Name: Eine Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay, NMDA-Rezeptoren mit Sensibilität für Glycin/D-Serin und Glutamat zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: Lernen Sie einen Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay zur Untersuchung von NMDA-Rezeptoren in HEK 293 Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Rezeptoraktivität und die Entwicklung neuer Therapien für neurologische Erkrankungen.

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Die Autoren möchten den Post Baccalaureate Scholars Program Office und Novartis Institutes for BioMedical Research als Ganzes für die Finanzierung dieser Studie danken.

1. Vorbereitung der Zellen
Hinweis: Dieses Protokoll, einschließlich der Datengenerierung, verwendet HEK293 Zellen mit einem Baculovirus Codierung NR1 und NR2A Zellen ausgestrahlt.
<ol><li>Die entsprechende Anzahl an HEK293 Zellen Saatgut und NR1 und/oder NR2A Virus am entsprechenden Endkonzentrationen (1,00 µL) hinzufügen. Verwenden Sie für ein 384-Well-Platte 10.000 Zellen/Brunnen in einem Endvolumen von 30 µL.</li>
	<li>Alternativ HEK293-NR1-NR2A Samenzellen über die entsprechende Zellenzahl und Volumen (für ein 384-Well-Platte, Verwendung 10.000 Zellen/Brunnen in einem Endvolumen von 30 µL). Tetracyclin in einer Konzentration von 2 µg/mL zu induzieren NR2A Ausdruck und fügen Sie den zusammengesetzten Schutz hinzufügen (100 µM MDL105, 519 oder 5 µM CGP07066724).</li>
	<li>Hinweis: Das Baculovirus Codierung NR1 und NR2 sollte eine ungefähre Titer zwischen 5 x 10-9 - 10 x 109 infektiösen Einheiten pro Milliliter24haben.</li>
</ol>2. Messung der NMDA-Rezeptor-Aktivität
<ol><li>Bereiten Sie eine 384-Well-Platte mit HEK293 Zellen mit NR1/NR2 oder HEK293-NR1-NR2A Zellen in Anwesenheit von entweder schützende Verbindung ausgestrahlt. Verwenden Sie eine klare Boden, schwarzer Rahmen, Poly-D-Lysin beschichtete Platte. Hinweis: Schutz mit 100 µM MDL105, 519 wird verwendet, um die Empfindlichkeit zu Glycin, während 5 µM verleihen CGP070667 wird verwendet, um die Empfindlichkeit gegenüber Glutamat zu verleihen.</li>
	<li>16 Stunden (über Nacht) inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 .</li>
	<li>Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und entsorgen Sie sanft die Zelle Medien durch die Verlangsamung, spiegeln die Platte über eine kompatible Bioabfälle Container. Tippen Sie die Platte auf ein Papiertuch zu reinigen die Medien Kanten der Platte und entwässern alle übrigen Medien vorsichtig an.</li>
	<li>Bereiten Sie den calcium6-Farbstoff durch Gefäss-eine Phiole mit calcium6 Farbstoff (1 Plattengröße) in 10 mL Inkubation Puffer (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM Probenecid). 2 Stunden bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren Sie Platte.</li>
	<li>Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie die Zellen, die für 10 Minuten auf Raumtemperatur anpassen.</li>
	<li>Gießen Sie vorsichtig, des calcium6-Farbstoffes, wie unter Punkt 2.3 beschrieben und 30 µL testpuffer (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl2, 1 mM Probenecid).</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.6 zweimal für eine Gesamtmenge von 3 Wäschen. Lassen Sie 30 µL testpuffer auf die Zellen nach dem letzten waschen.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen für 5 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Liganden-Platte machen ein 4-fold Lager von 400 µM Glycin und 400 µM Glutamat (Endkonzentration von 100 µM; optimale Konzentration des Liganden ermittelt werden, wie unten beschrieben). Übertragen Sie ein Minimum von 25 µL des Liganden bestand in einem V-Boden-384-Well-Platte.</li>
	<li>Laden Sie die Liganden Platte und Zellplatte in FDSS (funktionelle Drug Screening-System).</li>
	<li>Die Baseline-Fluoreszenz (Fo) der Zellplatte für 30 Sekunden zu messen. Übertragen Sie 10 µL der Liganden bestand in der Zellplatte mit FDSS Abgabe Funktion und Maßnahme der Kalzium-Fluss durch die Aufnahme calcium6-Farbstoff Fluoreszenz für 5 Minuten.</li>
	<li>Berechnen Sie die maximale Fluoreszenz-Verhältnis dividiert die maximale Fluoreszenz durch die Basislinie Fluoreszenz (Fmax/fo) gewonnen.</li>
</ol>(3) Optimierung der NMDAR Ausdruck Niveaus
<ol><li>Um die optimale Menge an Baculovirus nutzen zu ermitteln, führen Sie eine Titrierung NR1 und NR2A Viren. Bereiten Sie eine 384-Well-Platte mit HEK293 Zellen (Empfehlung von 10.000 Zellen/gut, 30 µL der Medien) und umfassen Sie die Schutz-Verbindungen, wie unter Punkt 2.1 beschrieben.</li>
	<li>Fügen Sie unterschiedliche Mengen des Virus NR1 in verschiedenen Reihen der Platte (zum Beispiel: Fügen Sie 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL 0.25 µL bzw. in den Reihen A-E). Fügen Sie Duplikate für Korrektheit der Daten.</li>
	<li>Fügen Sie unterschiedliche Mengen an das NR2A-Virus in verschiedenen Spalten der Platte (zum Beispiel: Fügen Sie 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL 0.25 µL bzw. in den Reihen A-E). Fügen Sie Duplikate für Korrektheit der Daten.</li>
	<li>16 Stunden (über Nacht) inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 .</li>
	<li>Bestimmen Sie die optimale Verhältnis und die Höhe der NR1 und NR2A Viren durch Ausführen einer Kalzium-flussmessung FDSS (siehe oben).</li>
</ol>(4) Liganden Titration
<ol><li>Bereiten Sie die Zellen, wie unter Punkt 2.3 beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie Verdünnungen von jeder Ligand in Anwesenheit von Sättigung Konzentrationen (100 µM vor) des anderen Liganden als eine 4-fold Stammlösung. Zum Beispiel: für eine 10 µM Abschlusstest Konzentration von Glycin, bereiten Sie eine 40 µM-Stammlösung von Glycin einschließlich 400 µM Glutamat.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Messung von FDSS wie in Schritt 2.11 beschrieben.</li>
</ol>5. Verbindung testen
<ol><li>Bereiten Sie die Zellen, wie in Schritt 1 beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie die Liganden-Platte mit einem 5-fold bestand der endgültigen Liganden-Konzentration in der Assay-Puffer.</li>
	<li>Bereiten Sie die Verbindungen-Platte mit dem 4-fold bestand der gewünschten Endkonzentration von Verbindungen in der Assay-Puffer. Bereiten Sie eine zusammengesetzte Endkonzentration von 10 µM in der Assay-Puffer eine Stammlösung 40 µM.<ol>
<li>Halten Sie die Konzentration von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) konstant über alle Proben durch die Vorbereitung einer Vorverdünnung der Verbindung in DMSO vor weiteren Verdünnung in den Assay-Puffer.</li>
		<li>Bereiten Sie für eine Dosis-Antwort der Verbindung in der letzten Probe zwischen 3 und 30 µM eine Vorverdünnung der Verbindung im Bereich von 1 bis 10 mM DMSO. In der Assay-Puffer, die 4-fold Lager Konzentration zu verdünnen. Die Endkonzentration der DMSO sollte 0,5 % nicht überschreiten. Hinweis: Es wird empfohlen, jede Probe in Triplicates zu testen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laden Sie die Liganden, die Verbindung und die Zellplatte in FDSS.</li>
	<li>Messen Sie die Grundlinie Fluoreszenz für 30 Sekunden.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL des zusammengesetzten Materials und Messung der Fluoreszenz für 5 Minuten.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL des Liganden Lager und Messung der Fluoreszenz für 5 Minuten.</li>
	<li>Das Integral der Fluoreszenz-Verhältnis durch die Berechnung der Fläche unter der Kurve der fluoreszierenden Verhältnisse während der letzten 5 Minuten der Messung zu bestimmen. Hinweis: Alternativ kann das maximale Verhältnis der Fluoreszenz nach Ligand Zugabe für die Analyse verwendet werden.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte und nichts preisgeben.

Der Erfolg dieser Assay hängt die Gesundheit der HEK Zellen verwendet. Zellen, exponentielles Wachstum erlebt und mit niedrigen Passagenanzahl sollte verwendet werden. Dieser Test beinhaltet viele Transfers und Ergänzungen von Lösungen, also mit Vorsicht sorgt für höhere Genauigkeit des Ergebnisses. Konzentrationen von Verbindungen und alle anderen Reagenzien sollten auch abgeglichen, Fehler zu minimieren. Beim Austausch der Zelle Medien mit dem Assay-Puffer für die Kalzium-Flux-Assay sollte die Platte vorsichtig gekippt...

Mit den aktuellen Fortschritten in der Medizin hat die Lebenserwartung deutlich zugenommen; Allerdings hat also die Prävalenz der altersbedingten Erkrankungen. Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Schizophrenie, Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit, unter anderem sind da keine Ausnahme und haben voraussichtlich in den nächsten zehn Jahren1, zu erhöhen 2 , 3. die Fehlfunktion von Ionotropic Glutamat-Rezeptoren bekannt als N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDAR), Alzheimer-Krankheit, Schizophrenie, Schädel-Hirn-Verletzungen, Schlaganfall, Diabetes und Glaukom u.a. die Optionsscheine verknüpft wurde die Ihre Biologie für die Entwicklung von wirksamen, krankheitsmodifizierende Therapien4,5,6,7studieren müssen.
NMDARs bestehen aus vier Monomeren oder Untereinheiten4,8,9. Das Strukturbild der NMDAR zeigt Entwicklungs- und regionale Streuung innerhalb der Gehirn-7,-10. NMDARs engagieren sich in Synaptische Plastizität, Kognition und die Generation der Rhythmen für Atmung und Fortbewegung11,12,13. Als Voltage-gated-Kanal, es ist weitgehend nicht leitend bei ruhenden Membranpotential (-70 mV) und wird durch Magnesium zur Verhinderung weiterer Permeation von Ionen blockiert. Der Kanal wird durch die Bindung von zwei Liganden, Glutamat und Glycin/D-Serin aktiviert, und eine gleichzeitige Depolarisation an der synaptischen Membran durch AMPA-Rezeptoren, eine andere Unterklasse von Ionotropic Glutamat-Rezeptoren vermittelt. Die Depolarisation entfernt die Magnesium-Blockade der NMDAR, so dass des Zustroms von Kationen, insbesondere Kalzium14,15,16. Obwohl die Aktivierung von NMDAR essentiell für das Überleben der Zelle ist, kann übermäßige Aktivierung zu Tod17,18,19 bis Excitotoxizität Zelle führen. Dies macht neben der komplexen Natur des Rezeptors, es schwierig durchzuführenden Studien notwendig für die Entwicklung wirksamer Therapien.
Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um die NMDAR zu studieren. Allerdings hat jeweils begleitenden Einschränkungen. Beispielsweise ist eine weit verbreitete Technik eine Fluoreszenz basierende Assays, die NMDAR-vermittelte Änderungen in intrazellulären Calcium in eine stabile Zelllinie unter der Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors (Tet-On)20misst. Jedoch in diesem System macht supramaximalen Konzentrationen von Liganden, die benötigt werden und die Anforderung, dass NMDAR Inhibitoren vorhanden während der Messung sind es nahezu unmöglich, Aktivität der kompetitiver Antagonist zu erkennen. In anderen ähnlichen Systemen verursacht der Ausdruck des funktionalen Rezeptors Toxizität, erfordern-Antagonisten wie Ketamin21,22 , die Zellkulturen zu bewahren. Diese Kanalblocker das Herzstück des Rezeptors sitzen und sind schwierig zu waschen, vor allem in einem Teller-basierte Format, damit sie funktionellen Studien des Rezeptors beeinträchtigt. Zu guter Letzt in elektrophysiologische Messungen wie Patch spannen, gibt es begrenzter Durchsatz, und groß angelegte Studien sind sehr teuer23. Dennoch sind die oben genannten Systeme unempfindlich gegen Glycin Stimulation; Daher wird das Studium Glycin-abhängige Aktivität von der NMDAR eine Herausforderung.
Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz für das Studium NMDAR, die die besprochenen Grenzen überwindet. Unsere Technik nutzt Baculovirus Expressionssystems Rezeptor auf Funktionsebenen mit optimalem Verhältnis der Untereinheiten in weniger als 16 Stunden zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Baculovirus für einen einfachen und kombinatorische Ansatz, wonach eine breite Charakterisierung der verschiedenen rekombinanten NMDAR Untertypen. Im Gegensatz zu anderen Assays erfordert dieses Protokoll nicht-Kanal-Blocker wegen des Einsatzes von schwachen Antagonisten. Stärkste Vorteil der Methode ist, dass nach dem Auswaschen des schwachen Antagonisten, der Rezeptor reagiert empfindlich auf Modulation der einzelnen Glycin - und Glutamat-Bindungsstellen neben duale Modulation von Glycin/D-Serin und Glutamat Ligand-Bindung Seiten. Der Assay rekapituliert bekannten Pharmakologie des NMDAR-Rezeptors und die Auswirkungen seiner bekannten positiven und negativen Modulatoren. Zu guter Letzt Generation von in-vitro- zelluläre Assays überwindet die zelluläre Toxizität verursacht durch übermäßigen Kalzium Zustrom und ermöglicht funktionelle Studien des Rezeptors in einer Hochdurchsatz-Mode, die Entdeckungen der NMDAR Modulatoren beschleunigen können bei Krankheitszuständen.

<table><tbody><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Humane NMDA (NR1/NR2A)-Rezeptor-Zelllinie</td><td>ChanTest Corporation</td><td>CT6120</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac Dual-Expressionsvektor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10712-024</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384-Well-Mikroplatte mit klarem Flachboden</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3844</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit</td><td>Molekular Geräte</td><td>R8192</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>D-Serin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4250</td><td></td></tr><tr><td>L701,324</td><td>Tocris</td><td>907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Puffer</td><td>Boston Bio Produkt</td><td>BB-103</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>VWR</td><td>E506</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX Medien</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>MDL105.519</td><td>NIBR</td><td>Im eigenen Haus</td><td></td></tr> <tr><td>synthetisiertNVP-AAM077</td><td>NIBR</td><td>im eigenen Haus</td><td></td>synthetisiert</tr><tr><td>CGP070667</td><td>NIBR</td><td>im eigenen Haus</td><td></td> synthetisiert</tr></tbody></table>

eine hochdurchsatz-kalzium-flux-assay, nmda-rezeptoren mit sensibilität für glycin/d-serin und glutamat zu studieren

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren (NMDAR) gelten als Ionotropic Glutamat-Rezeptoren und haben entscheidende Rollen in lernen und Gedächtnis. NMDAR Störung, ausgedrückt als entweder über - oder unter - activity verursacht durch Mutationen, veränderten Ausdruck, Menschenhandel oder Lokalisierung, kann zahlreiche Krankheiten, insbesondere in das zentrale Nervensystem beitragen. Daher unbedingt Verständnis der Rezeptor Biologie sowie zur Erleichterung der Entdeckung von Verbindungen und kleine Moleküle in laufenden Bemühungen zur Bekämpfung von neurologischer Erkrankungen. Aktuelle Ansätze zur Untersuchung des Rezeptors haben Beschränkungen, einschließlich niedriger Durchsatz, hohen Kosten und der Unfähigkeit, seine funktionellen Fähigkeiten durch die notwendige Anwesenheit von Kalziumkanalblocker NMDAR-vermittelten Excitotoxizität verhindern zu studieren. Darüber hinaus die bestehenden Assay-Systeme sind empfindlich auf die Stimulation durch Glutamat nur und Empfindlichkeit auf Anregung von Glycin, die andere Co Liganden der NMDAR fehlt. Hier präsentieren wir die erste Platte-basierte Assay mit hohem Durchsatz macht einen NMDA-Rezeptor mit Sensibilität für Co-Liganden, Glutamat sowohl D-Serin/Glycin zu studieren. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der verschiedenen NMDAR Untereinheit Kompositionen und funktionelle Studien des Rezeptors in Glycin und/oder Glutamat-sensitiven Modi ermöglicht. Darüber hinaus erfordert die Methode nicht die Anwesenheit von Inhibitoren während der Messung. Die Auswirkungen der positive und negative allosterische Modulatoren können mit diesem Test erkannt werden und die bekannten Pharmakologie des NMDAR in unserem System repliziert wurden. Diese Technik überwindet die Grenzen der bestehenden Methoden und ist kostengünstig. Wir glauben, dass diese neuartige Technik die Entdeckung von Therapien für NMDAR-vermittelten Erkrankungen beschleunigen wird.

Vor der Prüfung der Auswirkungen von kleinen Molekülen, muss die optimalen Ausdruck Ebenen des NMDARs sowie die optimale Liganden-Konzentrationen festgestellt werden. Wie beschrieben, HEK293 Zellen bei 10.000 Zellen pro Bohrloch in einem 384-Well-Platte ausgesät wurden, in Anwesenheit von 5 µM CGP060667, dann ausgestrahlt mit unterschiedlichen Mengen von NR1 und NR2A Viren. Nach Inkubation über Nacht, Liganden-induzierte Kalzium Flussmittel gemessen wurde (Abbildung 1...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Studium der NMDA-Rezeptoren (NMDAR) in einem größeren Maßstab erleichtern und ermöglichen die Prüfung der modulierende Effekte von kleinen Molekülen und deren therapeutische Anwendungen.

Eine Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay, NMDA-Rezeptoren mit Sensibilität für Glycin/D-Serin und Glutamat zu studieren

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Diese Methode kann helfen, NMDA-Modulatoren zur Behandlung neurologischer Erkrankungen zu entdecken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der Aktivität von NMDA-Rezeptoren als Reaktion auf Abwehrkonzentrationen oder Kombinationen von Liganden in Verbindungen ermöglicht. Diese Methode kann also einen Einblick in die allgemeine Leistungsfähigkeit des NMDA-Rezeptors geben.Es kann auch angewendet werden, um in der Biologie spezifische Subtypen und die Empfindlichkeit des NMDA-Rezeptors als Reaktion auf Liganden oder Verbindungen zu untersuchen. Um die Aktivität des NMDA-Rezeptors zu messen, bereiten Sie eine 384-Well-Platte mit HEK 293-Zellen vor, die mit NR1-, NR2- oder HEK 293-, NR1-, NR2A-Zellen in Gegenwart einer schützenden Verbindung transduziert wurden. Inkubieren Sie die Platte dann 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid.Nehmen Sie am nächsten Tag die Platte aus dem Inkubator und entsorgen Sie die Zellmedien vorsichtig, indem Sie die Platte langsam über einen kompatiblen Bioabfallbehälter drehen. Klopfen Sie vorsichtig auf ein Papiertuch auf die Platte, um das Medium von den Rändern der Platte zu reinigen, und lasse

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Dieses Video gibt einen detaillierten Protokoll für die Untersuchung der pharmakologischen Profil des menschlichen TRPA1 Kanäle mit FlexStation 3. Das Protokoll umfasst Einzelheiten Zellpräparation, Farbstoff Laden und Betrieb der Mikroplatten-Reader, FlexStation 3.

Zellbasierte Calcium-Assay für Mittel-bis High-Throughput-Screening von TRP-Kanal-Funktionen mit FlexStation 3

Hier beschreiben wir eine Anpassung der Protokolle verwendet, um homöostatische Plastizität in Neuronen für die Untersuchung der Plastizität von Astrozyten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu induzieren. Kürzlich verwendet werden, um Veränderungen in Astrozyten Gruppe I mGluRs mit jungen Mäusen zu untersuchen, kann das Verfahren auf die Skalierung der verschiedenen Astrozyten GPCRs zu messen, in Gewebe von erwachsenen Mäusen in situ und in vivo, und ein besseres Verständnis für die...

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Wir beschreiben die Kombination von Brenn UV-induzierten Photoaktivierung von neuro-Wirkstoffe mit Ganzzell Patch-Clamp-und Multi-Photonen-Imaging von intrazellulären Natrium-Transienten in Dendriten und Dornen von Neuronen im Hippocampus bei akuten Gewebeschnitten von Mausgehirn.

Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

Hier beschreiben wir die Setup - Software Navigation, und die Datenanalyse für eine räumlich und zeitlich genaue Methode der tonischen und phasische extrazellulären Glutamat Veränderungen in vivo Messung unter Verwendung von enzymgekoppelten Mikroelektrodenarrays (MEA).

Enzym-basierte Biosensoren Mit Tonic und Phasic Glutamate in der Alzheimer-Maus-Modellen zu messen

Neuronale Erregbarkeit kann durch einen dynamischen Prozess der Endo- und Exozytose von exzitatorischen Ionotropic Glutamat-Rezeptoren moduliert werden. Hier beschriebenen ist ein leicht zugängliche, High-Content Assay zur Quantifizierung der Oberfläche und interne Rezeptor Bevölkerung Pools.

Ein High-Content-Assay für die Überwachung der AMPA Rezeptor Menschenhandel

Wir präsentieren ein Protokoll zur Bewertung des Gleichgewichts zwischen Glutamatfreisetzung und Clearance bei einzelnen kortikostriatalen glutamatergen Synapsen in akuten Scheiben von erwachsenen Mäusen. Dieses Protokoll verwendet den Fluoreszenzsensor iGluu zur Glutamaterkennung, eine sCMOS-Kamera zur Signalerfassung und ein Gerät zur fokalen Laserbeleuchtung.

Einzelne Synapsenindikatoren für Glutamatfreisetzung und Aufnahme in akuten Gehirnscheiben von normalen und Huntington-Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung von in vitro Ca2+ Flussflüssen in Midbrain-Neuronen und deren nachgelagerten Auswirkungen auf Caspase-3 unter Verwendung primärer Maus-Midbrain-Kulturen vor. Dieses Modell kann verwendet werden, um pathophysiologische Veränderungen im Zusammenhang mit abnormalen Ca2+ Aktivität in Midbrain Neuronen zu studieren, und um neue Therapeutika für anti-apoptotische Eigenschaften zu überprüfen.

Quantifizierung von Spontan-Ca2+-Fluxes und ihren nachgelagerten Auswirkungen in primären Maus-Midbrain-Neuronen

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

In dieser Arbeit wird ein intrazellulärer Hochdurchsatz-Calciumfluoreszenz-Assay für 384-Well-Platten beschrieben, um kleine Molekülbibliotheken auf rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu screenen. Das Ziel, der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus, wird in CHO-K1-Zellen exprimiert. Dieser Assay identifiziert Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der gleichen Zellen in einem "Dual-Addition"-Assay.

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Lernen Sie einen Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay zur Untersuchung von NMDA-Rezeptoren in HEK 293 Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Rezeptoraktivität und die Entwicklung neuer Therapien für neurologische Erkrankungen.

Eine Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay, NMDA-Rezeptoren mit Sensibilität für Glycin/D-Serin und Glutamat zu studieren

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