Name: Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen durch geringe Dichte Neutrophilen erzeugt gewonnenen Peritoneal Lavage Fluid vermitteln Tumor Zellwachstum und Anlage (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Erfahren Sie, wie niedrigdichte Neutrophilen aus peritonealem Spülflüssigkeit isoliert werden, um neutrophile extrazelluläre Fallen zu erzeugen, die Tumorzellen einfangen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Tumorzelladhäsion an NETs und liefert Einblicke in die Metastasierung.

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Wir danken Frau J. Shinohara und I. Nidda für technische und kirchliche Arbeit. Wir danken auch, DRS. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina und Kazuya Takahashi für ihre Zusammenarbeit zur Probe Akquisition im OP-Saal. Diese Arbeit wurde durch eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft, Sport und Kultur von Japan und der Japan Society zur Förderung der Wissenschaften (17 K 10606) unterstützt.

LDN wurden Patienten in dieser Studie entnommen und durch die institutionelle Review Board der Jichi Medizinische Universität angenommen wurden.
1. Isolierung von LDN aus Bauchhöhle Lavages und NET Detection
<ol><li>Probe-Übernahme<ol>
<li>Die Infusion 1.000 mL normale sterile Kochsalzlösung direkt in die Bauchhöhle vor Wundverschluss bei Patienten, die aufgrund von Magen-Darm-Malignität Bauch operiert wurden. Hinweis: Proben stammen von Patienten, die eine Gastrektomie, Colectomy oder Ösophagektomie ohne Vorurteile basierend auf Alter oder Geschlecht unterzogen. Kochsalzlösung wurde in einen Behälter überführt und innerhalb einer Minute in den ganzen Unterleib gegossen. Dies wird als eine postoperative peritonealen waschen ohne erhebliche Auswirkungen auf Patienten routinemäßig durchgeführt.</li>
		<li>Lavage der Bauchhöhle ausgiebig für mindestens 1 Minute. Hinweis: Es wird empfohlen, dass die infundierte Flüssigkeit langsam mit der Chirurg Hände gerührt wird, damit die Proben einheitlich sind.</li>
		<li>200 mL Lavage-Flüssigkeit mit vier 50 mL Spritzen zu erholen. Hinweis: Manchmal wird ein Kaltgerätestecker verwendet, um die Flüssigkeiten aufnehmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchführen Sie Reinigung des peritonealen LDN mit Granulozyten spezifische mAb, CD66b16. Hinweis: Da die Zwischenschicht nach Dichte-Gradienten-Zentrifugierung viele MONONUKLEÄRE Zellen enthält, wurde positiver Selektion der polymorphen Neutrophilen mit CD66b mAb durchgeführt.<ol>
<li>Übertragen Sie die peritoneale Lavage-Flüssigkeit auf eine 50 mL-Tube. Hinweis: In diesem Schritt durchlaufen Sie die Flüssigkeiten einen 100 µm Nylon-Filter, um Verunreinigungen zu entfernen.</li>
		<li>Zentrifugieren der peritonealen Flüssigkeit bei 270 X g für 7 min bei RT</li>
		<li>Die Pellets in 5 mL PBS mit 0,02 % EDTA aufzuwirbeln.</li>
		<li>Überlagern Sie sorgfältig die 5 mL Zellsuspension auf eine 3 mL Dichte-Gradienten-Lösung.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 1.700 x g für 15 min bei RT ohne Pausen.</li>
		<li>Ernten Sie ~ 2-3 mL Lösung enthält die Zwischenschichten (Abbildung 1A) mit einer Pipette zu und mischen Sie es mit 10 mL PBS mit 0,02 % EDTA.</li>
		<li>Zentrifugieren der peritonealen Flüssigkeit bei 400 X g für 7 min bei RT und den überstand verwerfen.</li>
		<li>Fügen Sie ein weiteres 10 mL PBS mit 0,02 % EDTA und Zentrifuge bei 270 X g für 7 min bei RT. verwerfen der Überstand.</li>
		<li>Die Zelle-Pellet (1 x 107) in 60 µL Puffer für das magnetische Zelle Trennung Kit auflösen.</li>
		<li>Die Pellets 20 µL des Fc Block hinzufügen und 10 min bei 4 ° c inkubieren</li>
		<li>Fügen Sie 20 µL des Anti-CD66b mit Microbeads konjugierten und eine zusätzliche 10 min bei 4 ° c inkubieren</li>
		<li>Waschen Sie und wieder auszusetzen Sie, die Pellets in 500 µL Puffer MACS.</li>
		<li>Anwenden der Zellsuspension auf eine magnetische Spalte in das Magnetfeld des einen geeigneten Magnetabscheider und durchströmten enthaltenden CD66b(-) Zellen durch Waschen der Spalte mit 15 mL des Puffers zu sammeln.</li>
		<li>Entfernen Sie die Spalte aus der Magnetabscheider und sofort die magnetisch beschrifteten CD66b(+) Zellen fest drücken Sie den Kolben in die Spalte durchspülen. Hinweis: Die CD66b(+)-Zell-Population besteht zum Großteil aus Neutrophilen durch FACS Analyse darauf hinweist, dass > 95 % der CD66(+)-Fraktion sind für CD11b, CD15 und CD16 positiv, sondern negativ für CD14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erzeugung von Netzen<ol>
<li>Nach Zentrifugation bei 270 X g für 7 min bei RT, erneut aussetzen der isolierten LDN (5 x 106) in 1 mL RPMI1640 mit 10 % FCS.</li>
		<li>Kultur der LDN auf einer 6-Brunnen Poly-L-Lysin beschichtete Platte (6 cm Durchmesser) für 2 h bei 37 ° c in 5 % CO2.</li>
		<li>Fügen Sie das grün fluoreszierende gegenfärbung (eine Membran undurchlässig Farbstoff, der Kern und die Chromosomen Beflecken) am die Endkonzentration von 5 µM.</li>
		<li>Die Morphologie der Netze (die extrazelluläre DNA-Bausteine aus der LDN unter Fluoreszenz-Mikroskopie ausgewiesen) sofort zu beobachten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Färbung der Tumorzellen mit rot fluoreszierende Zelle Linker Farbstoff
<ol><li>Bereiten Sie menschlichen Krebs Zell-Linien MKN45, NUGC und OCUM-1.</li>
	<li>Waschen Sie 1 x 107 Zellen mit PBS + 0,02 % EDTA in einem 15 mL-Tube und Zentrifuge bei 270 X g für 7 min bei RT</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der Lösung für Farbstoff Färbung, die Pellets und pipette vorsichtig.</li>
	<li>Lösen Sie 4 µL rot fluoreszierende Zelle Linker Farbstoff in 1 mL der Lösung zum Färben und mischen mit der Zellsuspension aus Schritt 2.2.</li>
	<li>Die Pellets für 4 min bei RT inkubieren</li>
	<li>Fügen Sie 4 mL DMEM (10 % FBS), die Färbung Reaktion zu stoppen.</li>
	<li>270 X g für 7 min zentrifugieren und den überstand verwerfen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.6 und 2.7 zweimal.</li>
	<li>Erkundigen Sie sich bei einem Fluoreszenzmikroskop (Erregung = 551 nm emittieren = 567 nm), dass die Tumorzellen rot gefärbt sind.</li>
</ol>3. Analyse der Tumor Zelladhäsion, Netze
<ol><li>Wieder aussetzen Sie rot fluoreszierende gefärbten Tumorzellen (1 x 106) in 1 mL RPMI 1640 mit 0,1 % BSA ergänzt.</li>
	<li>Fügen Sie die Tumorzellen, die LDN-Kultur, die die Netze hergestellt, wie unter Punkt 1.3 beschrieben.</li>
	<li>Inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° c, wodurch die Tumorzellen, die Netze zu kontaktieren. Hinweis: Lange Inkubationszeit induziert Tumor Zelladhäsion LDN oder an den Platten.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und waschen Sie vorsichtig die Brunnen durch Hinzufügen von 2 mL vorgewärmte Medien (0,1 % BSA + RPMI-1640) und Schwenken die Schüssel.</li>
	<li>Wiederholen Sie der Waschvorgang in Schritt 3.4 zweimal. Hinweis: Seit Netze schwach bis auf den Teller legen, Waschen sollte so schonend wie möglich zu entfernen die Netze selbst erfolgen.</li>
	<li>Fügen Sie die grünen fluoreszierenden Farbstoff zum Färben der Kern und die Chromosomen in eine Endkonzentration von 5 µg/mL für die Visualisierung der Netze.</li>
	<li>Die Netze zu beobachten und an Tumorzellen mit den entsprechenden Filtern (grün, Erregung = 504 nm, emittierende = 523 nm; rot, Erregung = 551 nm, emittierende = 567 nm).</li>
	<li>Zusammengeführt werden die Zahlen, um die Tumorzellen zeigen, die von den Netzen gefangen sind. Hinweis: In einigen Experimenten wurde DNA-Abbau-Enzym die LDN-Kultur (Endkonzentration von 100 U/mL) 5 min vor der Co Inkubation für 5 min hinzugefügt.</li>
</ol>4. Zeit Zeitraffer Video-Analyse der eingeschlossenen Tumorzellen
<ol><li>Kultur der peritonealen LDN in einem 35 mm Runde Schüssel beschichtet mit Poly-L-Lysin wie unter Punkt 1.3 beschrieben.</li>
	<li>Fügen Sie die grünen fluoreszierenden Farbstoff zum Färben der Kern und die Chromosomen, Netze, wie unter Punkt 1.3 beschrieben zu visualisieren.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 1 min Inkubation das Medium und 2 mL 0,1 % BSA + RPMI 1640.</li>
	<li>Entfernen Sie den Datenträger, und fügen Sie ungefärbt 1 x 106 MKN45 Zellen in 0,1 % suspendiert, BSA + RPMI 1640. 5 min bei RT inkubieren</li>
	<li>Entfernen Sie alle ungebunden Tumorzellen durch sanft Waschen wie unter Punkt 3.4 beschrieben und fügen Sie DMEM mit 10 % FCS mit 100 u/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt.</li>
	<li>Montieren Sie der Kulturschale in ein Beobachtungssystem Blick auf ganze Zelle und wählen Sie das entsprechende Feld in welchem, das Tumor Zellen durch die Netze gefangen sind.</li>
	<li>Weiterhin gemeinsam für weitere 2 Tage Kultur und kontinuierliche Fotografieren des Feldes alle 6 min. unter normalem Licht und Fluoreszenz, die MKN45 Zellen und Netze, bzw. erkennt.</li>
	<li>Überlagern Sie die Bilder bei jedem Timepoint und konstruieren Sie Zeitraffer-Videos mit Bild-Viewer-Software.</li>
</ol>

<ol><li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+acute+rheumatic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li>
<li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li>
<li>Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+low+density+subpopulations+and+CD10+%28CALLA%29+negative+neutrophils+in+severely+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients.</a> Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).</li>
<li>Schmielau, J., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+granulocytes+and+granulocyte-derived+hydrogen+peroxide+are+the+underlying+mechanism+of+suppression+of+t-cell+function+in+advanced+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients.</a> Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocytes%3A+a+distinct+class+of+neutrophils+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity.</a> Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2013).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
<li>Monti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+cell+adhesion+to+neutrophil+extracellular+traps+through+engagement+of+fibronectin+in+neutrophil-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells.</a> Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).</li>
<li>Najmeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+via+beta1-integrin+mediated+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions.</a> International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).</li>
<li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Human+Neutrophil+Extracellular+Traps+%28NETs%29+Isolation+and+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
<li>Kanamaru, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+%28LDN%29+in+postoperative+abdominal+cavity+assist+the+peritoneal+recurrence+through+the+production+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).</li>
<li>Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+transgenic+for+the+human+CGM6+gene+express+its+product%2C+the+granulocyte+marker+CD66b%2C+exclusively+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes.</a> Blood. 91 (2), 663-672 (1998).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Frühere Studien haben berichtet, dass die zirkulierenden Tumorzellen durch NET Substrate in Vivo10,11gefangen werden kann. Metastasierendem Brustkrebs-Zellen nachweislich zu stimulieren Neutrophilen und induzieren die Bildung von Netzen, die Zelle Tumorwachstum in die Ziel-Organ-17unterstützt. Darüber hinaus fanden wir, dass kurzfristige Kulturen von LDN aus postoperative Lavage Fluid massive Netze hergestellt, die effizient Tumor...

Polymorphen nuklearen Neutrophilen im Blut zirkulierenden sind in der Regel durch die Art der Dichte-Gradienten Zubereitung von mononukleären Zellen getrennt. Allerdings sind einige Neutrophilen bekannt als Low-Density Neutrophilen (LDN), mit CD11b(+), CD15(+), CD16(+) und CD14(-) Phänotypen, Co gereinigten mit mononukleären Zellen. Die relative Anzahl der LDN erhöht in verschiedenen pathologischen Bedingungen einschließlich Autoimmunerkrankungen1,2, Sepsis3und Krebs4,5. Frühere Studien haben gezeigt, dass LDN eine phänotypisch und funktionell eigene Klasse von Neutrophilen6. Es sei darauf hingewiesen, dass LDN im zirkulierenden Blut sind eher Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs) als normale Dichte Neutrophilen2,7zu produzieren. Netze sind netzartige Strukturen bestehend aus Nukleinsäuren, Histone, Proteasen und körnige und cytosolischen Proteine, und sie können effizient zu fangen und zerstören Krankheitserreger8.
Vor kurzem wurden Netze gezeigt, erfassen nicht nur Mikroben, sondern auch Blutplättchen und zirkulierenden Tumorzellen dem Thrombus Bildung9 und Tumor Metastasen10,11helfen können. Die molekularen Mechanismen hinter der Klebstoffen Interaktionen zwischen Netzen und Blutplättchen oder Tumorzellen sind jedoch noch unklar. In jüngerer Zeit, ein in-Vitro Adhäsion Assay zufolge Netze über β1 und β3 Integrine myeloische Leukämie-Zellen (K56212) und Lunge Karzinomzellen (A54913) zuordnen. Die Autoren verwendeten Netto Lager von Neutrophilen isoliert und durch Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) als die Adhäsion Substrat14aktiviert. Obwohl dieser Assay Erkennung von realen Interaktionen mit NET-Komponenten in das Fehlen von Neutrophilen erlaubt, ist es fraglich ob die molekulare Struktur identisch mit Netzen produziert in behält die "zellfreie Netto Lager" durch High-Speed-Zentrifugation isoliert Vivo. Vor kurzem fanden wir, dass peritoneal Lavage-Flüssigkeit, nach Bauchoperationen viele Reife LDN, enthalten die massive Netze generiert und an Tumorzellen verursacht peritonealen Metastasen15. In dieser Studie untersuchten wir erfolgreich das Anhaften von Tumorzellen intakt Netze ohne physische Manipulation. Hier zeigen wir Details eine Technik, selbstklebende Wechselwirkungen zwischen Netzen und freie Tumorzellen zu erkennen.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare, SCHWEDEN</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>StraightFrom&trade; Vollblut CD66b Mikrobeads</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland</td><td>130-104-913</td><td></td></tr><tr><td>Fc-Block</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS Spüllösung</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stammlösung</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>LS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>MACS Magnetabscheider</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland</td><td>130-042-501</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX grüne Nukleinsäurefärbung 5mM Lösung in DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Rot fluoreszierendes Zellverbinder-Kit für die allgemeine Zellmembranmarkierung</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>P9691</td><td></td></tr><tr><td>Verdünnungsmittel C</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>CGLDIL RPMI1640</td><td></td></tr><tr><td>Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Eagle Mittlerer bis hoher Glukosegehalt (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mol/l-EDTA-Lösung (pH 8,0)</td><td>nacalai tesque, Japan</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassene Regionen</td><td>gibco by life technologies, Mexiko</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin lyophilisiertes Pulver, &ge; 96% (Agarose-Gelelektrophorese)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies Japan</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin Prophylaxe</td><td>InvivoGen, San Diego, CA-USA</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington, Lakewood NJ)</td><td>LS002138</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-beschichtete MIKROPLATTE 6Well</td><td>IWAKI, Japan</td><td>4810-040</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-beschichtete MIKROPLATTE 24Well</td><td>IWAKI, Japan</td><td>4820-040</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszein-Stereomikroskop</td><td>BX8000, Keyence, Osaka, Japan</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Ganzbild-Zellbeobachtungssystem</td><td>Nikon, Kanagawa, Japan</td><td>BioStudio (BS-M10)</td><td></td></tr><tr><td>MKN45 humane Magenkrebszelllinie</td><td>Riken, Tukuba Japan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NUGC-4 humane Magenkrebs-Zelllinie</td><td>Riken, Tukuba Japan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OCUM-1 humane Magenkrebs-Zelllinie</td><td>Osaka City University, Japan</td><td>N/A</td><td>Geschenk von Dr. M.Yashiro</td></tr></tbody></table>

neutrophilenzahl extrazelluläre fallen durch geringe dichte neutrophilen erzeugt gewonnenen peritoneal lavage fluid vermitteln tumor zellwachstum und anlage

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Aktiviert neutrophile Release Neutrophilen extrazelluläre fallen (Netze), die erfassen und Mikroben vernichten können. Neuere Studien legen nahe, dass verschiedene Krankheitsprozesse, wie z. B. Autoimmun-Krankheit, Thrombose und Tumor Metastasen Netze beteiligt sind. Hier zeigen wir eine detaillierte in-Vitro -Technik, um NET Aktivität während das Abfangen von freien Tumorzellen erkennen, die nach Bindung an Netze wachsen. Zunächst sammelten wir niedrige Dichte Neutrophilen (LDN) von postoperativen peritoneal Lavage Fluid von Patienten, die Laparatomien unterzogen. Kurzfristiger Kultivierung von LDN führte zu massiven NET Formation, die mit nuklearen grün fluoreszierende und Chromosom gegenfärbung visualisiert wurde. Nach der Co Inkubation des menschlichen Magen-Krebs-Zell-Linien MKN45, OCUM-1 und NUGC-4 mit den Netzen wurden viele Tumorzellen durch die Netze gefangen. Anschließend die Anlage wurde komplett aufgehoben durch den Abbau von Netzen mit DNase I. Time-lapse Video zeigte, dass Tumorzellen gefangen durch die Netze nicht sterben aber stattdessen wuchs kräftig in einer kontinuierlichen Kultur. Diese Methoden können für die Erkennung von Klebstoff Interaktionen zwischen Netzen und verschiedene Arten von Zellen und Materialien angewendet werden.

In der 2-Stunden-Kultur CD66b(+) LDN peritoneal Lavage Fluid angezeigte Zeichenfolge Strukturen abgeleitet gebeizt mit grün fluoreszierenden Farbstoff für nukleare und Chromosom (Abbildung 1 b), während CD66b(-) MONONUKLEÄRE Zellen nicht (Abbildung 1). Jedoch wenn die LDN-Kulturen mit vorbehandelt wurden 100 U/mL DNase I, die charakteristische Architektur wurde zerstört (Abbildung 1), darauf hinweist...

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode in der menschlichen Low-Density Neutrophilen (LDN), erholte sich von postoperativen peritoneal Lavage Fluid, produzieren massive Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs) und effizient trap freie Tumorzellen, die anschließend wachsen.

Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen durch geringe Dichte Neutrophilen erzeugt gewonnenen Peritoneal Lavage Fluid vermitteln Tumor Zellwachstum und Anlage

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zur Rolle neutrophiler Subpopulationen in der Tumorimmunologie zu beantworten, insbesondere zur mechanischen Beteiligung von extrazellulären Fallen (NETs) von Neutrophilen an der Tumormetastasierung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Visualisierung der adhäsiven Wechselwirkungen von Tumorzellen mit intakten NETs ermöglicht. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie von Krebs.Da NETs, die von spezifischen Neutrofil-Untergruppen abgeleitet sind, die Tumormetastasierung fördern können. Das Verfahren wird von Junko Shoniohara aus unserem Labor demonstriert. Um die Neutrophilen zu gewinnen, infundieren Sie zunächst unmittelbar vor dem Wundverschluss einen Liter normaler steriler Kochsalzlösung direkt in die Bauchhöhle eines Patienten, der sich gerade einer Bauchoperation aufgrund einer gastrointestinalen Malignität unterzogen hat, und spülen Sie die Bauchhöhle mindestens eine Minute lang großflächig.Rühren Sie dann die Kochsalzlösung in der Kavität um und gewinnen Sie mit vier 50-Milliliter-Spritzen 200 Milliliter lavierte Flüssigkeit auf. Im Labor wird die Peritonealspülflüssigkeit

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Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind ein wichtiger angeborenen Immunsystems Mechanismus auf pathogene Bakterien, Pilze und Parasiten zu kämpfen. Hier beschreiben wir Methoden, um neutrophilen Granulozyten aus menschlichem Blut zu isolieren und sie zu aktivieren, um NETs zu bilden. Wir präsentieren Vorbereitung Techniken, um NETs in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Isolierung von Neutrophilen niedriger Dichte (LDNs) aus der Peritonealspülflüssigkeit eines postoperativen menschlichen Patienten. Die so erhaltenen LDNs können in weiteren nachgelagerten Experimenten verwendet werden, um ihre Rolle beim Tumorwachstum und bei der Tumorprogression zu verstehen.

Peritoneale Isolierung von Neutrophilen niedriger Dichte: Eine Technik zur Gewinnung von Neutrophilen niedriger Dichte aus Peritonealspülflüssigkeit unter Verwendung von magnetisch aktivierter Zellsortierung

Dieses Video zeigt die Fluoreszenzfärbung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs), den extrazellulären DNA-Komponenten, die von Neutrophilen ausgestoßen werden. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung der adhäsiven Interaktion zwischen Krebszellen und NETs.

Fluoreszenzmikroskopie von neutrophilen extrazellulären Fallen oder NETs: Eine Technik zur Beobachtung der adhäsiven Interaktion zwischen Krebszellen und NETs

In diesem Video analysieren wir das Postadhäsionsverhalten von Krebszellen, die in neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) gefangen sind, indem wir Neutrophile mit niedriger Dichte und Magenkrebszellen co-kultivieren. Die Zeitraffer-Videoanalyse hilft bei der Überwachung verschiedener zellulärer Ereignisse und der Untersuchung der Rolle von NETs bei pathologischen Zuständen.

Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie von neutrophilen extrazellulären Fallen oder NETs: Eine Technik zur Analyse der Postadhäsionsinteraktion zwischen Krebszellen und NETs

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Erzeugung und Isolierung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs). Neutrophile werden aus peripherem Blut isoliert und mit Phorbolmyristatacetat (PMA) stimuliert, um NETs zu produzieren. Während der Inkubation durchlaufen die Neutrophilen einen Prozess des Zelltods (NETose), um NETs freizusetzen, die aus dekondensiertem Chromatin bestehen, das mit granulären zytoplasmatischen Proteinen gemischt ist.

Eine In-vitro-Technik zur Erzeugung von extrazellulären Fallen für humane Neutrophile

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay, der Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Adhäsion von Krebszellen an neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) nachzuweisen. In den Testvertiefungen gibt es einen bemerkenswerten Anstieg der Anzahl fluoreszenzmarkierter Krebszellen, die an NETs haften, während Wells, die mit DNase behandelt wurden, eine verminderte Adhäsion von Krebszellen an NETs aufweisen.

In-vitro-Adhäsionsassay zum Nachweis der Adhärenz von Krebszellen an extrazellulären Fallen von Neutrophilen

Neutrophile spielen nicht nur eine wichtige Rolle bei der Abwehr des Wirts gegen eindringende Mikroorganismen, sondern sind auch an der Immunüberwachung von Tumorzellen beteiligt. Hier beschreiben wir Techniken im Zusammenhang mit der Isolierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften und Methoden zur Überwachung der Funktion von Anti-Tumor-Neutrophilen in vitro und in vivo.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften

Hier wird ein Protokoll für die Induktion und Analyse von in vitro neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) vorgestellt. Die Quantifizierung von DNA, Cathelicidin (LL37) und Enzymaktivität ergab Daten, die die Variabilität in der Zusammensetzung und Morphologie von NETs zeigen, die durch mikrobielle und chemische Stimuli unter ähnlichen kontrollierten Bedingungen induziert werden.

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, und Immunfluoreszenz wird häufig für ihre Visualisierung verwendet. Es gibt jedoch verschiedene Färbeprotokolle, und in vielen Fällen wird nur eine Art von Gewebe untersucht. Hier etablieren wir ein allgemein anwendbares Protokoll für die Färbung von NETs in Maus und menschlichem Gewebe.

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Wir präsentieren eine automatisierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) unter Verwendung des Lebendzellanalysesystems, gekoppelt mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz.

Echtzeit-Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen in menschlichen Neutrophilen

Dieses definierte Protokoll beschreibt einen Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopie-Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Freisetzung von extrazellulären Traps (NET) bei humanen Neutrophilen in vitro. Die reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften und Kinetik der NET-Freisetzung nach Stimulation mit unterschiedlichen NETosis-Induktoren und ermöglicht die Beurteilung der Pharmakologie von NETosis-Antagonisten.

Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopische Quantifizierung der Freisetzung extrazellulärer Fallen bei humanen Neutrophilen und Bewertung der Pharmakologie von Antagonisten

Erfahren Sie, wie niedrigdichte Neutrophilen aus peritonealem Spülflüssigkeit isoliert werden, um neutrophile extrazelluläre Fallen zu erzeugen, die Tumorzellen einfangen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Tumorzelladhäsion an NETs und liefert Einblicke in die Metastasierung.

Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen durch geringe Dichte Neutrophilen erzeugt gewonnenen Peritoneal Lavage Fluid vermitteln Tumor Zellwachstum und Anlage (Video) | JoVE Journal

Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen durch geringe Dichte Neutrophilen erzeugt gewonnenen Peritoneal Lavage Fluid vermitteln Tumor Zellwachstum und Anlage

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