Name: Synthese und Charakterisierung von Plazenta Chondroitin Sulfat (PlCSA) - Targeting Lipid - Polymer Nanopartikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Lernen Sie die Synthese von plazenta Chondroitin Sulfat (plCSA)-targeting Lipid-Polymer Nanopartikeln für gezielte Arzneimittelabgabe. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht die Entwicklung neuer Therapien für Krebs und plazentäre Erkrankungen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom National Key Research und Development Program of China (2016YFC1000402), der National Natural Sciences Foundation (81571445 und 81771617) und Natural Science Foundation der Provinz Guangdong (2016A030313178), unterstützt. X.F. und die Shenzhen Basic Research Fund (JCYJ20170413165233512), X.F.

1. Vorbereitung der Stammlösungen
<ol><li>Bereiten Sie eine wässrige Lösung von 4 % Ethanol durch Verdünnung 4 mL absolutes Ethanol mit 100 mL Reinstwasser. Die Lösung bei 4 ° c Lagern Hinweis: Reinstwasser bezeichnet Wasser ohne Verunreinigungen wie Bakterien, Partikel, Ionen oder Nukleasen. Reinstwasser aus eine Wasseraufbereitungsanlage mit einem Ziel-Widerstand von bis zu 18,2 mΩ·cm, d.h. geringe anionischen Belastung ermittelt.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 1 mg/mL Soja-Lecithin-Stammlösung durch Auflösen von 20 mg Soja-Lecithin in 20 mL der wässrigen Lösung von 4 % Ethanol. Lagern Sie Soja-Lecithin-Stammlösung bei 4 ° c</li>
	<li>Bereiten Sie eine 25 mg/mL DSPE-PEG (2000)-COOH Stammlösung durch Auflösen 100 mg DSPE-PEG-COOH in 4 mL der wässrigen Lösung von 4 % Ethanol. Speichern der Stammlösung bei-20 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 10 mg/mL DOX Stammlösung durch Auflösen von 50 mg in 5 mL Reinstwasser DOX. Speichern Sie die DOX-Stammlösung bei 4 ° C im Dunkeln.</li>
	<li>Bereiten Sie 2 mg/mL durch Auflösen von 20 mg in 10 mL Acetonitril PLGA PLGA-Stammlösung vor. Speichern der PLGA-Stammlösung bei 4 ° C. Achtung: Acetonitril ist brennbar und giftig. Arbeiten mit Sorgfalt in einer Dampfhaube und entsprechende persönliche Ausrüstung, wie Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe aus Latex zu tragen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 0,1 M 2-(morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES, pH 6.0) Stammlösung durch MES 2,17 g in 100 mL hochreines Wasser auflösen. Speichern der Stammlösung bei 4 ° C.</li>
</ol>2. Synthese von DNPs
Hinweis: Zur Vermeidung von DOX photochemischen Abbau wurden alle Vorgänge in der Dunkelheit durchgeführt. Nanopartikel synthetisiert wurden durch eine zuvor gemeldeten Einzelschritt Beschallung Methode11,13,14.
<ol><li>Eine sterile 10 mL Zentrifugenröhrchen 3 mL der wässrigen Lösung von 4 % Ethanol hinzufügen. Fügen Sie dann 90 µg der Vorratslösung Soja Lecithin, 210 µg der DSPE-PEG-COOH Vorratslösung und 750 µg der Vorratslösung DOX bis 3 mL der wässrigen Lösung von 4 % Ethanol.</li>
	<li>Legen Sie die Zentrifugenröhrchen in ein Eisbad, und platzieren Sie das Eisbad auf einem Ultraschall-Prozessor.</li>
	<li>Mit einer 1 mL Spritze pipette 2 mg der PLGA Vorratslösung tropfenweise (1 Tropfen/4-6 s) in die Zentrifugenröhrchen. In der Zwischenzeit, Beschallen Sie die Röhre mit einem Ultraschall-Prozessor bei einer Frequenz von 20 kHz und einer Ausgabe Amplitude von 30 % für 5 min die DNPs synthetisieren. Hinweis: Um einheitliche Partikel mit kleinen Größen zu synthetisieren, muss die Geschwindigkeit bei der PLGA-Lösung in das Röhrchen getropft ist langsam und Blase sollte vermieden werden.</li>
	<li>Reinigen Sie die DNPs durch Waschen die obige Lösung in 0,1 M-MES-Puffer (pH 6.0) 3 Mal mit einer Zentrifuge Filter (MWCO, 10 kDa). Zentrifuge bei 4 ° C und 1000 × g für 3 min jedes Mal. Zu guter Letzt sollte etwa 1 mL der Nanopartikel MES gelöst bleiben. Hinweis: Dies ist eine akzeptable Haltepunkt in der Prozedur. Wenn nicht verwendet, um Peptide zu konjugieren, Nanopartikel können durch PBS-Puffer (pH 7,4) gereinigt werden, und die gereinigten DNPs können bei 4° C im Dunkeln gelagert werden.</li>
</ol>(3) Konjugation von Peptiden, DNPs
<ol><li>
Ester-Aktivierung
	<ol>
<li>Hinzufügen von 0,4 mg von EDC (Endkonzentration 2 mM), 1 mL DNPs.</li>
		<li>Die Reaktion 0,24 mg des NHS hinzufügen (Endkonzentration 2 mM). Hinweis: Für einfache Zugabe der richtigen Menge an EDC und NHS, kann eine Stammlösung hergestellt werden, wenn die Reagenzien sind aufgelöst und sofort verwendet werden.</li>
		<li>Mischen Sie die reaktionskomponenten gut, und legen Sie die Reaktion auf einen Shaker; lassen Sie Reaktion für 30 min - 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amin-Reaktion
	<ol>
<li>Erhöhen Sie den Puffer pH-Wert auf 7.2-7.5 mit PBS (20 ×, pH 7.4).</li>
		<li>Die Reaktionslösung 0,5 mg des PlCSA-targeting Peptids (PlCSA-BP, EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC) hinzufügen. Hinweis: Vor der Zugabe, lösen Sie die Peptide in 20 % Acetonitril auf. Wenn Peptide nicht auflösbar sind, kann Ultraschall in einem Bad sonikator hilfreich.</li>
		<li>Mischen Sie die Lösung gut und dann auf einen Shaker; lassen Sie die Reaktion bei 4 ° C über Nacht im Dunkeln vorzugehen.</li>
		<li>Dialysebeutel (MWCO, 3.500 Da), Dialyse und Reinigen der PlCSA-DNPs conjugate Lösung setzen mit PBS (pH 7,4) Puffer bei Raumtemperatur für 24 h im Dunkeln. Hinweis: Alternativ könnte Reinigung wie in Schritt 2.4 zu PlCSA-DNPs durchgeführt werden.</li>
		<li>Für Zelle Kultur Anwendungen filtern Sie die rekonstituierte Lösung durch einen 0,22 µm sterile Spritze Filter, mögliche Ausscheidungen zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Charakterisierung der PlCSA gezielte Lipid-Polymer Nanopartikel
<ol><li>
Messung der hydrodynamischen nanopartikelgröße verwenden dynamische Lichtstreuung (DLS)
	<ol>
<li>Verdünnen Sie Nanopartikel mit Reinstwasser (50-fold Verdünnung). Laden Sie 500 µL der Probe in eine Küvette gemäß den Anweisungen des DLS oder Zeta potential Instruments. Hinweis: Zeta-Potential und DLS Küvetten können abhängig von dem Instrument den Spezifikationen abweichen.</li>
		<li>Nachdem die Messung abgeschlossen ist, notieren Sie die Partikeldurchmesser, Polydispersität Index (PDI) und Zetapotenzial. Durchschnittliche Ergebnisse von 4 Lesungen wiederholt, und die Standardabweichung zu berechnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) Hinweis: Die Morphologie der Nanopartikel wurde durch TEM mit negativen Fleck-Methode beobachtet. 24<ol>
<li>Verdünnen Sie Nanopartikel mit Reinstwasser (400-fold Verdünnung). Fügen Sie 20 µL der Probe auf ein TEM-Raster hinzu und lassen Sie Sie für 5 Minuten sitzen.</li>
		<li>100 µL von 2 % (w/V) Phosphotungstic Acid und lassen Sie das Droplet für 2 min. Docht entfernt sitzen.</li>
		<li>Trocknen Sie die TEM-Raster bei Zimmertemperatur.</li>
		<li>Legen Sie die Beschleunigungsspannung TEM bei 80 kV, und vergrößern Sie das Bild auf 100.000 ×, die Nanopartikel zu visualisieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bestimmung der Kapselung Effizienz (EE) und LE
	<ol>
<li>Erstellung der Standardkurve. DOX Reinstwasser zur Vorbereitung DOX Lösungen von fünf verschiedenen Konzentrationen zu lösen: 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL und 100 µg/mL. Messen Sie die Absorption der DOX Lösungen bei 480 nm mit einem UV-VIS-Spektrometer. Generieren Sie eine Standardkurve basierend auf die DOX-Konzentrationen.</li>
		<li>Verdünnen Sie 25 µL von Nanopartikeln mit 500 µL ultrareinem Wasser. Messen Sie die Absorption bei 480 nm mit einem UV-VIS-Spektrometer. Berechnen Sie die Droge-Konzentrationen der Standardkurve.</li>
		<li>Berechnen Sie LE, die unter Verwendung der folgenden Gleichung: LE = ((Menge der Medikamente in Nanopartikel) / (Gesamtgewicht Materialien)) × 100 %.</li>
		<li>Berechnen Sie die EE unter Verwendung der folgenden Gleichung: EE = ((Menge der Medikamente in Nanopartikel) / (Menge zugegeben Droge)) × 100 %.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Messung der Konjugation Effizienz mit Hilfe des Bicinchoninic Säuren (BCA) Tests 25 , 26 , 27<ol>
<li>Pipette 25 µL standard Peptid-Lösungen (Tabelle 1) oder PlCSA-DNPs in Mikrotestplatte Vertiefungen in zweifacher Ausfertigung. Jedes gut 200 µL des Reagenz arbeiten hinzu, und mischen Sie die Platte auf einer Platte Shaker für 30 s.</li>
		<li>Die Abdeckplatte, und bei 37 ° C für 30 min inkubieren.</li>
		<li>Messung der Extinktion bei 562 nm auf ein Lesegerät, Platte. Die PlCSA Konzentrationen von PlCSA-DNPs berechnen mithilfe der generierten Standardkurve.</li>
		<li>Berechnen Sie die Konjugation Effizienz unter Verwendung der folgenden Gleichung: Konjugation Effizienz = ((Betrag des Peptids in Nanopartikel) / (Menge zugegeben Peptid)) × 100 %.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Durchstechflasche</td>
			<td>Volumen des Verdünnungsmittels (μL)</td>
			<td>Lautstärke und Quelle des Peptids (μL)</td>
			<td>Final-Peptid-Konzentration (μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>0</td>
			<td>300 Aktien</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>250</td>
			<td>250 der Durchstechflasche einer Verdünnung</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>250</td>
			<td>250 der Ampulle B Verdünnung</td>
			<td>250</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>250</td>
			<td>250 der Durchstechflasche C Verdünnung</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>300</td>
			<td>Es werden 200 von Fläschchen D Verdünnung</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>250</td>
			<td>250 Fläschchen E Verdünnung</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>400</td>
			<td>100 Fläschchen F Verdünnung</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>500</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Vorbereitung der Standard Peptide
(5) Fluoreszenz-Mikroskopie Bewertung der PlCSA gezielt Nanopartikel Aufnahme in Choriocarcinoma (JEG3) Zellen
<ol><li>Zellen auf sterile 12-Well-Platten bei 1.0 × 10 Samen4 Zellen/Brunnen mit kompletten DMEM/F12 (cDMEM/F12, mit 1 % Penicillin/Streptomycin und 10 % fetalen bovine Serum (FBS)). Lassen Sie die Zellen bis zu 60 % Zusammenfluss bei 37 ° C und 5 % CO2 unter feuchten Bedingungen wachsen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Datenträger, und 1 mL kalte frische Medien mit einem niedrigen Serum-Gehalt (5 % FBS) und DNPs oder PlCSA-DNPs (5 µg DOX-Äquivalent).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung aus Zellen und Nanopartikeln bei 4 ° C für 1 h.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Inkubation den Datenträger, und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Dann fügen Sie 1 mL frisch cDMEM/F12, und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 30 min.</li>
	<li>Entfernen Sie die cDMEM/F12, und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL kalten 4 % Paraformaldehyd (PFA) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 15 Minuten, die Zellen zu beheben.</li>
	<li>Entfernen Sie die PFA. Waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS einmal. Fügen Sie 1 mL PBS mit DAPI (1 µg/mL) für Kerne Färbung, und in 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Aspirieren der PBS, und die Zellen dreimal mit PBS waschen.</li>
	<li>Fügen Sie Eindeckmittel und Bild der Fluoreszenz mit einem Fluoreszenz-Mikroskopie, mit grünen und blauen Kanäle um die DOX und Kerne, bzw. zu visualisieren.</li>
</ol>

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<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
<li>Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+TAT+peptide+in+drug+delivery+systems%3A+proteolytic+stability+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements.</a> Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).</li>
<li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+ocular+delivery+to+laser-induced+choroidal+neovascularization+by+dual+internalizing+RGD+and+TAT+peptide-modified+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).</li>
</ol>

X.F. und B.Z. sind die Erfinder das patent PCT/CN2017/108646 und 201710906587.6 Verfasst von SIAT, die eine PlCSA ausgerichtete Nanopartikel-Synthese-Methode und Anwendung abdeckt. Potenzielle Interessenkonflikte wurden von den anderen Autoren bekannt gegeben.

Dieses Protokoll bietet eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Synthese von PlCSA-BP-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel. Die einstufigen Beschallung Methode, Lipid-Polymer Nanopartikel vorzubereiten ist schnelle, reproduzierbare und unterscheidet sich von typischen Nanoprecipitation Methoden, die Heizung, aufschütteln oder Verdunstung betreffen. Die entwickelte Methode reduziert daher die Synthese-Zeit. Darüber hinaus ist die EDC/NHS Bioconjugate in diesem Protokoll verwendeten eine häufig gebrauchte und güns...

Eine wirksame Krebs therapeutische Methode reduziert und beseitigt Tumoren mit minimaler systemischer Toxizität. Daher ist die selektive Tumor targeting der Schlüssel zum erfolgreiche therapeutischen Methoden zu erforschen. Nanopartikel bieten eine vielversprechende Möglichkeit für die Krebstherapie und molekulare Baugruppen mit unterschiedlichen Funktionsgruppen Wirksamkeit von Medikamenten zu verbessern und reduzieren damit verbundenen Nebenwirkungen1,2. Darüber hinaus nutzen Nanopartikel Systeme vor allem passive und aktive targeting um Ziel Tumoren3zu erreichen.
Passive targeting nutzt die angeborenen Eigenschaften von Nanopartikeln und verbesserte Durchlässigkeit und Aufbewahrung (EPR) Effekte, Tumorzellen zu erreichen. Kationische Liposomen sind erfolgreich benutzt worden, Tumore in klinische Anwendungen4,5,6verschiedene Krebsmedikamente anzubieten. Trotz der potenziellen wirksam Krebs therapeutische Wirkung eine geringe Wirkstoffkonzentration in der tumorregion und der Unfähigkeit, Tumorzellen von normalen Zellen zu unterscheiden sind zwei wesentliche Einschränkungen des passiv-targeting Nanopartikel7.
Aktive targeting-Strategien nutzen Sie Antigen-Antikörper, Ligand-Rezeptor und andere molekulare Erkennung Interaktionen gezielt Medikamente an Tumoren8liefern. Plazentar Chondroitinsulfat Glykosaminoglykan (PlCSA) drückt sich im großen und ganzen auf die meisten Krebszellen und Plazenta Trophoblasten. Darüber hinaus können die Malaria Protein VAR2CSA speziell an PlCSA9,10binden. Daher kann VAR2CSA ein Werkzeug für das targeting von menschlichen Krebszellen sein. Wenn VAR2CSA mit Nanopartikeln konjugiert wird, kann das Full-Length Protein jedoch das Eindringen von Nanopartikeln in Tumorzellen einschränken. Kürzlich entdeckten wir eine PlCSA Bindung Peptid (PlCSA-BP), abgeleitet von der Malaria Protein VAR2CSA. PlCSA-BP-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel rasch auf Choriocarcinoma Zellen und deutlich erhöhte Doxorubicin (DOX) Anti-Krebs-Aktivität in Vivo11gebunden; Diese Partikel auch speziell auf Plazenta Trophoblasten gebunden und als ein Instrument für die gezielte Abgabe von Medikamenten auf die Plazenta12dienen könnte.
Lipid-Polymer Nanopartikel bestehen aus einer Lipid-Monolayer-Shell und einer hydrophoben Polymeren Kern und repräsentieren einen neuen Träger für Drug-Delivery. Diese Nanopartikel verbinden die Vorteile von Liposomen und Polymeren darin, z. B. steuerbare nanopartikelgröße hohe Biokompatibilität, nachhaltiger Wirkstofffreisetzung, hohe Medikament laden Effizienz (LE) und ausgezeichnete Stabilität13. In dieser Arbeit haben wir eine einstufigen Beschallung Methode Lipid-Polymer Nanopartikel synthetisieren. Diese Methode ist schnell, bequem und Scale-up geeignet und ist am meisten benutzt Lipid-Polymer Nanopartikel Vorbereiten von unserer Gruppe11,14 u. a.15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide Hydrochlorid (EDC) ist eine beliebte Carbodiimide als ein Vernetzungsmittel für Biomoleküle mit Aminen und Carboxylates19Konjugation verwendet. Neben EDC ist N-Hydroxysulfosuccinimide (NHS) das am weitesten verbreitete Konjugation Reagenz in Oberfläche und Nanopartikel Konjugation Reaktionen20,21. NHS kann reduzieren die Anzahl der Nebenreaktionen und verbessern die Stabilität und Ausbeute an Ester Zwischenprodukte22,23.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Synthese von PlCSA gezielt Lipid-Polymer Nanopartikel. Erstens wird die einstufigen Beschallung Synthese von DOX-geladene Lipid-Polymer-Nanopartikeln (DNPs) beschrieben. Dann wird eine EDC/NHS Bioconjugate Technik zur Erzeugung von PlCSA-BP-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel eingeführt. Diese Bioconjugate Technik kann auch verwendet werden, andere Antikörper und Peptide mit Nanopartikeln zu konjugieren. Schließlich beschreiben wir die physikalisch-chemischen Eigenschaften und in-vitro- Assay verwendet, um die PlCSA ausgerichtete Lipid-Polymer Nanopartikel charakterisieren. Wir glauben, dass diese PlCSA gezielt Lipid-Polymer Nanopartikel ein effektives System für die gezielte Gabe von Medikamenten, um die meisten menschlichen Krebserkrankungen und die gezielte Bereitstellung von Nutzlasten der Plazenta zu plazentare Störungen zu behandeln sein könnte.

<table><tbody><tr><td>plCSA-Peptid</td><td>Shanghai GL Biochem</td><td>573518</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>Sinopharm Chemisches</td><td>10009218</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Sojalecithin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>441601</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-COOH</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td>880125 für die Synthese</td></tr> <tr><td>von NanopartikelnDoxorubicin</td><td>JKKhemische</td><td>113424</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Shanghai Lingfeng</td><td>1008621</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>PLGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>719897</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Ultraschallprozessor</td><td>Sonics</td><td>VCX130</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Zentrifugenfilter (MWCO 10 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>für die Aufreinigung von Nanopartikeln</td></tr>: <tr><td>Zentrifuge</td><td>Sigma</td><td>3-18KS</td><td>für die Aufreinigung von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>: 2-[Morpholino]ethansulfonsäure (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>für die Peptidkonjugation</td></tr>: <tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>für die Peptidkonjugation</td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimid (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td>für die Peptidkonjugation</td></tr><tr><td>Dialysebeutel</td><td>Spectrum</td><td>132592T</td><td>für die Aufreinigung von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td>für Zellkulturen</td></tr><tr><td>10 mL Zentrifugenröhrchen, Polypropylen</td><td>Aladdin</td><td>S-025</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen, Polypropylen</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>für verschiedene Anwendungen</td></tr><tr><td>0,22 μm m steriler Spritzenvorsatzfilter</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td>für die Reinigung von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>1 ml Spritze, Polypropylen</td><td>BD</td><td>328421</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Malvern Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>Nano ZS</td><td>für Partikelgrößenanalyerer</td></tr><tr><td>Phosphowolframsäure</td><td></td><td></td><td>für TEM</td></tr><tr><td>TEM-Gitter</td><td>EMCN</td><td>BZ10024a</td><td>für TEM</td></tr><tr><td>UV-VIS-Spektrometer</td><td>Leagene</td><td>DZ0035</td><td>für TEM</td></tr><tr><td>Transmission Elektronenmikroskop</td><td>JEOL</td><td>JEM-100CXII</td><td>für Partikelgrößenanalyer</td></tr><tr><td>BCA-Reagenz A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23228</td><td>für BCA-Assay BCA-Reagenz</td></tr><tr><td>B</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23224</td><td>für BCA-Assay</td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>für BCA </td></tr><tr><td>Assay Plate Reader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Multiskan&trade; GO</td><td>für BCA-Assay</td></tr><tr><td>12-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>für Zellkulturen</td></tr><tr><td>JEG3-Zellen</td><td>Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften</td><td>TCHu195</td><td>Humane Plazenta</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Hyklon</td><td>SH30272.01</td><td>phenolrotfreies</td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10100</td><td>für Zellkultur</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15070063</td><td>für Zellkultur</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>CKK53</td><td>für die Zellaufnahme</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Shanghai Lingfeng</td><td>1372021</td><td>für die Zellularaufnahme</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sangon Biotech</td><td>A606584</td><td>für die Zelluaufnahme</td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td>Life</td><td>P36961</td><td>für die Zelluaufnahme</td></tr></tbody></table>

synthese und charakterisierung von plazenta chondroitin sulfat (plcsa) - targeting lipid - polymer nanopartikel

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Eine wirksame Krebs therapeutische Methode reduziert und beseitigt Tumoren mit minimaler systemischer Toxizität. Aktiv targeting Nanopartikel bieten einen vielversprechenden Ansatz in der Krebstherapie. Plazentar Chondroitinsulfat Glykosaminoglykan (PlCSA) drückt sich auf einer Vielzahl von Krebszellen und Plazenta Trophoblasten und Malaria Protein, das VAR2CSA speziell an PlCSA binden können. Eine gemeldete plazentar Chondroitinsulfat A Bindung Peptid (PlCSA-BP), abgeleitet von Malaria Protein VAR2CSA, kann auch speziell an PlCSA auf Krebszellen und Plazenta Trophoblasten binden. Infolgedessen konnte PlCSA-BP-konjugiert Nanopartikel als Instrument zur zielgerichteten Wirkstoffabgabe menschlichen Krebserkrankungen und Plazenta Trophoblasten eingesetzt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zu synthetisieren, PlCSA-BP-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel geladen mit Doxorubicin (PlCSA-DNPs); die Methode besteht aus einer einzigen Beschallung Schritt und Bioconjugate Techniken. Darüber hinaus werden verschiedene Methoden zur Charakterisierung von PlCSA-DNPs, einschließlich der Bestimmung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften und zelluläre Aufnahme durch plazentare Choriocarcinoma (JEG3) Zellen beschrieben.

In diesem Protokoll PLGA, DSPE-PEG-COOH und Soja Lecithin sind einer repräsentativen Polymer, Lipid-PEG-COOH Konjugat Lipid, bzw.. Die Synthese von PlCSA gezielt Lipid-Polymer Nanopartikel über einen einstufigen Beschallung Methode und einer EDC/NHS-Technik ist in Abbildung 1dargestellt. Zunächst unter Beschallung Bedingungen, Soja Lecithin, PLGA und DSPE-PEG-COOH selbst zusammensetzen, Form Kern-Schale strukturiert DNPs. Der Kern besteht aus PLGA un...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Synthese von Plazenta Chondroitinsulfat A Bindung Peptid (PlCSA-BP)-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel über einstufigen Beschallung und Bioconjugate Techniken. Diese Partikel bilden ein neuartiges Instrument für die gezielte Bereitstellung von Therapeutika, die meisten menschlichen Tumoren und Plazenta Trophoblasten zur Behandlung von Krebserkrankungen und plazentare Störungen.

Synthese und Charakterisierung von Plazenta Chondroitin Sulfat (PlCSA) - Targeting Lipid - Polymer Nanopartikel

An effective cancer therapeutic method reduces and eliminates tumors with minimal systemic toxicity. Actively targeting nanoparticles offer a promising ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Medikamentenabgabe zu beantworten, wie die gezielte Abgabe von Therapeutika auf menschliche Krebsarten und die Plazenta Cystoblast. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es eine einfache und reproduzierbare Methode ist, Peptide zu synthetisieren, die in anderen Partikeln konjugiert sind. Zunächst drei Millimeter ethanolvon vier Prozent zu einem sterilen 10-Milliliter-Zentrifugenrohr hinzufügen.Fügen Sie dann 90 Mikrogramm Soja-Lecithin-Lagerlösung, 210 Mikrogramm DSPE-PEG-Carbonsäure-Lagerlösung und 750 Mikrogramm DOX-Lagerlösung hinzu. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um zwei Milligramm PLGA-Lagerlösung zu pipette. Das Zentrifugenrohr in ein Eisbad auf einen Ultraschallprozessor legen und zwei Minuten beschallen.Fügen Sie dann die PLGA-Lagerlösung tropfenweise in das Zentrifugenrohr ein. Um die DNPs zu reinigen, verwenden Sie einen Zentrifugenfilter, um die Lösung in 0,1 molem MES-Puffer zu waschen. Dann zentrifugieren Sie die Lösung bei 1000 G für drei Minuten bei vier Grad Celsius.Um die Esteraktivierung zu beginnen, fügen Sie 0,4 Milligramm EDC zu einem Milliliter DNPs hinzu. Dann fügen Sie 0,24 Milligramm NHS zur Reaktion hinzu. Dann lassen Sie die Reaktion für bis zu einer Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln auftreten.Danach die Reaktionskomponenten gründlich mischen und die Reaktion auf einen Shaker legen. Um die Aminreaktion zu starten, verwenden Sie PBS, um den Puffer-pH-Wert von 7,2 auf 7,5 zu erhöhen. Dann fügen Sie 0,5 Milligramm pICSA Targeting Peptid auf die Reaktionslösung.Mischen Sie die Lösung gut und legen Sie sie auf einen Shaker. Dann lassen Sie die Reaktion bei vier Grad Celsius über Nacht im Dunkeln ablaufen. Füllen Sie am nächsten Tag Dialysebeutel mit der Konjugatlösung.Reinigen Sie die pICSA DNPs mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur für 24 Stunden im Dunkeln. Nach der Kultivierung von Zellen gemäß dem Textprotokoll entfernen Sie die Medien und fügen Sie einen Milliliter frischer, kalter Medien mit fünf Prozent FBS und pICSA DNPs oder DNPs hinzu. Dann inkubieren Sie die Zelle und Nano-Partikel-Mischung für eine Stunde bei vier Grad Celsius.Danach entfernen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Dann fügen Sie einen Milliliter frische Medien hinzu und brüten die Zellen für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Danach entfernen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.Dann fügen Sie zwei Milliliter Kälte, vier Prozent PFA und inkubieren sie die Mischung bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entfernen Sie die PFA und waschen Sie die Zellen mit zwei Milliliter PBS. Fügen Sie dann einen Milliliter PBS mit DAPI für die Kernfärbung hinzu.Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 10 Minuten brüten. Fügen Sie schließlich das Montagemedium hinzu und stellen Sie die Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop auf. Mit diesem Protokoll wurden DNPs erfolgreich vorbereitet und mit pICSA BP konjugiert. Nach der Konjugation erhöhte sich der Durchmesser der primären DNPs auf etwa 109 Nanometer.Die TEM-Bilder der DNPs und der pICSA DNPs zeigten, dass die Teilchen gut dispergiert waren und im Allgemeinen sphärische Morphologie zeigten. Das Zeta-Potenzial der Nanopartikel betrug negative 20,1 und 29,9 Millivolt, was darauf hindeutet, dass die Nanopartikel sehr stabil waren. Der JEG3-Zellaufnahmetest zeigte die pICSA DNPs an, die innerhalb von 30 Minuten an die JEG3-Zellen gebunden sind.Daher wurde der pICSA BP effizient an die Oberfläche konjugiert. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Mischung ein bis zwei Minuten lang zu beschallen, bevor Sie PLGA hinzufügen. Nach diesem Verfahren können unsere Methoden wie HPLC-Assay durchgeführt werden, um die Konjugationseffizienz genauer zu bestimmen.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Reproduktionsbiologie, um die Möglichkeit einer Plazenta-Targeting-Behandlung bei Schwangerschaftskomplikationen zu erforschen.

synthesis-characterization-placental-chondroitin-sulfate-plcsa

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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