Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Diese Methode kann helfen, schlüsselnotwendige Fragen der grundlegenden Immunbiologie und entzündlichen Darmerkrankungen Forschung in Bezug auf die Adhäsionskaskade von Immunzellen für homing zu peripheren Organen erforderlich zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es ein bequemer und unkomplizierter Ansatz ist, um funktionale Fragen im Kontext der Zellhaftung unter Strömungsbedingungen zu beantworten. Obwohl diese Methode für die Erforschung des Mechanismus der Zell poietischen Anti-Integrin-Antikörper bei entzündlichen Darmerkrankungen entwickelt wurde, Kann es modifiziert werden, um ähnliche Probleme in anderen entzündlichen Erkrankungen zu analysieren.

Beginnen Sie, indem Sie ein Stück Gummischläuche auf einer Seite mit einer kleinen Schere dehnen, um das Einführen einer rechteckigen Kapillare etwa 0,5 Zentimeter in das Rohr zu ermöglichen. Dann versiegeln Sie die Verbindung mit Paraffinfolie. Beschichten Sie die Kapillare mit 20 Mikrolitern der Adressein von Interesse und versiegeln Sie die Seite, die nicht mit dem Schlauch verbunden ist, mit Kunststoffparaffinfolie für mindestens eine Stunde Inkubation bei 37 Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation die Kunststoff-Paraffinfolie entfernen und die Flüssigkeit aus der Kapillare auf ein Papiertuch einweichen lassen, um die Schläuche zu entleeren. Dann Kapillare mit 20 Mikroliter Blockierlösung für mindestens eine Stunde bei 37 Grad Celsius blockieren. Es ist sehr wichtig, die Blockierung direkt nach dem Entfernen der Beschichtung auf die Kapillare anzuwenden, um ein Austrocknen der Kapillare zu vermeiden, da dies die Funktionalität der kodierten Proteine beeinträchtigen kann.

Während die Kapillare blockiert wird, fügen Sie 18 Milliliter antikoaguliertes Vollmenschliches Blut aus einer 50-Milliliter-Röhre hinzu und verdünnen Sie das Blut auf ein Gesamtvolumen von 35 Millilitern mit PBS. Schicht 10 Milliliter Dichte Gradient medium unter der Blutlösung und isolieren die peripheren Blut mononukleären Blutzellen durch Dichte Gradient Zentrifugation. Übertragen Sie am Ende der Trennung die peripheren mononukleären Blutzellen von der Schnittstelle des Dichtegradientenmediums auf eine neue 50-Milliliter-Röhre.

Und bringen Sie das Gesamtvolumen in der Röhre auf bis zu 50 Milliliter mit frischem PBS. Nach der Zentrifugation das Pellet in 10 Millilitern frischer PBS zum Zählen und Färben der Zellen mit einem geeigneten Zellverfolgungsfarbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers wieder aufsetzen. Am Ende der Färbeininkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und das Pellet 1,5 mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter vollständiger RPMI-Mittlerer Konzentration wieder aufsetzen.

Dann säen Sie einen Milliliter Zellen in so viele Brunnen einer 48-Well-Platte, wie es Bedingungen gibt. Und fügen Sie das entsprechende Volumen an Anti-Integrin-Antikörper in die entsprechenden Brunnen für eine eine Stunde Inkubation bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie als Nächstes eine P1000 Pipette, um die Zellen mehrmals wieder aufzuhängen, bevor die Zellen in einzelne Zwei-Milliliter-Röhren übertragen werden.

Spülen Sie jeden Brunnen mit einem Milliliter PBS und bündeln Sie die Waschungen in den entsprechenden zwei Milliliter-Röhren. Nach dem Zählen pellet die Zellen durch Zentrifugation und resuspened die Zellen in der entsprechenden Volumen des Haftpuffers, um 1,5 mal zehn bis die sechsten Zellen pro Milliliter Suspensionen zu erhalten. Dann fügen Sie das entsprechende Volumen von Manganchlorid zu jedem Rohr zu einer millimolaren Endkonzentration hinzu.

Wenn die Zellen bereit sind, schalten Sie das Mikroskop ein und wählen Sie die entsprechenden Filter und Laser, objektiv und Erfassungsmodus. Entfernen Sie die Kunststoff-Paraffinfolie von der Spitze der Kapillare und verwenden Sie eine Schere, um ein fünf Zentimeter großes Stück Gummischläuche zu dehnen, damit die Kapillare mit dem kleineren Rohr verbunden werden kann. Versiegeln Sie die Verbindung zwischen kapillarund dem Rohr mit Einer Kunststoffparaffinfolie.

Und montieren Sie die Kapillare auf einer Befestigungsschale. Legen Sie das Fach auf den Schalenhalter des Mikroskops, damit die Kapillare im Fokus steht. Und setzen Sie den Gummischlauch in die entsprechende Kerbe der Peristaltikpumpe ein.

Legen Sie das unbefestigte Ende des Schlauches in das erste Probenrohr, das die Zellsuspension enthält. Und legen Sie das kurze Rohr auf der anderen Seite der Kapillare in ein 15-Milliliter-Rohr, um den Durchfluss zu sammeln. Lassen Sie die Schläuche mit einem Durchfluss von 500 Mikrolitern pro Minute füllen, bis die Zellsuspension fast die Kapillare erreicht.

Dann lassen Sie die Kapillare mit einer Durchflussrate von 100 Mikroliter pro Minute füllen. Wenn die Kapillare mit Zellen gefüllt ist, passen Sie die Durchflussrate auf 10 Mikroliter pro Minute an und erfassen Sie Zeitrafferbilder der Zellen, die sich alle zwei Sekunden für insgesamt drei Minuten langsam durch die Kapillare entlang der Innenseite der Adresswand bewegen. Sobald die Zellsuspension das Innere der Kapillare erreicht, ist es wichtig, jede Unterbrechung des Flusses zu vermeiden, da dies zu statischen Integrin-Adressin-Interaktionen führt, die die Messung möglicherweise verzerrt.

Vor dem Entsorgen streamen Sie die gesamte Kapillare durch das Okular des Mikroskops, um sicherzustellen, dass der auf dem Bildschirm beobachtete Abschnitt repräsentativ ist. Befreien Sie die Schläuche von der Pumpe und lassen Sie die verbleibende Flüssigkeit wieder in das Zwei-Milliliter-Rohr laufen. Trennen Sie dann die Kapillare und den Schlauch von der Befestigungsschale und stellen Sie die nächste Kapillare ab, wie gerade gezeigt.

Um die Zeitrafferaufzeichnungen auszuwerten, öffnen Sie die erste Sequenz in der entsprechenden Analysesoftware und exportieren Sie die ersten und letzten drei Bilder als TIFF-Dateien. Öffnen Sie die drei Anfangsbilder in ImageJ, und wählen Sie Bild, Typ und 32-Bit aus, um die Bilder in 32-Bit zu konvertieren. Wählen Sie dann Bild-, Farb- und Zusammenführungskanäle aus, um die Bilder in einem Bild zusammenzuführen, und konvertieren Sie das zusammengesetzte Bild in RGB, um es als TIFF-Datei zu speichern.

Nachdem Sie die letzten drei Bilder auf die gleiche Weise konvertiert haben, zählen Sie die weißen Felder, die am Anfang und am Ende der zusammengesetzten Bilder sichtbar sind. Und subtrahieren Sie die Anzahl der weißen Felder im Anfangsbild von der Anzahl der weißen Felder im Endbild. Die Perfusion von Kapillaren, die mit ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, aber nicht isotype Fc chimäre mit menschlichen PBMCs beschichtet sind, führt zu einer ausgeprägten Haftung, wenn eine der drei Adressen vorhanden ist.

Im Gegensatz dazu führt die Hemmung von Integrin-Adressin-Wechselwirkungen mit neutralisierenden Antikörpern in der Regel zu einer deutlichen Abnahme der dynamischen Haftung, die fehlt, wenn Isotyp-Kontrollantikörper hinzugefügt werden. Darüber hinaus führt die Behandlung von CD4-Human-T-Zellen mit spezifischen Chemokinen zu einer erhöhten Haftung an Adressen im Vergleich zu unbehandelten menschlichen Zellen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, sich daran zu erinnern, dass verschiedene Faktoren zur dynamischen Zellhaftung in vivo beitragen, die in diesem Test nicht vollständig rekapituliert werden kann.

Es ist jedoch möglich, den Test so anzupassen, dass er sehr komplexe Fragen anspricht. Um zusätzliche Fragen zum Differenzhaftverhalten von Testzelltypen zu beantworten, ist es auch möglich, kompetitive Adhäsionstests mit verschiedenen Zelltypen durchzuführen, die mit verschiedenen Zelltracking-Farbstoffen gekennzeichnet sind. Nach seiner Entwicklung ermöglichte uns diese Technik, die Auswirkungen der verschiedenen Anti-Integrin-Antikörper zu erforschen, die für die Behandlung von entzündlichen Darmerkrankungen verwendet werden oder sich derzeit in der Entwicklung befinden.