primärzellkulturen aus nichtmenschlichen Arten ermöglicht eine mechanistische Entschärfung bei der Validierung endokriner Zielstrukturen, indem ein kontrolliertes System zur Untersuchung von Hormonsignalwegen bereitgestellt wird. Dieser Ansatz stärkt die Vorhersagekraft in der frühen Entdeckungsphase, indem quantitative Bewertungen der zellulären Reaktionen auf Gonadotropin-freisetzendes Hormon und andere Modulatoren ermöglicht werden. Das Protokoll bietet einen übertragbaren Rahmen zur Anpassung von Primärkulturtechniken an verschiedene Modellsysteme und verbessert so die Übertragbarkeit zwischen Arten in der präklinischen Forschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Funktion von Hypophysenzellen und der Hormonantwortfähigkeit in einer kontrollierten Umgebung.
- Operativer Wert: Bietet ein reproduzierbares System zur Beurteilung ligandeninduzierter elektrophysiologischer Veränderungen in Gonadotropenzellen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt dissoziierte primäre Zellen, die für Tests zur Bestimmung der Vitalität und elektrophysiologische Messungen geeignet sind.
- Operativer Wert: Liefert konsistente Zelldichten (50.000–100.000 Zellen/Platte) für standardisierte Assay-Besiedlungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die Zellviabilität und -funktion bis zu einer Woche lang aufrechterhalten wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht nachgeschaltete Anwendungen wie qPCR und fortgeschrittene Bildgebung, um die Wirkung von Behandlungen auf die Physiologie der Hypophyse zu bewerten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie vor den Bemühungen zur Identifizierung von Wirkstoffen ein biologisch relevantes zelluläres Modell für die Untersuchung endokriner Signalwege bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung von Signalmechanismen in Hypophysenzellen und der hormonellen Regulation.
- Screening: Liefert quantitative Ergebnisse, einschließlich Angaben zur Lebensfähigkeit in Prozent und Messungen der Aktionspotenzialfrequenz.
- Analytik: Ermöglicht elektrophysiologische und molekulare Messgrößen, die den Vergleich verschiedener Bedingungen unterstützen.
- Translationale Forschung: Erhält funktionstüchtige Hypophysenzellen über längere Kulturzeiträume und unterstützt damit präklinische Studien, die auf Biomarker ausgerichtet sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine anpassbare Plattform für Primärkulturen, die auch auf andere nicht-säugerartige Arten bei entsprechenden Umweltanpassungen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschären bei der Validierung endokriner Zielstrukturen durch physiologisch aussagekräftige zelluläre Modelle.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Dissoziierungs-, Auftrags- und Inkubationsverfahren sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem eine frühzeitige Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf die Funktion von Hypophysenzellen ermöglicht wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung endokriner Zielstrukturen basierend auf validierten zellulären Reaktionen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrodissektion und enzymatischer Gewebe-Dissociation.
- Setzt Zugang zu temperaturgeregelten Inkubatoren mit 26 °C und 1 % CO2 voraus.
- Erfordert eine standardisierte Mediumzusammensetzung, die an die osmolare und pH-Bedingungen von Fischen angepasst ist.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Übertragen des Protokolls auf andere Arten mit unterschiedlichen physiologischen Parametern.
- Eingeschränkt durch die Zerbrechlichkeit dissociierter Hypophysenzellen, die eine schonende Handhabung während mechanischer Triturationsschritte erfordert.
