Quantifizierung der Pflanze lösliche Protein und verdauliche Kohlenhydrate Inhalt, Verwendung von Mais (Zea Mays) als ein Exemplar
6. August 2018
Die hier beschriebenen Protokolle liefern eine klare und ansprechbar Methodik zur Messung der lösliche Protein und verdaulich (nicht tragende) Kohlenhydratgehalt in Pflanzengeweben. Die Fähigkeit, diese zwei Pflanze Makronährstoffe quantifizieren hat erhebliche Auswirkungen für die Förderung der Felder der Pflanzenphysiologie, ernährungsphysiologischen Ökologie, Pflanze-Pflanzenfresser Interaktionen und Nahrungsnetz Ökologie.
Diese Methode ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der Pflanzenwissenschaften und der Ernährungsökologie, die Konzentrationen von löslichen Proteinen und verdaulichen Kohlenhydraten im Pflanzengewebe genau zu messen. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie eine schnelle und einfache Methode zur Quantifizierung dieser beiden unglaublich wichtigen Makronährstoffe mit hoher Genauigkeit bieten. Diese Techniken haben starke Auswirkungen auf die Ökologie, da pflanzliche Proteine und Kohlenhydrate die Basis der terrestrischen Nahrungsnetze bilden.
Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es mehrere Schritte und einige Techniken gibt, die in einem allgemeinen Labor nicht üblich durchgeführt werden. Wiegen Sie zunächst Replikproben jedes Gewebes in markierte 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ab. Notieren Sie als Nächstes die genaue Masse jeder Probe.
Geben Sie mit einer Mikropipette 500 Mikroliter 0,1 molares Natriumhydroxid in jedes Röhrchen. Schließen Sie die Deckel fest und erhitzen Sie die Tuben 30 Minuten lang. Legen Sie die Schläuche anschließend für 15 Minuten in ein vorgeheiztes Heißwasserbad.
Danach zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 15.000 g. Pipettieren Sie den Überstand in neue, markierte Mikrozentrifugenröhrchen und verwenden Sie dabei für jede Probe eine neue Pipettenspitze. Geben Sie 300 Mikroliter 0,1 molares Natriumhydroxid zum Pellet und wiederholen Sie die Zentrifugation für 10 Minuten.
Entfernen Sie danach den Überstand und geben Sie ihn in die Röhrchen mit dem Überstand aus der ersten Zentrifugation. Um den pH-Wert des Überstands zu neutralisieren, fügen Sie 11 Mikroliter 5,8 molare Salzsäure hinzu. Verwenden Sie Lackmuspapier, um zu bestätigen, dass der pH-Wert ungefähr sieben beträgt.
Geben Sie anschließend 90 Mikroliter 100%ige Trichloressigsäure in jedes Röhrchen. Dann die Röhrchen 30 Minuten lang auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Verwenden Sie vorsichtig eine Vakuumleitung und eine Mikropipettenspitze aus Glas, um die Trichloressigsäure zu entfernen. Achten Sie sehr darauf, das Pellet nicht mit der Saugspitze zu stören. Waschen Sie anschließend das Pellet mit 100 Mikrolitern Aceton, das auf 20 Grad Celsius abgekühlt ist, und lassen Sie das Aceton dann in einem Abzug verdampfen.
Löse das Proteinpellet mit einem Milliliter Natriumhydroxid auf. Zusätzliche Heizrunden, Vortexing und Schallheizung können erforderlich sein. Geben Sie 160 Mikroliter jeder IGG-Standardlösung in dreifacher Ausfertigung auf eine 96-Well-Platte, beginnend mit der Position A1. Geben Sie anschließend in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen 50 Mikroliter jeder Probenlösung in 950 Mikroliter destilliertes Wasser.
Geben Sie dann 60 Mikroliter jeder verdünnten Probe in dreifacher Ausfertigung in die Vertiefungsplatte, beginnend mit der H1-Position. Geben Sie 100 Mikroliter destilliertes Wasser in alle leeren und unbekannten Probenvertiefungen. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 40 Mikroliter Coomassie Brilliant Blue G-250 Proteinfarbstoff in jede Vertiefung der Platte.
Lösen Sie mit einer Nadel alle Blasen, die sich in den Vertiefungen befinden. Lassen Sie die Platte danach fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Verwenden Sie dann ein Mikroplatten-Spektralphotometer, um die Absorptionswerte für jede Vertiefung bei 595 Nanometern aufzuzeichnen.
Wiegen Sie zunächst die Replikate jeder Gewebeprobe in 15-Milliliter-Glasröhrchen ab. Beschriften Sie die Röhrchen und notieren Sie die genaue Masse jeder Probe. Geben Sie anschließend einen Milliliter 0,1 molare Schwefelsäure in jedes Röhrchen und verschließen Sie die Verschlüsse fest.
Legen Sie die Röhren dann für eine Stunde in ein kochendes Wasserbad. Schieben Sie die Röhren zum Abkühlen in ein lauwarmes Wasserbad. Gießen Sie dann den Inhalt der Röhrchen in beschriftete 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Danach zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 15.000 g für 10 Minuten. Verwenden Sie eine Mikropipette, um den Überstand in neu markierte 1,5-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Übertragen Sie mit einer Pipette 15 Mikroliter jeder unbekannten Probe in ein eigenes Reagenzglas.
Geben Sie dann 385 Mikroliter destilliertes Wasser in jedes Röhrchen. Geben Sie in einem Abzug 400 Mikroliter 5% Phenol in jedes Standard- und unbekannte Probenreagenzglas. Geben Sie unmittelbar danach zwei Milliliter Schwefelsäure in jedes Röhrchen.
Achten Sie darauf, die Schwefelsäure an die Oberfläche der Lösung zu geben. Nachdem Sie die Röhrchen 10 Minuten lang inkubiert haben, wirbeln Sie die Röhrchen ein. Inkubieren Sie das Röhrchen dann weitere 30 Minuten.
Übertragen Sie 800 Mikroliter aus jedem Probenröhrchen auf drei 1,5-Milliliter-Halbmikroküvetten aus Polystyrol. Stellen Sie dann das Spektralphotometer auf einen Messwert von 490 Nanometern ein und kalibrieren Sie es mit einer leeren Küvette. Führen Sie abschließend jede Küvette durch das Spektralphotometer und erfassen Sie die Absorption.
Mit Hilfe dieses Protokolls wurden der Gehalt an löslichen Proteinen und verdaulichen Kohlenhydraten von vier verschiedenen Feld- und Zuckermaisgeweben aus drei geografischen Regionen analysiert. Zwischen den Regionen wurden signifikante Unterschiede im Gehalt an löslichen Proteinen beobachtet, so dass für jede Region separate Analysen erforderlich waren. In den verschiedenen Regionen gab es mehrere Unterschiede im Gehalt an löslichen Proteinen und verdaulichen Kohlenhydraten zwischen den Geweben.
In Minnesota variierten die Gewebe nur im Gehalt an löslichen Proteinen, während die Gewebe in North Carolina sowohl in löslichem Protein als auch in verdaulichen Kohlenhydraten variierten. Die Variabilität des Makronährstoffgehalts im Gewebe in Texas hing von der Sorte ab. Diese Technik wird es Forschern auf dem Gebiet der Pflanzenwissenschaften und der Ernährungsökologie ermöglichen, lösliches Pflanzenprotein und verdauliche Kohlenhydrate präzise zu messen, anstatt von elementaren Messungen zu extrapolieren.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Stickstoff, konzentrierten Säuren und Basen äußerst gefährlich sein kann. Verwenden Sie daher immer Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Schutzbrille, Schürzen und geschlossene Schuhe, wenn Sie mit diesen Chemikalien arbeiten.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt Methoden zur Bestimmung löslicher Proteine und verdaulicher Kohlenhydrate in Pflanzengeweben vor. Diese Techniken sind entscheidend für das Verständnis der Pflanzenphysiologie und ökologischer Wechselwirkungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenwissenschaften
- Ernährungsökologie
- Ökologie
Hintergrund
- Die Quantifizierung von Makronährstoffen ist entscheidend für die Untersuchung von Nahrungsnetzen.
- Lösliche Proteine und Kohlenhydrate bilden die Grundlage für terrestrische Ökosysteme.
- Neue Forschende können die Methoden aufgrund der Komplexität als anspruchsvoll empfinden.
- Eine genaue Messung ist für die ökologische Forschung unerlässlich.
Zweck der Studie
- Eine klare Methodik zur Messung von pflanzlichen Makronährstoffen bereitstellen.
- Das Verständnis von Pflanzen-Herbivoren-Interaktionen vertiefen.
- Die Forschung in der Pflanzenphysiologie und Ökologie unterstützen.
Verwendete Methoden
- Wägen Sie Proben von Pflanzengewebe in Wiederholung.
- Verwenden Sie beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen zur Probenaufbewahrung.
- Notieren Sie die genaue Masse jeder Probe.
- Befolgen Sie spezifische Protokolle für genaue Messungen.
Hauptergebnisse
- Die Techniken ermöglichen eine hohe Genauigkeit bei der Bestimmung von Makronährstoffen.
- Die Methoden sind nach der Einarbeitung schnell und einfach anzuwenden.
- Die Ergebnisse haben erhebliche Auswirkungen für ökologische Studien.
- Trägt zu einem besseren Verständnis des pflanzlichen Nährstoffgehalts bei.
Schlussfolgerungen
- Die genaue Bestimmung löslicher Proteine und Kohlenhydrate ist möglich.
- Diese Methoden können die Forschung in verschiedenen ökologischen Bereichen voranbringen.
- Das Verständnis von pflanzlichen Makronährstoffen ist entscheidend für die Dynamik von Nahrungsnetzen.
Häufig gestellte Fragen
Exemplarische Branchenrelevanz
Eine genaue Quantifizierung von pflanzlichen Makronährstoffen unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in der Ernährungsökologie und die mechanistische Risikominderung von Modellen zur Pflanzen-Herbivoren-Interaktion. Die direkte Messung löslicher Proteine und verdaulicher Kohlenhydrate erhöht die Vorhersagesicherheit in Studien zu Nahrungsnetzdynamiken, indem die Abhängigkeit von extrapolierten elementaren Korrelationen verringert wird. Dies ermöglicht eine zuverlässigere Entdeckung translationsbezogener Biomarker und die Entwicklung präklinischer Modelle in pflanzenbasierten Forschungspipelines.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung von Ernährungshypothesen, indem präzise Daten zu löslichen Proteinen und Kohlenhydraten für die Zielvalidierung bereitgestellt werden.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch reproduzierbare Quantifizierung wichtiger pflanzlicher Makronährstoffe über verschiedene Gewebetypen und Anbaugebiete hinweg.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert standardisierte, quantitative Ergebnisse für Assays löslicher Proteine und verdaulicher Kohlenhydrate und ermöglicht so die Bereitschaft und Skalierbarkeit der Assays.
- Operationaler Wert: Stellt durch optimierte Verdauungsschritte und farbmetrische Detektion die Reproduzierbarkeit sicher und erlaubt eine zuverlässige Bewertung von Verbindungen in Screening-Abläufen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet die mineralische Ernährung von Pflanzen mit physiologischen Prozessen und unterstützt die translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung.
- Operativer Wert: Liefert systemrelevante Daten für Ernährungsökologie-Studien und verbessert risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung in der pflanzenbasierten Forschung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in Entdeckungsbiologie-Arbeitsabläufe, indem sie quantitative Daten zu Makronährstoffen liefert, die Hypothesentests und die Aufklärung von Wegen in Modellen der Pflanzen-Herbivoren-Interaktionen unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und biologische Entrisikung durch genaue Messung löslicher Proteine und verdaulicher Kohlenhydrate.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays mittels quantitativer, farbmetrischer Nachweise für den Gehalt an löslichem Protein und Kohlenhydraten.
- Analytik: Erzeugt präzise spektralphotometrische Messungen bei 595 nm (Protein) und 490 nm (Kohlenhydrate), um Bedingungen in verschiedenen Geweben und Regionen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet den pflanzlichen Nährstoffgehalt mit ökologischen Ergebnissen und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern in Studien zur Nahrungsnetzdynamik.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Quantifizierung von Makronährstoffen, die auf verschiedene Pflanzenarten und Forschungskontexte anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei pflanzlichen Nährstoffanalysen, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten in der ökologischen Modellierung.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Quantifizierung löslicher Proteine und Kohlenhydrate.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen bei der Zielvalidierung, kapitalwirtschaftliche Effizienz in der Assay-Entwicklung, reduziertes biologisches Risiko in fortgeschrittenen präklinischen Modellen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung pflanzenbasierter Zielstrukturen basierend auf validierten Makronährstoffprofilen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Pflanzengeweben, farbmetrischen Assays und spektrophotometrischen Analysen.
- Benötigt Instrumente wie Mikrozentrifugen, Wasserbäder, Vortexmischer und Mikroplatten-Spektrophotometer.
- Setzt eine standardisierte Durchführung der Verdauung, Neutralisation und Fällungsschritte über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
- Erfordert Anpassungen je nach unterschiedlichem Pflanzengewebe, Art und geografischer Herkunft.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie den Umgang mit gefährlichen Reagenzien (NaOH, HCl, TCA, Phenol, Schwefelsäure), der strikte Sicherheitsprotokolle erfordert.
