Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen durch geringe Dichte Neutrophilen erzeugt gewonnenen Peritoneal Lavage Fluid vermitteln Tumor Zellwachstum und Anlage

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zur Rolle neutrophiler Subpopulationen in der Tumorimmunologie zu beantworten, insbesondere zur mechanischen Beteiligung von extrazellulären Fallen (NETs) von Neutrophilen an der Tumormetastasierung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Visualisierung der adhäsiven Wechselwirkungen von Tumorzellen mit intakten NETs ermöglicht. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie von Krebs.

Da NETs, die von spezifischen Neutrofil-Untergruppen abgeleitet sind, die Tumormetastasierung fördern können. Das Verfahren wird von Junko Shoniohara aus unserem Labor demonstriert. Um die Neutrophilen zu gewinnen, infundieren Sie zunächst unmittelbar vor dem Wundverschluss einen Liter normaler steriler Kochsalzlösung direkt in die Bauchhöhle eines Patienten, der sich gerade einer Bauchoperation aufgrund einer gastrointestinalen Malignität unterzogen hat, und spülen Sie die Bauchhöhle mindestens eine Minute lang großflächig

Rühren Sie dann die Kochsalzlösung in der Kavität um und gewinnen Sie mit vier 50-Milliliter-Spritzen 200 Milliliter lavierte Flüssigkeit auf. Im Labor wird die Peritonealspülflüssigkeit durch einen 100-Mikrometer-Nylonfilter in einzelne 50-Milliliter-Röhrchen zur Zentrifugation überführt. Suspendieren Sie die Pellets erneut in 5 Millilitern PBS, ergänzt mit 0,02 % EDTA, und überlagern Sie jede Zellsuspension vorsichtig mit drei Millilitern Dichtegradientenlösung.

Nach der Trennung des Dichtegradienten werden zwei bis drei Milliliter der Zwischenschicht aus jedem Röhrchen entnommen und die Peritonealflüssigkeitsproben in 10 Millilitern frischem PBS plus EDTA pro Röhrchen gewaschen. Mischen Sie die Pellets in 10 Millilitern frischem PBS plus EDTA für eine zusätzliche Wäsche und verdünnen Sie die Zellen auf eine einmalige 10 bis siebte Zellen pro 60 Mikroliter MACS-Pufferkonzentration. Jede unspezifische Bindung wird mit 20 Mikrolitern Fc-Block für 10 Minuten bei vier Grad Celsius blockiert, gefolgt von der Zugabe von 20 Mikrolitern anti-CD66b-Magnetkügelchen.

Nach 10 Minuten bei vier Grad Celsius waschen und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern MACS-Puffer und geben Sie die Zellen in eine Magnetsäule geeigneter Größe innerhalb des Magnetfeldes eines geeigneten Magnetseparators. Wenn alle CD66b-negativen Zellen die Säule durchlaufen haben, geben Sie 15 Milliliter frischen MACS-Puffer in das Säulenreservoir und überführen Sie die Säule aus dem Magnetabscheider in ein neues konisches Röhrchen. Tauchen Sie dann sofort die Säule ein, um das magnetisch markierte CD66b-Positiv in das Rohr zu spülen.

Nach der Zentrifugation werden die isolierten Neutrophilen niedriger Dichte bei einer fünfmal 10 bis sechsten Zellen pro Milliliter Medium, ergänzt mit der FBS RPMI1640-Konzentration, resuspendiert und 1 Milliliter Neutrophile pro Vertiefung auf der mit sechs Vertiefungen Poly-L-Lysin beschichteten Platte ausgesät. Nach zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid färben Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit einer geeigneten fluoreszierenden Membran, undurchlässigem Kern- und Chromosomenfarbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers und beobachten Sie sofort die Morphologie der NETs durch Fluoreszenzmikroskopie. Um die Adhäsion von Tumorzellen an die NETs zu beurteilen, resuspendieren Sie Magentumorzellen, die mit dem kontrastierenden Fluoreszenzfarbstoff gefärbt wurden, bei einem mal 10 bis einem Sechstel pro Milliliter RPMI1640 ergänzt mit 0,1 % Rinderserumalbuminkonzentration und fügen Sie einen Milliliter Tumorzellen zu jeder Vertiefung der Neutrophilenkulturen niedriger Dichte hinzu.

Entfernen Sie nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius den Überstand aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal vorsichtig mit 2 Millilitern vorgewärmtem RPMI1640 Medium, das mit BSA pro Waschgang versetzt wird. Eine fünfminütige Inkubation ist lang genug, um NET-spezifische Bindungen zu erkennen. Geben Sie das erwärmte Medium langsam an die Seite jeder Vertiefung, schwenken Sie die Platte vorsichtig und entfernen Sie den Überstand mit einem Aspirator.

Die NETs und die angehängten Tumorzellen können dann mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden. Für eine Zeitraffer-Videoanalyse der eingeschlossenen Tumorzellen kultivieren und färben Sie die peritonealen Neutrophilen niedriger Dichte in einer 35-Millimeter-Schale, die mit Poly-L-Lysin beschichtet ist, wie demonstriert, gefolgt von einer kurzen Wäsche in zwei Millilitern mit 0,1 % BSA plus RPMI1640. Ersetzen Sie das Medium durch eine x 10 bis sechste ungefärbte Magentumorzellen, die in zwei Millilitern RPMI suspendiert sind, die mit BSA für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur ergänzt sind.

Am Ende der Inkubation spülen Sie die Zellen in zwei Millilitern frischem RPMI, das mit BSA angereichert ist, fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, gefolgt von leichtem Schwenken, um alle nicht anhaftenden Tumorzellen zu entfernen. Ersetzen Sie dann den Überstand durch DMEM, ergänzt mit FBS und Antibiotika, und montieren Sie die Schale in ein Ganzansichts-Zellbeobachtungssystem für die Zeitrafferanalyse des Tumorzellfallens durch die NETs. Nach zweistündiger Kultivierung zeigen CD66b-positive Neutrophile mit niedriger Dichte, die aus der Peritonealspülflüssigkeit stammen, durch grün fluoreszierende Kern- und Chromosomenfärbung Stringstrukturen, während CD66b-negative mononukleäre Zellen dies nicht tun.

Wenn die Neutrophilenkulturen niedriger Dichte jedoch mit 100 Einheiten pro Milliliter DNAse I vorbehandelt werden, werden die charakteristischen Strukturen zerstört, was darauf hindeutet, dass die Strukturen aus extrazellulärer DNA bestehen, die aus den Neutrophilen ausgestoßen wurde. Wenn die Neutrophilen niedriger Dichte auf unbeschichteten Kunststoffplatten kultiviert werden, können viele NET-Cluster beobachtet werden, die im Medium schweben und nur wenige NETs am Boden der Schale befestigt sind. Nach fünfminütiger Inkubation mit einer fluoreszenzmarkierten Magentumorzelllinie heften sich viele Tumorzellen an die Neutrophilen innerhalb der NETs, ein Phänomen, das nach einer Vorbehandlung mit DNAse I nicht beobachtet wird. Ähnliche Adhäsionsmuster werden auch bei anderen Tumorzellen beobachtet.

OKUM-1 und NUGC-4. Interessanterweise verschwinden die NETs zwar allmählich innerhalb weniger Stunden nach längerer Co-Kultur der Tumorzellen, während die Tumorzellen, die von den NETs eingeschlossen werden, nach der NET-Freisetzung stark zu vermehren beginnen. Bei diesem Vorgang ist zu beachten, dass die Spülvorgänge und der Geschirrtransfer besonders vorsichtig durchgeführt werden sollten, da die NETs schwach an der Platte haften.

Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern in verschiedenen Bereichen der biomedizinischen Wissenschaft den Weg, den kausalen Zusammenhang von NETs mit verschiedenen Krankheiten wie Thrombose, systemischem Entzündungsreaktionssyndrom und Autoimmunerkrankungen zu erforschen.