Name: Ableitung und Differenzierung von Eckzahn Eierstock mesenchymalen Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung, Expansion und Differenzierung mesenchymaler Stammzellen aus Eierstockgewebe von Hunden. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Forschung in der Stammzellbiologie und regenerativen Veterinärmedizin.

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Die Autoren erkennen die Hunde Sterilisationsprogramm bei UNESP-FCAV für die freundliche Bereitstellung die Eierstöcke. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von FAPESP (Prozess -Nr. 2013/14293-0) und CAPES unterstützt.

Dieses Experiment wurde mit den Eierstöcken von vier Mischling Hündinnen nach elektiven Eingriffen an einem Eckzahn Sterilisationsprogramm gespendet durchgeführt. Dieses Experiment wurde von der Ethikkommission für Tierversuche UNESP-FCAV (Protokoll Nr. 026991/13) genehmigt.
(1) experimentelle Vorbereitung
<ol><li>Vorbereiten oder 500 mL sterile Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) ohne Kalzium und Magnesium zu kaufen.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Kollagenase ich Lager Lösung durch Mischen von 40 µg des Enzyms in 1 mL des DPBS. Mit einem 0,2 µm Spritze Filter filtern Sie und speichern Sie 2 mL Aliquote bei-20 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie die Nährmedien aus Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) niedrige Glukose mit fetalen Serum 10 % und 1 % der Antibiotika.</li>
	<li>Sterile Materialien sammeln: Scheren und Pinzetten, einer Gewebekultur Kolben, Gerichte, Rohre und 10 mL und 5 mL Pipetten.</li>
	<li>Standardzellen-Kultur-Labor-Geräte verwenden: einen biologischen Sicherheitsschrank (BSC), eine Zelle Kultur Inkubator auf 5 % CO2 und 38 ° C und einer Zentrifuge gesetzt.</li>
	<li>Reinigen die BSC: mit behandschuhten Händen, Sterilisieren sie mit 70 % EtOH, mit UV-Licht.</li>
</ol>2. Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Eierstock
<ol><li>Halten Sie nach der Operation die Eierstöcke mit PBS-Puffer auf dem Eis in einem konischen Rohr, bis zum Eintreffen im Labor.</li>
	<li>Füllen Sie zwei 100 mm Petrischalen mit 10 mL PBS.</li>
	<li>Entfernen Sie die Eierstöcke aus der Tube und übertragen Sie sie auf der ersten Petrischale mit PBS. Waschen Sie sie mit dem Mischen Bewegungen.</li>
	<li>Sanft rufen Sie den Eierstock ab und legen Sie sie in ein anderes Gericht. Mit einer sterilen Pinzette und Schere Hackfleisch das Gewebe in sehr kleine Stücke, etwa 1 mm groß.</li>
	<li>Übertragen der ovariellen Gewebes auf eine 35 mm Petrischale und 2 mL der Kollagenbildung. Hacken Sie das Gewebe ein wenig mehr.</li>
	<li>Legen Sie die Petrischale im Inkubator bei 38 ° C für 3 h und schütteln Sie die Petrischale mit kreisenden Bewegungen alle 20 Minuten.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 3 h die Petrischale aus dem Inkubator.</li>
	<li>Übertragen Sie den Inhalt der Schale auf eine 15 mL-Tube. 5 mL der Erweiterung Medien hinzufügen.</li>
	<li>Invertieren Sie sanft das Rohr vor Zentrifugation. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 2100 X g für 7 min. Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Pellet mit 3 mL Erweiterung Medien.</li>
	<li>Übertragen Sie das Pellet auf eine T25 Flasche. Stellen Sie die Flasche in den Inkubator mit 5 % CO2 bei 38 ° C für 3 h. Hinweis: Der wichtigste Teil des Verfahrens ist es, die Medien nach 3 h Inkubation zu ändern.</li>
	<li>Entfernen Sie die Flasche aus dem Inkubator und entfernen Sie das Medium mit dem restlichen Gewebe. Die Flasche 3 mL frische Erweiterung Medien hinzufügen.</li>
	<li>Wechseln Sie das Medium alle 48 h und beobachten Sie die Flasche für zelluläre Zusammenfluss. Hinweis: Die wichtigsten Schritte des Verfahrens ist in Abbildung 1festzustellen.</li>
</ol>3. Ausbau der mesenchymalen Stammzellen aus dem Eierstock
<ol><li>
Zelle-passage
	<ol>
<li>Wenn die Zellen Zusammenfluss erreicht haben, entfernen Sie das Medium aus der Flasche.</li>
		<li>Waschen Sie die Flasche mit 3 mL PBS. Entfernen Sie die PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 1,5 mL Trypsin und setzen Sie die Flasche in den Inkubator bei 38 ° C für 3 min. klopfen Sie leicht die Flasche, die Zellen zu lösen helfen. Hinweis: Zellen sollten Zusammenfluss ca. 5 - 7 d nach der ersten Beschichtung erreicht.</li>
		<li>3 mL Erweiterung Medien hinzufügen und den Inhalt auf einem konischen Rohr übertragen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 2100 X g für 7 min. Entfernen des Überstands und 1 mL Erweiterung Medien.</li>
		<li>Der Inhalt des Röhrchens sanft zu homogenisieren.</li>
		<li>Nehmen Sie eine Aliquote von 10 µL der Probe durchzuführen Zelle zählen und habe das Rohr mit den Zellen wieder in den Inkubator.</li>
		<li>Platz 10 µL der Mischung in die Hemocytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zählen der Zellen
	<ol>
<li>Verwenden Sie 10 X-Objektiv des Mikroskops und konzentrieren Sie sich auf die Rasterlinien für die Hemocytometer.</li>
		<li>Zählen der Zellen in fünf kleine Quadrate (Abbildung 2).</li>
		<li>Multiplizieren Sie die gezählte Anzahl von 50.000, die Anzahl der Zellen pro Milliliter zu schätzen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Eierstock
Hinweis: Differenzierung Assays wurden nach den Leitlinien in Hill Et Al. durchgeführt. 9.
<ol><li>1.0 x 104 Samenzellen pro Bohrloch in dreifacher Ausfertigung, mit einer 4-Well Kulturschale.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der Erweiterung Medien.</li>
	<li>Schütteln Sie sanft die Schale mit kreisenden Bewegungen.</li>
	<li>Ersetzen Sie nach 24 h die Nährmedien mit den Medien wünschenswert Differenzierung.</li>
	<li>Für osteogene, adipogenen und Chondrogenic Differenzierung, Inkubation der Zellen mit der Induktion-Medien für die 30D, mit Ersatz von Medien wurden alle 3 d. spezifische Differenzierung Kits für jede dieser Proben verwendet.</li>
	<li>Inkubieren Sie für neurogene Abstammung Differenzierung die Zellen für 10d in den Induktion Medien mit Ersatz von Medien jeder 3-d. Die hier verwendeten Medien enthaltenen DMEM niedrige Glukose, 2 mM Valproinsäure, Hydrocortison-1 µM, 10 µM Forskolin, 5 mM Kaliumchlorid, 5 µg/mL Insulin und 200 µM Butylated Hydroxyanisole.</li>
	<li>Für Entoderm Vorstufen 5D im Entoderm Medien gemäß Herstellervorschrift die Reagenz inkubieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie für primordialen Keimzellen Abstammung Zelldifferenzierung die Zellen in den Induktion Medien für 14 d, mit Ersatz von Medien jeder 3-d. Die hier verwendeten Medien enthaltenen DMEM, 10 % FBS, 1 mM Natrium Pyruvat, 10 ng/mL LIF, unwesentlichen Aminosäuren 1 mM, 2 mM L-Glutamin, 5 µg/mL Insulin, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 60 µM Putrescin, 20 µg/mL Transferrin, 10 ng/mL Maus epidermalen Wachstumsfaktor, 1 ng/mL menschlichen grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 40 ng/mL Human glial cell Line-derived Neurotrophic Factor und 15 mg/L Penicillin.</li>
</ol>

<ol><li>Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGazit%2C+Z+%22Handbook+of+Stem+Cells+%282nd+Edition%29%22">Handbook of Stem Cells (2nd Edition)</a>. Atala, A., Lanza, R. , Academic Press. 513-527 (2013).</li>
<li>Zipori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+stem+cells%3A+state+rather+than+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The nature of stem cells: state rather than entity.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).</li>
<li>Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+surface+epithelium%3A+biology%2C+endocrinology%2C+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology.</a> Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).</li>
<li>Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+interconversions+in+normal+ovarian+surface+epithelium+and+ovarian+carcinomas%3A+an+exception+to+the+norm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).</li>
<li>Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+cultures+derived+from+adult+human+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17(2005).</li>
<li>Gong, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-like+cells+established+by+culture+of+adult+ovarian+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice.</a> Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).</li>
<li>Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+and+follicular+renewal+in+the+postnatal+mammalian+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary.</a> Nature. 428 (6979), 145(2004).</li>
<li>Deans, R. J., Moseley, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+biology+and+potential+clinical+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses.</a> Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).</li>
<li>Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-like+stem+cells+in+canine+ovary+show+high+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential.</a> Cell Proliferation. 50 (6), 12391(2017).</li>
<li>Dominici, M. L. B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).</li>
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<li>Kuznetsov, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-colony+derived+strains+of+human+marrow+stromal+fibroblasts+form+bone+after+transplantation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier stellen wir Hinweise darauf, dass MSCs von Eckzahn Eierstockgewebe isoliert werden können die biologische Abfälle nach Ovariectomy gilt. Da viele Zelltypen in den Eierstöcken gefunden werden können, haben wir vorgeschlagen, ein Protokoll, um wählen MSCs basierend auf ihre schnelle Einhaltung der Kunststoff, der Zellen, die wuchs in einem monomolekularen Film mit einer Fibroblasten-ähnliche Morphologie erfolgreich ausgewählt.
Der erste Bericht über die Ableitung von MSCs aus dem Knochenmar...

Die Anzahl der veröffentlichten Studien, die Fokus auf Stammzellen im letzten Jahrzehnt eine Forschungsarbeit, die durch das kollektive Ziel entdecken starke regenerative Medizin Therapien angeheizt hat, erheblich gestiegen ist. Stammzellen haben zwei primäre bestimmende Marker: selbst - Renovierung und Differenzierung. Mesenchymaler Stammzellen sind verantwortlich für regelmäßige Gewebe Umsatz und haben eine eingeschränktere Kapazität der Differenzierung im Vergleich zu embryonalen Stammzellen1. Vor kurzem, zahlreiche Studien belegen eine Vielzahl der Differenzierung der MSCs, und ein Thema in der Diskussion ist, ob Unterschiede zwischen embryonalen und adulten Stammzellen alle2existieren.
Das Ovarium Oberflächenepithel ist ein ohne Commit Schicht von Zellen, relativ weniger differenziert, die beiden epithelialen und mesenchymalen Marker3, behalten die Fähigkeit, sich in verschiedenen Arten von Zellen als Reaktion auf differenzieren ausdrückt Umweltsignale4. Die genaue Lage von Stammzellen im Eierstock ist nicht bekannt; jedoch wurde vorgeschlagen, dass bipotentialen Vorfahren in der Tunica Albuginea zu Keimzellen5führen. Immunologische Untersuchungen haben die Hypothese, dass diese Zellen eine stromale Herkunft6 oder im oder proximalen dem Eierstock Oberfläche7. Da mesenchymaler Stammzellen zahlreiche Rezeptoren zum Ausdruck, die eine wichtige in der Zelle Adhäsion8 bringen Rolle, wurde ein Experiment entwickelt, um die Hypothese zu testen, die Auswahl einer Bevölkerung der Zellen mit schnellen Adhäsion eine Bevölkerung der Zellen deutlich isolieren würde charakterisierbar als mesenchymale in der Natur. Unsere Fraktion berichtete kürzlich, die Ableitung von MSCs von Eierstockgewebe basierend auf ihre Kapazität der Haftung auf die Kunststoffoberfläche der Kulturschale in den ersten 3 h von Kultur, um eine gereinigte Population von Zellen ausstellenden schnelle Haftung9zu erhalten. Hier beschreiben wir die entwickelte Methode für mesenchymale Stammzellen isoliert von der ovariellen Gewebe.

<table><tbody><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Thermo Fisher</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Kolben</td><td>Corning</td><td>CLS3056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Low Glucose Thermo Fisher</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>12484-010</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Adipogenese-Differenzierungskit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1007001</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Chondrogenese-Differenzierungskit</td><td>Thermo</td><td>Fisher A1007101</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Osteogenese-Differenzierungskit</td><td>Thermo</td><td>Fisher A1007201</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Definitive Endoderm Kit</td><td>StemCell</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 2035S</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 2411GA</td><td></td></tr><tr><td>CD90</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1036G</td><td></td></tr><tr><td>CD44</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1041</td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Milipore</td><td>MAB353</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Tubulin&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>MAB1637</td><td></td></tr><tr><td>DDX4</td><td>Invitrogen</td><td>PA5 -23378</td><td></td></tr><tr><td>IgG- FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>STAR80F</td><td></td></tr><tr><td>IgG- FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>STAR120F</td><td></td></tr></tbody></table>

ableitung und differenzierung von eckzahn eierstock mesenchymalen stammzellen

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interesse an mesenchymalen Stammzellen (MSCs) hat im letzten Jahrzehnt aufgrund ihrer einfachen Isolierung, Expansion und Kultur zugenommen. Studien haben vor kurzem die breite Differenzierung Kapazität gezeigt, die diese Zellen besitzen. Der Eierstock stellt einen viel versprechender Kandidat für zellbasierte Therapien, es reich an MSCs ist und, die es ist häufig nach Ovariectomy Operationen als Bioabfall entsorgt. Dieser Artikel beschreibt Verfahren zur Isolierung, Ausbau, und Differenzierung der MSCs abgeleitet aus dem Eckzahn Eierstock, ohne die Notwendigkeit der Zellsortierung Techniken. Dieses Protokoll stellt ein wichtiges Instrument für die regenerative Medizin wegen der breiten Anwendbarkeit dieser höchst differenzierbare Zellen in der klinischen und therapeutischen verwendet.

Mesenchymale Stammzellen isoliert von Eckzahn Eierstock:
Die Eierstöcke MSC Isolierung Verfahren ist in Abbildung 1zusammengefasst. Nach der Operation, Gewebe zu hacken, Kollagenase Verdauung und ein Medienwechsel 3 h nach dem Beginn der Kultur wurde eine vermeintliche MSC Bevölkerung mit schnellen Kunststoff-Klebstoff Eigenschaften von Eckzahn Ovargewebe erfolgreic...

Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung, Erweiterung und Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus Eckzahn Ovargewebe.

Ableitung und Differenzierung von Eckzahn Eierstock mesenchymalen Stammzellen

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mesenchymale Stiele, die aus dem Eierstockgewebe gewonnen werden, zu isolieren, zu erweitern und zu differenzieren. Dieses Experiment wurde mit den Eierstöcken von vier Mongrel-Hündinen durchgeführt, die nach einer Elektivoperation bei einem Hundesterilisationsprogramm gespendet wurden. Dieses Experiment wurde von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren der Sao Paulo State University, FVAC, genehmigt.Repräsentative Ergebnisse. Discussion.Fazit.

derivation-differentiation-canine-ovarian-mesenchymal-stem

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Die Fähigkeit von humanen embryonalen Stammzellen sich selbst zu erneuern und zu differenzieren sich in alle Zelltypen des Körpers lässt vermuten, dass sie großes Versprechen für medizinische Anwendungen und als Recherche-Tool für die Bewältigung grundlegender Fragen in Entwicklung und Krankheit zu halten. Hier bieten wir Ihnen einen kurzen Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen aus Embryonen, die durch immunosurgical Isolierung der inneren...

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

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