Name: Ein Tissue Culture Modell der Östrogen-produzierenden primäre Bovine Granulosa Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Erfahren Sie die Langzeitkultur primärer boviner Granulosazellen mit Kryokonservierung für reproduktionsbiologische Studien. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung von Hormonproduktion und Zeldichte-Effekten.

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Wir danken für ihre hervorragenden technischen Betreuung und hilfreiche Modifikationen des etablierten Kryokonservierung Technik und Zelle-Kultur-Modells Veronica Schreiter. Darüber hinaus möchten wir danken Maren Anders und Swanhild Rodewald für ihre hervorragenden technischen Betreuung in der nachfolgenden Analyse.

Hinweis: Bovine Eierstöcke wurden von einem kommerziellen Schlachthof erhalten. Die Auflistung der Schlachthof Nebenprodukte erfordert keine ethische Zulassung nach deutschem Recht.
(1) Arbeitsbedingungen und Vorbereitungen
<ol><li>Um Sterilität zu gewährleisten, führen Sie alle Medien und Gewebe Vorbereitung sowie alle Kultur in eine spezialisierte Zelle kulturlabor mit Hilfe einer Laminar-Flow Bank arbeiten.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7.4) mit 0,5 µg/µL Amphotericin für den Transport der Eierstöcke, 100 IE Penicillin und 0,1 mg/mL Streptomycin ergänzt. Hinweis: Die maximale Dauer zwischen Erhalt der Eierstöcke und die GC zu isolieren ist 2 h in diesem Set-up.</li>
</ol>2. Isolierung der bovinen Granulosa Zellen
<ol><li>
Waschen Sie die Eierstöcke mehrmals mit 1 X PBS-Puffer (mit 100 IE Penicillin, 0,1 mg/mL Streptomycin und 0,5 µg/µL Amphotericin), um Blut von der Oberfläche zu entfernen, bevor die Isolierung Schritte ausführen. Ein Becherglas, legen Sie die Eierstöcke im Inneren, füllen Sie ihn mit 1 X PBS, und verwerfen Sie die PBS wieder.
	<ol>
<li>Wiederholen Sie diese Waschschritt 3 – 4 X, bis die Eierstöcke vom restlichen Blut gereinigt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wischen Sie einem Eierstock mit einem Lab Tuch getränkt mit 70 % Alkohol, um mögliche Verunreinigungen zu minimieren.</li>
	<li>Mit einer 3 mL Spritze und ein 18 G-Nadel Aspirieren die GC von kleinen bis mittleren Follikel Punktion (< 6 mm, mit einem Lineal gemessen), und die follikelflüssigkeit in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen zu bündeln. Hinweis: Um die Spritze zu befeuchten, nehmen Sie eine kleine Menge von 1 X PBS (mit 100 IE Penicillin, Streptomycin 0,1 mg/mL und 0,5 µg/µL Amphotericin). Dies hilft, kleine Mengen von follikelflüssigkeit sammeln und verhindert, dass Zellen im Inneren der Spritze kleben.</li>
	<li>Spülen Sie nach Punktion mehrere Follikel die Spritze und Nadel mit 1 X PBS für die Zwischenreinigung.</li>
</ol>3. Kryokonservierung von Zellen
<ol><li>
Verwenden Sie Trypan Blau Färbung und zählen Sie die Zellen unter einem Hemocytometer.
	<ol>
<li>Um die Anzahl der lebensfähigen Zellen bereiten Sie einen Schlauch mit 1,5 µL einer 0,25 % igen Trypan blau Lösung. Hinweis: Die lebenden Zellen ungefärbten bleibt da Trypan blau nur die Zelle Barriere von abgestorbenen Zellen zugreifen kann, die dann blau erscheinen.</li>
		<li>Die Trypan blau Lösung 15 µL Zellsuspension Granulosa hinzufügen und vorsichtig mischen.</li>
		<li>Legen Sie die Mischung in beiden Kammern des einen Hemocytometer. Die Anzahl der lebenden (z.B.ungefärbt) Zellen auf einem großen Platz pro Kammer. Hinweis: Obwohl einige Blutkörperchen gesehen werden kann, können sie anhand ihrer sehr geringen Größe unterschieden werden.</li>
		<li>Berechnen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit dem Mittelwert der beiden Kammer Plätze nach den allgemeinen Richtlinien; der Anteil der lebenden Zellen kann variieren zwischen Eierstöcke aber übersteigt 60 %13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nehmen Sie eine Probe aus dem frisch isolierte Granulosa Zelle Pool als Referenz für die weitere Analyse.
	<ol>
<li>Abhängig von der Zellenzahl des isolierten GC beiseite stellen eine angemessene Zahl von Zellen als Referenzproben für RNA oder DNA-Protein-Vorbereitung. Hinweis: Für RNA isoliert und die anschließende Auswertung der Genexpression reichen 1 x 105 Zellen, während andere späteren Analysen verschiedener, in der Regel höhere Zellzahlen benötigen könnte.</li>
		<li>Legen Sie einen oder mehrere Aliquote der Referenzzellen in einem frischen Rohr und für 1 min bei Raumtemperatur und Höchstgeschwindigkeit (12.000 X g) zu einer Zelle Pellet Zentrifugieren. Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Sofort Schock-Einfrieren der Proben in flüssigem Stickstoff. Speichern der Probe bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Führen Sie folgendermaßen die Kryokonservierung.
	<ol>
<li>Bereiten Sie das einfrierende Medium mit 80 % fetalen Kälberserum (FCS) und 20 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO).</li>
		<li>Um sanft die GC Pellets, Zentrifugieren der GC für 3 min bei Raumtemperatur und 500 X g.</li>
		<li>Den überstand vorsichtig und sanft Aufschwemmen der Zellen in 100 % FCS (z.B. 1 mL) bis keine weitere Zelle Klumpen sind sichtbar.</li>
		<li>Die Zellsuspension 1 Volumen (z.B. 1 mL) des Mediums vorbereitet Einfrieren hinzu und übertragen Sie die Mischung zu einem kryogenen Fläschchen. Hinweis: Die Endkonzentration der Cryo-Schutz Medien werden 90 % FCS und 10 % DMSO.</li>
		<li>Legen Sie die kryogene Fläschchen in einem spezialisierten (im Handel erhältlich) Einfrieren Behälter, der schnelles Gefrieren verhindert. Die Abkühlgeschwindigkeit der Proben sollte-1 ° C/min. Transfer der eiskalten Container in einem-80 ° C Gefrierschrank für mindestens 4 Stunden nicht überschreiten.</li>
		<li>Legen Sie bei längerer Lagerung die kryogenen Fläschchen in ultra-niedrigen Temperaturen Behältern (z.B. Flüssigphase Stickstoff Behälter). Hinweis: Das Protokoll kann hier gestoppt werden, da die Kryokonservierung längeren Lagerung ermöglicht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Vorbereitung von Medien und Kultur-Platten für die Zellkultur
<ol><li>
Mantel Zellplatten Kultur mit 0,02 % Kollagen R. Hinweis: Kollagen R ist essentiell für eine verbesserte Anlage des GC in Kultur bekannt.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 0,02 % Kollagen R Lösung mit gereinigtem Wasser geeignet für Zellkultur.</li>
		<li>Fügen Sie 150 µL pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte (= 2 cm2/gut) und stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche der Kultur mit der Kollagen R Lösung gut abgedeckt ist.</li>
		<li>Lassen Sie die Lösung Trocknen mit dem Deckel offen für ein paar Stunden oder über Nacht in der Laminar-Flow-Haube.</li>
		<li>Wenn die Kultur Platten vollkommen trocken sind, bestrahlen sie mit UV-Licht für 10 – 15 min um Kontamination zu minimieren.</li>
		<li>Bei Bedarf speichern Sie die Platten bei 4 ° C für bis zu 2 Monate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Medien und Ergänzungen für Kultur Arbeit unter einem Laminar-Flow-Haube. Sie müssen für eine erfolgreiche Wiederherstellung der GC nach dem Auftauen sofort verarbeitet werden.</li>
	<li>
Folgenden Medien vorbereiten.
	<ol>
<li>Α-Minimal wesentlichen Medium (α-MEM) mit 2 mM L-Glutamin, Natriumbicarbonat 0.084 %, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL Natriumselenit, 5 µg/mL Transferrin, 10 ng/mL Insulin und 1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren zu ergänzen.</li>
		<li>Darüber hinaus fügen Sie 100 IE Penicillin und 0,1 mg/mL Streptomycin an die Medien. Hinweis: Die Antibiotika, einmal erwärmt, sind stabil für ca. 48 h. Also, aliquoten die gewünschte Menge für den Kultur-Aufbau und geplanten Medien austauschen. Wärmen Sie nur die Medien Aliquote auf 37 ° C in einem Wasserbad vor. Die vorbereiteten Medien können bei 4 ° C nicht länger als 3 Monate gespeichert werden.</li>
		<li>Um Steroid Tätigkeit in kultivierten bovine GC zu induzieren, ergänzen Sie die α-MEM zusätzlich mit 20 ng/mL Follikel – Förderung Hormon (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 und 2 µM Androstendion. Hinweis: Immer ergänzen Sie diese Komponenten kurz vor dem Beginn der Kultur oder Medien Austausch. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen für FSH und IGF-1 Stammlösungen, wie dies die Steroide Tätigkeit beeinträchtigen könnten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Zelle Kultur Arbeit
<ol><li>Tauen Sie die Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 3 – 4 min. schnell auf und übertragen Sie die Zellsuspension in 37 ° C vorgewärmte α-MEM (ohne Hormon Ergänzung). Für die Zentrifugation empfiehlt sich ein Endvolumen von 10 mL.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die GC für 3 min bei Raumtemperatur und bei 500 X g. Verwerfen Sie den überstand. Fügen Sie die vorgewärmte und ergänzte α-MEM und Aufschwemmen der Zellen vorsichtig.</li>
	<li>Samen der GC bei einer Dichte von 1 x 105 oder 1 x 106 Zellen pro Bohrloch in einem Endvolumen von 500 µL. umfassen technische Wiederholungen von mindestens drei Kultur Brunnen pro Zustand.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellkultur im Brutschrank bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 8d.</li>
	<li>Führen Sie ein Datenträgeraustausch jeden zweiten Tag. Ersetzen Sie nur zwei Drittel der Nährmedien, Stress zu reduzieren und die Anpassung der Zellen, um die neuen Medien zu erleichtern. Hinweis: Die GC bilden einen typische Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp nach ein paar Tagen in Kultur und neigen dazu, zusammen zu gruppieren. In der hohen Zelldichte Kultur befinden sich größere Cluster immer häufiger im Vergleich zu der normalen Dichte GC-Kultur (Abbildung 1, linke vs. Rechte Fenster).</li>
</ol>6. nachträgliche Analyse der kultivierten Granulosa Zellen
<ol><li>Steroidhormon Analysen durchführen, die Medien sammeln und frieren sie bei-20 ° C. Verwenden Sie geeignete Methoden, um die Östradiol und Progesteron-Konzentration in der abgebrannten Medien [z. B. Radioimmunoassay (RIA)]14zu analysieren.</li>
	<li>Lösen Sie für die anschließende Analyse der verschiedenen Zielmoleküle (RNA, DNA, Proteine, etc.) die Zellen direkt in der Kulturschale mit einem entsprechenden lysiereinrichtung Mittel wie vom Lieferanten empfohlen. Hinweis: Für die meisten Isolierungsmaßnahmen ist es möglich das Protokoll hier beenden die lysierten Zellen bei-20 ° C bis zu 1 Woche gespeichert werden können. Bei längerer Lagerung sollten die Zellen bei-80 ° c gehalten werden</li>
	<li>Bestimmen die Abschrift Fülle, cDNA zu synthetisieren und spezifische Protokolle durch quantitative Real-Time Polymerase Kettenreaktion (qPCR) Techniken15messen. Eine statistische Auswertung sollten mindestens drei Wiederholungen von verschiedenen Zellkulturen, stammen aus verschiedenen Zelle Vorbereitungen (biologische Wiederholungen) enthalten.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das vorgestellte zellenmodell Kultur stellt ein Tool um Granulosa Zelle Differenzierung in Vitrozu analysieren. Mehrere Studien zeigten, dass eine serumfreie Kultivierung eine Voraussetzung ist für die Aufrechterhaltung Steroid Tätigkeit in kultivierten bovine GC oder GC von anderen Arten8,9. Darüber hinaus verbessert Beschichten der Kulturschale mit Komponenten der extrazellulären Matrix (z.B. Kollagen R)13, die Anlage der Zellen deutlich. Ein weiteres wichtiges Merkmal ist die längere kulturdauer. Vor kurzem wurde nachgewiesen, dass eine langfristige Kultur ausreichend steroidogenic Aktivität und einen ausgewogenen Ausdruck Granulosa Zelle Identität Marker17zu erhalten muss. Es scheint, dass GC erfordern die Zeit zur Wiederherstellung der körperlichen Belastung bei der Isolierung.
Die Medien-Ergänzungen bekannt sind FSH, IGF-1 und Androstendion induzieren Aromatase-Aktivität in kultivierten GC. Vor allem, benötigen Sie die Supplementierung mit Androstendion ist absolut notwendig, als die GC einen Vorläufer für Estradiol Synthese. Dies wurde früher veröffentlichten11,18 , und daher wurde nicht weiter untersucht, während die vorliegende Studie. Allerdings kann eine Anpassung der FSH, IGF-1 und Androstendion Konzentrationen für andere Versuchsanordnungen erforderlich sein.
Die hier beschriebene Kryokonservierung-Technik kann helfen, um die Organisation der Gewebekultur Experimente zu verbessern, indem sie unabhängiger von den unterschiedlichen Versorgung mit Eierstöcken. Nach vorherigen Tests wirkt Kryokonservierung nicht GC Phänotyp oder Steroid-Produktion in Kultur. Auch verraten die Fülle der Marker Transkripte in kultivierten Zellen nicht signifikante Unterschiede vergleichen Proben, aus frisch isolierte Zellen vorbereitet, mit denen zuvor ausgesetzt Kryokonservierung16.
Ein entscheidender Parameter für das gegenwärtige Modell der GC-Kultur ist die Zelle Dichte Beschichtung. Wie die Vertreter Ergebnissegezeigt, induziert die Erhöhung der Dichte Beschichtung bemerkenswerte Veränderungen der physiologischen und molekularen Eigenschaften. Mehrere Gene sind geregelt in einer bestimmten Weise, ähnlich wie die Veränderungen, die durch LH Stimulation in Vivo4,19induziert werden. Die Tatsache, dass eine zunehmende Zelldichte Differenzierung-ähnliche Prozesse in kultivierten bovine GC fahren kann hat akribisch in diesem GC in-vitro- Modell berücksichtigt werden, um widersprüchliche Ergebnisse auf Wiederholungen zu vermeiden. Daher widersprüchliche Ergebnisse mit anderen Studien möglicherweise unterschiedlichen Zelldichten zugeschrieben werden und sollte genauer untersucht werden.
Das Kultur-Modell beschrieben offenbarte hier nicht reagiert, LH, als die Transkripte des Rezeptors LHCGR sind nahe an der Nachweisgrenze liegt. Daher ist eine Simulation der LH-Anstieg gleichermaßen die in-Vivo -Situation induzieren Differenzierung13fehlgeschlagen. Dennoch bietet dieses Modell ein hilfreiches Werkzeug um Estradiol-aktive GC in Primärkultur zu studieren, insbesondere da keine funktionale bovine GC-Linien gibt es derzeit.
Unterschiedliche Behandlungsprotokolle können getestet werden, des gegenwärtigen GC-Kultur-Modells, die dazu beitragen, die um regulatorische Mechanismen der Steroid Produktion oder GC-Differenzierung zu entwirren. Weitere, einzelne Faktoren, die in den Entwicklungsprozessen beteiligt sind, können separat analysiert werden. Daher bietet dieses Kultur-Modell eine Grundlage für viele verschiedene Anwendungen.

Erfolgreichen Eisprung und luteinisierung hängen fein abgestimmt und harmonisch molekulare Veränderungen in verschiedenen somatischen follikulären Zelltypen. Da diese Entwicklungsprozesse Details noch nicht vollständig verstanden sind, ist ein weiterer Klärung erforderlich. In Vivo Ansätze sind aufwendig und kostspielig und vor allem nicht Adresse spezifischen molekularen Mechanismen, die bei Folliculogenesis auftreten. Daher sind Feldstudie in-vitro- Modelle darüber hinaus Einblick in zellulären und molekularen Details bieten musste. Verschiedene Studien beschreiben die Kultur des gesamten Follikel im Rahmen von in-vitro- Befruchtung Techniken1,2,3. Weil Forscher Mechanismen der Differenzierung interessiert sind, konzentrieren sich viele Studien auf follikulären GC. Diese Zellen, die Eizelle direkt zugeordnet sind die Hauptquellen der Östrogen-Produktion und somit eine wichtige Rolle im gesamten Folliculogenesis und luteinisierung4.
Zelle, die Linien der GC aus verschiedenen Arten entwickelt wurden verewigt. Die meisten von ihnen, zeigen jedoch keine ausreichende Steroidhormon Produktion5. Bisher nur eine Zell-Linie von Rindern wurde GC6gegründet, aber diese Linie verlor seine steroidogenic Aktivität nach mehreren Passagen7. Daher seit steroidgenese und vor allem Estradiol Produktion ist ein wesentliches Merkmal der GC-Funktionalität, ist es ratsam, diese Aspekte in Primärzelle Kultur Modelle zu studieren. In früheren Studien wurde gezeigt, dass eine erhebliche Estradiol Produktion nur unter serumfreien Kultur Bedingungen8,9beobachtet werden kann. Weiter ist die Ergänzung einer Vorstufe der Estradiol-Synthese auf, eine weitere Voraussetzung, wie GC nicht das notwendige Enzym zum Ausdruck bringen, das Androstendion10Progesteron umwandeln kann. Darüber hinaus ergab die synergistische Wirkung von FSH und IGF-1-Supplementierung in Vitro eine optimierte Aktivität der Aromatase, das Schlüsselenzym der Estradiol Synthese11. In diesem Protokoll werden auch andere wichtigen Faktoren, die einen erheblichen Einfluss auf die GC-Kultur-Modell beschrieben. Insbesondere hat die Zelle Dichte Beschichtung enorme Auswirkungen auf das Ergebnis des Experiments12. Darüber hinaus konnte eine Kryokonservierung Technik des bovinen GC, der GC Physiologie in Kultur nicht erheblich beeinträchtigt wird hergestellt werden. Diese Technik hilft, die Organisation der Zelle Kultur Arbeit zu verbessern und die bevorzugte Beschichtung Dichte zu optimieren.

<table><tbody><tr><td>PBS Instamed ohne Ca2+, Mg2+</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 182-05</td><td>ursprünglich bei der Biochrom AG gekauft, die heute Teil der Merck-Millipore Company ist; die Kat.-Nr. von Biochrom existiert noch</td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin (10.000 IE / 10.000 &micro; g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2213</td><td>ursprünglich bei der Biochrom AG erworben, die heute Teil der Merck-Millipore Company ist; die Kat.-Nr. von Biochrom existiert noch</td></tr><tr><td>Amphotericin (250 & micro; g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2612</td><td>ursprünglich bei der Biochrom AG gekauft, die heute zur Merck-Millipore Company gehört; die Kat.-Nr. von Biochrom existiert noch 3</td></tr><tr><td>mL Spritze (Omnifix Luer)</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>18 G Nadel</td><td>Roth</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>fötales Kälberserum</td><td>Merck-Millipore</td><td>S 0115</td><td>ursprünglich bei der Biochrom AG erworben, die heute Teil der Merck-Millipore Company ist; die Kat.-Nr. von Biochrom existiert noch</td></tr><tr><td>Kryo-Konservierungsfläschchen (2 mL)</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 89020</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX Zellgefrierbehälter</td><td>Corning</td><td>432004</td><td></td></tr><tr><td>Kulturschale, 24-Well, flacher Boden</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 92424</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen R (0,2 %)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Merck-Millipore</td><td>F 0915</td><td>ursprünglich bei der Biochrom AG erworben, die heute Teil der Merck-Millipore Company ist; die Kat.-Nr. von Biochrom existiert noch</td></tr>: <tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0282</td>, <td>ursprünglich gekauft bei der Biochrom AG, die jetzt Teil der Merck-Millipore Company ist; die Kat.-Nr. von Biochrom existiert noch,</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>, Merck-Millipore</td><td>L 1713</td>, <td>ursprünglich gekauft bei der Biochrom AG, die jetzt Teil der Merck-Millipore Company ist; die Kat.-Nr. von Biochrom existiert noch</td></tr>: <tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1603</td>, <td>ursprünglich gekauft bei der Biochrom AG, die jetzt Teil der Merck-Millipore Company ist; die Kat.-Nr. von Biochrom existiert noch</td></tr>: <tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>gelöst in sterilem</td></tr><tr><td>Wassertransferrin</td>, <td>Sigma</td><td>T1283</td><td>gelöst in sterilem Wasser</td></tr>, <tr><td>Insulin (10 mg/ml)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>gelöst in 1x PBS</td></tr><tr><td>NEA</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0293</td><td>ursprünglich bei der Biochrom AG gekauft, die jetzt Teil der Merck-Millipore Company ist; die Kat.-Nr. von Biochrom existiert noch</td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma</td><td>F4021</td><td>wir bevorzugen eine Stammlösung von 2 & Mikro; g/ml, verdünnt in 0,9 % NaCl</td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Sigma</td><td>I1146</td><td>verwenden wir eine Stammlösung von 2 & Mikro; g/mL, gelöst in 10 mM HCl und 1x PBS mit 1 mg/mL BSA-Androstendion</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>46033</td><td>verwenden wir eine Stammlösung von 10 mM, verdünnt in 100 % Ethanol</td></tr></tbody></table>

ein tissue culture modell der Östrogen-produzierenden primäre bovine granulosa zellen

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Ovarian Granulosa Zellen (GC) sind die Hauptquelle der Estradiol-Synthese. Induziert durch die Schwankung der preovulatorische Luteinisierendes Hormon (LH), Zellen von der Theca und insbesondere der Granulosa Zelle Schicht zutiefst ihre morphologischen, physiologischen und molekularen Eigenschaften verändern und bilden Progesteron produzieren Korpus Luteum, das für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft verantwortlich ist. Zellmodelle Kultur sind wesentliche Instrumente, um die zugrunde liegenden Regulationsmechanismen beteiligt in der Folliculo-luteal Transformation zu studieren. Die vorgestellte Protokoll konzentriert sich auf die Isolierung Verfahren und Kryokonservierung von Rindern GC von kleinen bis mittleren Follikel (< 6 mm). Mit dieser Technik erhalten Sie eine nahezu reine Bevölkerung von GC. Das Verfahren der Kryokonservierung erleichtert Zeit Management der Zellkultur arbeiten unabhängig von einer direkten primäre Gewebe (Eierstöcke) Versorgung. Dieses Protokoll beschreibt ein Serum-freie Zelle Kultur-Modell, das den Estradiol-aktiv-Status des bovinen GC imitiert. Wichtige Voraussetzungen, die notwendig für eine erfolgreiche Steroid-aktive Zellkultur sind im gesamten Protokoll diskutiert. Es wird gezeigt, dass eine konkrete Antwort Erhöhung der Beschichtung Dichte der Zellen induziert werden, wie durch eine veränderte Gen Ausdruck Profil und Hormon-Produktion. Darüber hinaus bietet dieses Modell eine Grundlage für weitere Studien auf GC Differenzierung und andere Anwendungen.

GC vergoldet auf 1 x 105 Zellen/Brunnen Display eine typische Fibroblasten aussehen, wie sie eine Zelle Erweiterung vergleichbar mit Fibroblasten bilden und neigen dazu, Cluster (Abb. 1a und 1 c) zu bauen. Erhöhung der Beschichtung-Dichte von 10-fach bis 1 x 106 Zellen/Well die Morphologie nicht ändern aber mehr zellcluster beobachtet werden (Abbildung 1 b und 1D, Pfeile). Wie bereits in einer früheren Publikation dargestellt verbessert die Kollagen-Beschichtung der Kultur Gerichte weitgehend die Befestigung des Zellen-13.
Anfängliche Kryokonservierung änderte sich nicht wesentlich die physiologischen Eigenschaften der Zellen in der Kultur im Vergleich zu denen direkt aus frisch isolierte Proben kultiviert. Dies wird in Abbildung 2 als die Abschrift Fülle (gemessen durch qPCR) gezeigt, mehrere Marker, die Gene nicht unterscheiden beim Vergleich von kultivierter Zellen entweder gefroren oder frisch isolierte Becken abgeleitet.
Abbildung 3 zeigt repräsentative Ergebnisse der Steroidhormon Analyse (gemessen von RIA) in bovinen GC am normalen vs. high-Density kultiviert. Die Östradiol-Konzentration ist in der High-Density-Kultur im Vergleich zu der normalen Dichte Kultur erheblich gesunken, während die Progesteron-Produktion tendenziell höher.
Eine vergleichende Analyse mehrerer Gene (gemessen durch qPCR) in hoch- vs. normale Dichte Kulturen ergab einen signifikanten Effekt (Abbildung 4). CYP19A1, zentrale Enzym Aromatase Estradiol Biosynthese sowie der Gonadotropin-Rezeptor FSHR, Codierung wurden deutlich nach unten geregelt. Im Gegensatz dazu zeigte die Gene RGS2 und VNN2 eine bedeutende Up-Verordnung. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass bestimmte Prozesse der Zelldifferenzierung induziert werden, indem man die Zelle Dichte Beschichtung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Abbildung 1: kultiviert bovine Granulosa Zellen an Normal (linken Panels) und hohe Zelldichte (richtigen Platten). (a und c) Zellen, die bei einer Dichte von 1 x 105 Zellen/gut kultiviert angezeigt einen typische Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp. (b und d) GC bei einer hohen Beschichtung Dichte (1 x 106 Zellen/na) großzellige Cluster (Pfeile) bilden tendenziell häufiger im Vergleich zu Zellen, die unter einer normalen Dichte (linken) kultiviert. Skalieren von Balken = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Abbildung 2: Vergleich der Zellen kultiviert direkt nach Isolation und Kryokonservierung. Die Zellen wurden bei einer Dichte von 1 x 105 Zellen pro Bohrloch kultiviert. Die Genexpression von mehrere Marker Abschriften wurde ausgewertet und ergab keinen Unterschied zwischen kultivierten Zellen mit oder ohne eine anfängliche Kryokonservierung. Das Boxplot zeigt den Median n = 3. Zweiseitigen Student t-test, p-Werte sind im Preis inbegriffen. Diese Zahl wird vom Baufeld und Vanselow16wiedergegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Abbildung 3: Steroidhormon Konzentration in Granulosa Zellen kultiviert bei verschiedenen Beschichtung dichten. Estradiol (E2) Konzentration verringerte sich deutlich bei GC auf eine hohe Zelldichte, kultiviert wurden während die Konzentration von Progesteron (P4) nur tendenziell höher. Die Hormon-Konzentration wurde für die DNA-Gehalt für verschiedene Zellzahlen normalisieren korrigiert. Der Mittelwert und SEM von n = 3 gezeigt. p &gt; 0,05, zweiseitigen Student t-test. Diese Zahl wird vom Baufeld Et Al. reproduziert. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Abbildung 4: Fülle von funktionell wichtige Transkripte in Granulosa Zellen kultiviert auf einer normalen vs. eine hohe Beschichtung Dichte. Bovine GC kultiviert serumfreien Bedingungen für 8D offenbart eine spezifische Verordnung von mehreren ausgewählten Markergene. Das Boxplot zeigt den Median n = 3 einzelnen Wiederholungen. p &lt; 0,05, zweiseitigen Student t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Eine langfristige Kultur-Modell des bovinen Granulosa Zellen unter serumfreien Bedingungen wird beschrieben. Dieses Modell erlaubt es den Forschern, die Auswirkungen der unterschiedlichen Faktoren und Bedingungen zu studieren, wie verschiedene Beschichtung dichten auf die Merkmale der Östrogen-produzierenden bovine Granulosa Zellen.

Ein Tissue Culture Modell der Östrogen-produzierenden primäre Bovine Granulosa Zellen

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Dieses Zellkulturmodell ermöglicht es uns, Eigenschaften von Östradiol-produzierenden Rindergranulosazellen in vitro zu untersuchen, wie z. B. Schilddrüsenfaktoren oder -bedingungen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Kryokonservierungstechnik, die es ermöglicht, dass die Zellkultur unabhängig von der direkten Gewebezufuhr funktioniert. Das Verfahren wird von Veronica Schreiter, einer Technikerin in meinem Labor, demonstriert.Waschen Sie die Eierstöcke der Rinder vor Beginn der Zellisolierung mit einem Antibiotikum von 1X PBS in einem Becherglas, um Blut von der Oberfläche zu entfernen. Entsorgen Sie das PBS und wiederholen Sie die Wäsche drei- bis viermal, bis die Eierstöcke von jeglichem Blutresten gereinigt sind. Verwenden Sie ein Labortuch, das in 70 % Ethanol getränkt ist, um einen Eierstock abzuwischen.Verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel, um kleine bis mittelgroße Follikel zu punktieren. Und dann aspirieren Sie die Follikelflüssigkeit, die die Granulosazellen enthält. Übertragen Sie die Follikelflüssigkeit in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Nachdem Sie mehrere Follikel punktiert haben, verwenden Sie eine 1X PBS, um die Spritze und die Nadel für die Zwischenreinigung zu spülen, um zu verhindern, dass die Nadel mit Zellen verstopft. Wiederholen Sie den Vorgang mit der Punktion und Aspiration der Follikel, um so viele Zellen wie möglich mit der Follikelflüssigkeit zu erhalten. Um eine angemessene Anzahl frisch isolierter GCs als Referenzproben für RNA-, DNA- und Proteinanalysen beiseite zu legen, legen Sie mehrere Aliquots der Referenzzellen in frische 1,5-Milliliter-Röhrchen.Eine Minute lang bei 12.000 μg bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und befreien Sie die Pellets in flüssigem Stickstoff von Stößen und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Um mit der Kryokonservierung zu beginnen, pelletieren Sie die GCs vorsichtig, indem Sie sie drei Minuten lang bei 500-facher G-Temperatur bei Raumtemperatur zentrifugieren.Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig wieder in 100%igem fötalem Kälberserum (FCS), um alle sichtbaren Klumpen zu entfernen. Fügen Sie dann ein Volumen des zuvor vorbereiteten Gefriermediums hinzu, mischen Sie vorsichtig und geben Sie die Mischung in ein kryogenes Fläschchen. Stellen Sie das Fläschchen in einen speziellen Gefrierbehälter, der ein schnelles Einfrieren verhindert, so dass die Abkühlgeschwindigkeit minus ein Grad Celsius pro Minute nicht überschreitet.Anschließend frieren Sie den Behälter bei minus 80 Grad Celsius für mindestens vier Stunden ein. Tauen Sie die Zellen im kryogenen Fläschchen in einem 37 Grad heißen Wasserbad für drei bis vier Minuten schnell auf und überführen Sie die Zellsuspension in 37 Grad, vorgewärmtes Alpha MEM ohne Hormonzusatz, um ein Endvolumen von 10 Millilitern zu erreichen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 μg bei Raumtemperatur drei Minuten lang.Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie das vorgewärmte ergänzte Alpha MEM zum Zellpellet und suspendieren Sie es vorsichtig wieder. Aussaat der GCs in einer 24-Well-Platte mit einem Endvolumen von 500 Mikrolitern pro Well, wobei darauf zu achten ist, dass Replikate von mindestens drei Wells pro Bedingung enthalten sind. Zum Schluss inkubieren Sie die Zellen acht Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 und fahren dann mit der Zellanalyse fort.Nach der Kultivierung von GCs mit einer normalen Dichte von einer mal 10 bis zur fünften Zelle pro Vertiefung zeigten die Zellen einen fibroblastenähnlichen Phänotyp, der für GCs typisch ist. Zellen, die mit einer hohen Plattierungsdichte von eins mal 10 bis zur sechsten kultiviert wurden, veränderten ihre Morphologie nicht, bildeten aber häufiger große Zellcluster. Nach Kultivierung der Zellen bei einer Dichte von eins mal 10 bis zur fünften zeigte die Genexpression mehrerer ausgewerteter Markertranskripte keinen Unterschied zwischen kultivierten Zellen mit oder ohne initiale Kryokonservierung.Wenn GCs bei hoher Zelldichte kultiviert wurden, nahm die Östradiolkonzentration signifikant ab, während die Progesteronkonzentration im Vergleich zu Zellen, die mit normaler Dichte gezüchtet wurden, zunahm. Rinder-GCs, die acht Tage lang unter serumfreien Bedingungen kultiviert wurden, zeigten einen signifikanten Unterschied in der Regulation mehrerer ausgewählter Markergene in Kulturen mit hoher und normaler Dichte, gemessen mit QPCR. Bei der Verwendung dieses Zellkulturmodells von Östradiol-produzierenden Rindergranulosazellen ist es wichtig, sich an Faktoren zu erinnern, die die Zellphysiologie beeinflusst haben, wie z. B. die Zelldichte.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Behandlungsprotokolle durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, z. B. welche Moleküle oder Signalwege an der Differenzierung der Rindergranulosazellen beteiligt sind. Die Kryokonservierungstechnik ebnete den Weg für eine strukturiertere und organisiertere Zellkulturarbeit und könnte leicht auf andere Spezies übertragen werden.

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