Name: Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Lernen Sie einen dynamischen Adhäsionsassay zur funktionellen Analyse von Anti-Integrin-Antikörpern bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Immunzelladhäsion unter Flussbedingungen.

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Die Forschung von CN, IA, MFN und SZ wurde unterstützt durch das interdisziplinäre Zentrum für klinische Forschung (IZKF) und der ELAN-Programm der Universität Erlangen-Nürnberg, der Else Kröner-Fresenius-Stiftung, der Fritz-Bender-Stiftung, die deutsche Morbus Crohn und Ulcerosa Foundation (DCCV), die klinische Forschung Gruppe CEDER von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), das DFG-Thema-Programm auf Mikrobiota, Emerging-Feld-Initiative und die DFG Collaborative Research Centers 643, 796 und 1181.

In den folgenden Abschnitten beschriebenen Studien wurden nach Genehmigung der Ethikkommission der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt.
1. Vorbereitung der Kapillaren
<ol><li>Verbinden Sie rechteckige Kapillaren mit den Gummischlauch durch Dehnung des Schlauchs auf der einen Seite mit einer kleinen Schere und sorgfältig Einfügen der Kapillare (ca. 0,5 cm) in die Röhre. Die Verbindung zwischen Kapillare und Schlauch mit Kunststoff Paraffin Film zu versiegeln.</li>
	<li>Beschichten die Kapillare mit 20 µL Bearbeit (rekombinante Fc Chimäre; 5 µg/mL Bearbeit, z.B. MAdCAM-1, in Beschichtung Puffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES)) oder die entsprechenden Isotype-Control-Lösung mit einer Pipette p20 (Flüssigkeit saugt sich in der Kapillare). Dann, die Seite nicht auf das Rohr mit dem Kunststoff Paraffin-Film verbunden verschließen und mindestens 1 h bei 37 ° c inkubieren Verwendung einer Kapillare gefüllt nur mit der Beschichtung-Puffer oder mit dem entsprechenden Isotype-Steuerelement als Negativkontrolle.</li>
	<li>Entfernen Sie den Kunststoff Paraffin-Film von der Spitze der Kapillare, Entleeren Sie die Beschichtung zu, indem man die Flüssigkeit Tränken aus der Kapillare auf ein Papier Handtuch und Block Kapillaren für mindestens 1 h mit 20 µL Lösung (1 X PBS mit 5 % BSA) bei 37 ° c zu blockieren Versiegeln Sie die offene Seite der Kapillare mit Kunststoff Paraffin Film. Entfernen Sie nicht die blockierende Lösung vor der Mikroskopie.</li>
</ol>2. Handy-Isolation, Behandlung und Vorbereitung für die Mikroskopie
Hinweis: Diese Schritte können während der Inkubation Perioden notwendig für die Kapillare Vorbereitung durchgeführt werden.
<ol><li>Sammeln Sie 18 mL Antikoagulanzien volles menschliches Blut mit einer aseptischen Blutentnahme vom cubital Ader der Freiwilligenarbeit Personen (z. B. IBD Patienten und gesunden Kontrollpersonen) nach informierte Zustimmung gemäß den Vorschriften der örtlichen Ethik-Kommission. Hinweis: Dieser Schritt sollte nur von geschulten und erfahrenen medizinischen Personal gemäß den nationalen und/oder lokalen Vorschriften durchgeführt werden.</li>
	<li>Füllen Sie das Blut in ein 50 mL-Tube und auf ein Volumen von 35 mL mit 1 X PBS verdünnen. Dann Unterlage die Blut-PBS-Mischung mit 10 mL der Dichte-Gradienten-Medium.</li>
	<li>Führen Sie Dichte-Gradienten-Zentrifugierung für 15 min bei 800 X g und 24 ° C ohne Bremse, Zellen zu trennen.</li>
	<li>Sammeln Sie die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durch Absaugen der weißen Zellschicht rechts oben auf die Dichte mittlere Verlaufsebene (klare mittlere Schicht). Übertragen Sie PBMCs in einem frischen 50 mL-Tube, füllen Sie bis zu 50 mL mit 1 X PBS und Zentrifuge für 10 min bei 300 x g und 10 ° C.</li>
	<li>Den überstand verwerfen, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL 1 X PBS und anschließend zählen Zellzahlen, z. B. durch die Verwendung einer Neubauer Zelle zählen Kammer.</li>
	<li>Optional: Zur Untersuchung der Haftung der Granulozyten führen die folgenden Schritte. Fahren Sie andernfalls mit Schritt 2.7 oder 2.8.
	<ol>
<li>Die Granulozyten-Schicht (unterste Schicht nach der Dichte Steigung Zentrifugierung, enthält auch die Erythrozyten) zu sammeln. Zellen in 40 mL 1 X PBS aufzuwirbeln. Fügen Sie dann 8 mL 6 % Dextran in 1 X PBS, vorsichtig mischen und lassen Zellen Sediment für 30 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Die Erythrozyten sinkt auf den Boden des Rohres, während die Granulozyten werden in der Schwebe bleiben.</li>
		<li>Nach 30 min. Überstands sammeln, übertragen in eine frische 50 mL-Tube und Zentrifuge für 6 min bei 300 x g und 4 ° C. Den überstand verwerfen und lösen Sie die verbleibenden Erythrozyten durch Zugabe von 5 mL 0,2 % NaCl in DdH2O. Inkubation für 1 min.</li>
		<li>Geben Sie 5 mL 1,4 % NaCl in DdH2O und eine weitere Minute inkubieren. Stoppen Sie die hypotone Lyse durch Zugabe von 20 mL 1 X PBS und Zentrifuge für 6 min bei 300 X g und 4 ° C.</li>
		<li>Die Zelle Pellet in 10 mL 1 X PBS aufzuwirbeln. Dann zählen Sie Zellzahlen mithilfe einer Neubauer Zelle zählen Kammer.</li>
	</ol></li>
	<li>Optional: Um das Anhaften von PBMC Teilmengen zu studieren, zu reinigen, verschiedene Zelltypen oder Teilmengen (z. B. CD4+ und CD8+ T Zellen oder CD19+ B Zellen) mit Microbeads laut Protokoll des Herstellers oder durch Fluoreszenz-aktivierte cell sorting (FACS). Fahren Sie andernfalls mit Schritt 2,8.</li>
	<li>Zentrifugieren der Zellsuspension für 10 min bei 300 x g und 10 ° C. Verwerfen Sie den überstand und beflecken Sie Zellen mit Cell tracking Farbstoff (z. B. CFSE) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Anschließend die Zellen für 10 min bei 300 X gZentrifugieren und überstand verwerfen. In 1 X PBS aufzuwirbeln Sie, bestimmen Sie die Anzahl von Zellen und Zentrifuge wieder für 10 min bei 300 X g.</li>
	<li>Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der gefärbten Zelle Pellet in die entsprechende Menge an Haftung Puffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) um eine Suspension von 1,5 x 106 Zellen/mL zu erhalten. Fügen Sie dann den entsprechenden Betrag von 100 mM MnCl2 , eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten. Hinweis: Diese Zellen sind nun bereit für die Mikroskopie.</li>
	<li>Optional: Behandlung von Zellen mit Zytokine, Antikörper oder andere Verbindungen zu neutralisieren. Fahren Sie andernfalls mit Schritt 3.
	<ol>
<li>Überspringen Sie Schritt 2.10 und Aufschwemmen der gefärbten Zelle Pellet aus Schritt 2,9 in RPMI Medium (mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin), eine Konzentration von 1,5 x 106 Zellen/mL zu erhalten.</li>
		<li>Pipette 1 mL dieser Zellsuspension in möglichst viele Vertiefungen einer 48-Well-Platte, da gibt es Bedingungen analysiert werden. Bereiten Sie immer einen Brunnen mit unbehandelten Zellen durch eine unbeschichtete Kapillare als Negativkontrolle durchblutet werden und einen Brunnen mit unbehandelten Zellen durch eine Kapillare Bearbeit beschichtet als Positivkontrolle durchblutet werden.</li>
		<li>Für die Behandlung mit Anti-Integrin-Antikörpern die entsprechende Menge des Antikörpers (z.B. 10 µg/mL Vedolizumab) hinzufügen der Zellsuspension. 1 h bei 37 ° c inkubieren Fügen Sie für die Behandlung mit Zytokinen die entsprechende Menge an rekombinanten Zytokine (z. B. 10 ng/mL CXCL10 hinzu), die Zellsuspension. 5 min bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Ernten Sie nach der Inkubation Zellen durch resuspending Zellen mehrmals mit Hilfe einer Pipette p1000. Übertragen Sie Zellen in einer 2 mL-Tube, mit 1 mL 1 X PBS wieder gut spülen Sie ab und fügen Sie der 2 mL Tube hinzu. Bestimmen Sie die Anzahl von Zellen. Hinweis: Inkubation von adhärente Zell-Populationen (z. B. Monozyten) erfordern zusätzliche Maßnahmen (z. B.., Behandlung mit Trypsin), Zellen von der Platte zu lösen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zentrifuge Zellen für 10 min bei 300 X g bei 10 ° C. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in die entsprechende Menge an Haftung Puffer, eine Suspension von 1,5 x 106 Zellen/mL zu erhalten. Fügen Sie dann den entsprechenden Betrag von 100 mM MnCl2 , eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten. Bei Vorbehandlung mit Chemokine keine hinzu MnCl2 der Zellsuspension. Diese Zellen sind nun bereit für die Mikroskopie. Hinweis: Das Mindestvolumen für den Assay verwendet ist abhängig von der Pumpe und Schlauch verwendet. In dieser Studie, die mit Hilfe der peristaltischen Pumpe und den Schlauch in die Tabelle der Materialienangegeben war ein Mindestvolumen von 400 µL erforderlich. Wenn gewünscht und (je nach Zelltyp und Ertrag) Anwendung, kann die Zellkonzentration in der Suspension erhöht werden, um höhere Haftung in kürzerer Zeit zu messen.</li>
	<li>Mögliche Änderung: wettbewerbsfähige dynamische Adhäsion Assay
	<ol>
<li>Führen Sie die oben genannten Schritte mit verschiedenen Zell-Populationen (z. B. regulatorische und T-Effektorzellen isoliert durch magnetische Wulst Isolierung nach Anweisungen des Herstellers entsprechend Schritt 2.7) miteinander verglichen werden.</li>
		<li>Färben Sie jedes Volk mit einem anderen Farbstoff (z. B. CFSE und FarRed), wie beschrieben 2,8-2,9, Zell-Populationen während Mikroskopie unterscheiden zu können.</li>
		<li>Verwerfen Sie den überstand und Aufschwemmen Sie der gefärbten Zelle Pellets in die entsprechende Menge an Haftung Puffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) um eine Suspension von 1,5 x 106 Zellen/mL zu erhalten.</li>
		<li>Mischen Sie gleiche Volumina von Zellsuspensionen (z. B. 500 µL der regulatorischen T-Zellen) und 500 µL T-Effektorzellen zu einem Finale gemischt Zellkonzentration von 1,5 x 106 Zellen/mL. Fügen Sie dann den entsprechenden Betrag von 100 mM MnCl2 , eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten. Solcher Suspensionen können anschließend für Wettbewerbsanalyse der Klebevorgang durch verschiedene Zell-Populationen durch die gleichen Kapillare Vorrichtung verwendet werden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. live Cell Imaging der dynamischen Adhäsion
<ol><li>Schalten Sie das Mikroskop und wählen Sie den entsprechenden Filter oder laser-tracking-Dye(s) (z. B. 488 nm Laser für CFSE-), eine geeignete Ziel (z. B. 40 X) und eine Übernahme-Modus ermöglicht Zeit verfallen Bildgebung Zelle zu begeistern.</li>
	<li>Entfernen Sie den Kunststoff Paraffin-Film von der Spitze der Kapillare und verbinden Sie die Kapillare mit einem kurzen Stück Schlauch (ca. 5 cm Länge) durch Dehnung des Schlauchs auf der einen Seite mit einer kleinen Schere und sorgfältig Einfügen der Kapillare (ca. 0,5 cm) in die Röhre. Die Verbindung zwischen Kapillare und Schlauch mit dem Kunststoff Paraffin-Film zu versiegeln.</li>
	<li>Montieren Sie die Kapillare auf einem Tablett Fixierung (z.B. Deckel von einer 6-Well-Platte mit einem rechteckigen Ausschnitt etwas kürzer als die Länge der Kapillare) und platzieren Sie die feste Kapillare auf dem Tablett-Halter des Mikroskops, so dass die Kapillare im Fokus und bereit ist für die Mikroskopie.</li>
	<li>Stecken Sie den Gummischlauch in die entsprechende Kerbe der peristaltischen Pumpe und stecken Sie das Ende nicht an der Kapillare in das entsprechende Probenröhrchen, enthält die Zellsuspension angefügt. Stecken Sie den kurzen Schlauch auf der anderen Seite der Kapillare in ein 15 mL-Tube, Flow-through zu sammeln.</li>
	<li>Lassen Sie die Schläuche füllen mit einem Durchsatz von 500 µL pro Minute bis die Zellsuspension fast die Kapillare erreicht. Dann lassen Sie die Kapillare Füllung mit einer Durchflussmenge von 100 µL/min. Hinweis: Eine schnelle Füllung der Kapillare sorgt für eine gleichmäßige Verteilung der Zellsuspension innerhalb der Kapillare.</li>
	<li>Wenn die Kapillare mit der Zellsuspension gefüllt ist, einstellen Sie Durchfluss bis 10 µL/min. Hinweis: Diese Flussraten können variieren, wenn Kapillaren eine andere Größe oder andere Schlauchpumpen verwendet werden. In dieser Studie wurde die Durchflussmenge von 10 µL/min für die Pumpe und Kapillaren zu in Vivo Blutfluss zu imitieren optimiert.</li>
	<li>Zeitraffer-Aufnahmen der Zellen langsam durch die Kapillare entlang der Bearbeit-Beschichtung auf der Innenseite Wand alle 2 s für eine Gesamtmenge von 3 min. Hinweis: Intervalle und Gesamtzeit variieren je nach Zelltyp und Frage angegangen werden.</li>
	<li>Vor dem Ablegen der Kapillare, die ganze Kapillare Bildschirm durch das Okular des Mikroskops um sicherzustellen, dass der Abschnitt auf dem Video gezeigt Vertreter ist. Wenn nötig, machen Sie eine zweite Aufnahme.</li>
	<li>Den Schlauch von der Pumpe frei und lassen Sie die restliche Flüssigkeit laufen zurück in der 2-mL-Tube, dann trennen Sie die Kapillare und Schlauch aus der Fixierung und fahren Sie mit der nächsten Kapillare.</li>
</ol>4. Bewertung und Zellzählung
<ol><li>Öffnen Sie die Zeitraffer-Sequenz mit der entsprechenden Software und exportieren Sie die ersten drei Bilder ("Anfang") und die letzten drei Bilder ("Ende") als TIFF-Dateien.</li>
	<li>Offen die drei "Anfang" Bilder in ImageJ, konvertieren, 32-Bit ("Bild | Typ | 32-Bit ") und Bilder zu verschmelzen (' Bild | Farbe | Kanäle verbinden; Ordnen Sie die Farben rot, grün und blau zu den verschiedenen Bildern) zu. Zusammengesetztes Bild in RGB umwandeln (' Bild | Type-RGB') und speichern als TIFF-Datei. Wiederholen Sie mit dem "Ende"-Bilder. Hinweis: Zuerst aufgeteilt In wettbewerbsfähigen dynamischen Adhäsion Assays mit Zellen mit verschiedenen Farben gefärbt, die Kanäle der Bilder, um die Adhäsion der unterschiedlichen Zellpopulationen separat zu analysieren.</li>
	<li>Zählen Sie die weißen Zellen sichtbar im "Anfang" und "Ende" Composite und subtrahieren Sie die Zahl der weißen Blutkörperchen in den "Anfang" von der weißen Blutkörperchen in das "Ende". Hinweis: Der Unterschied entspricht der Anzahl der neu Einhaltung im Zeitintervall von 3 min-Zellen. In das zusammengesetzte Bild sind Zellen, die verschoben in die spezifische Farbe, die den jeweiligen Frame zugewiesen wurde, da sie an einer anderen Stelle im vorhergehenden und folgenden Frame lokalisieren, sichtbar. Für Zellen, die Anhänger, die roten, grünen und blauen Signale in der gleichen Stelle Überlappung zu weiß.</li>
	<li>Um die Ergebnisse besser zu visualisieren, kompilieren Sie ein Video von den Zeitraffer-Sequenzen, z. B. mit ImageJ.</li>
</ol>

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</ol>

M.F.N. diente als Berater für Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda und Boehringer. M.F.N. und S.Z. seitens Forschungsförderung der Takeda und Roche.

Das obige Protokoll beschreibt eine nützliche Technik, um dynamische Haftung der menschlichen Immunzellen zur endothelialen Liganden zu studieren. Durch Variation der beschichteten Liganden PERFUNDIERTEN Zelltypen oder Teilmengen, die Inkubation mit zusätzlichen Reize oder verschiedene neutralisierende Antikörper, es hat fast unbegrenzte Einsatzmöglichkeiten. Daher können solche dynamischen Adhäsion Assays nützlich sein, sowohl grundlegende Fragen der Grundlagenforschung sowie translational Abfragen, die helfen könnten, ...

Zelle Bewegung ist ein streng regulierten Prozess unverzichtbar für die Entwicklung und Funktion der mehrzelligen Organismen, sondern ist auch in der Pathogenese zahlreicher Erkrankungen1verwickelt. Homing Prozess der Immunzellen aus dem Blutstrom zu den peripheren Geweben hat vor kurzem, zunehmende Aufmerksamkeit gewonnen, da sie Nachschub und Ausbau der pathogene Zellen in entzündetem Gewebe bei immunologisch vermittelten Erkrankungen2 fördert ,3. Referenzfahrt ist insbesondere nachweislich, translationale Relevanz bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) zu haben. Die therapeutische Anti-α4β7 Integrin Antikörper Vedolizumab Darm referenzieren stören hat Wirksamkeit gezeigt, in großen klinischen Studien4,5 und erfolgreich eingesetzt in der klinischen Praxis6,7 , 8. weitere Verbindungen sind wahrscheinlich9,10folgen. Ebenso ist der therapeutische Anti-α4-Integrin-Antikörper, Natalizumab, zur Behandlung von Multipler Sklerose (MS)11verwendet.
Unsere funktionalen Verständnis des homing-Prozesses im allgemeinen und der Mechanismus der Wirkung solcher therapeutischer Antikörper ist insbesondere jedoch nach wie vor begrenzt. Es ist allgemein bekannt, dass Homing aus mehreren Schritten besteht, einschließlich der Zelle tethering und Walzen mit nachfolgenden Zelladhäsion, zur festen Festnahme gefolgt von Trans endotheliale Migration12,13. Die oben genannten Antikörper neutralisieren Integrine auf der Zelloberfläche, die Interaktion mit Addressins auf das Endothel der Gefäßwand zu verhindern. Dies ist gedacht, um feste Zelle Adhäsion14,15behindern. Allerdings sind wir erst am Anfang zu verstehen, die differenzierte Relevanz der spezifischen Integrine für Zelle Homing von eindeutigen Zelle Teilmengen. Darüber hinaus die Auswirkungen der Anti-Integrin-Antikörper auf verschiedenen Zelle Teilmengen und Dosis-Wirkungs-Verbände sind weitgehend unbekannt, was zu viele offene Fragen auf dem Gebiet der Darm homing und Anti-Adhäsion Therapien in IBD.
Praktische Tools für solche Fragen sind daher dringend erforderlich. Die Wirkung von Anti-Integrin-Antikörper auf Integrin-Bearbeit Interaktion ist bisher überwiegend ausgewertet worden, durch die Beurteilung verbindliche Wirksamkeit/Bindung Hemmung mit Durchflusszytometrie oder durch statische Haftung Assays16,17 ,18,19,20, also mit scheinbaren Vereinfachung und Abweichung von der physiologischen Situation. Wir hat kürzlich einen dynamischen Adhäsion-Assay Integrin-abhängige Adhäsion von menschlichen Zellen, Addressins und die Auswirkungen der Anti-Integrin-Antikörpern unter Scherbelastung2studieren. Das Prinzip der Technik wurde früher mit Maus Zellen21,22nachgewiesen. Hier wurde es angepasst und entwickelt, um die oben genannten translatorische Fragen, Eröffnung neuartige Wege zum besseren Verständnis der Mechanismen der Therapie mit Anti-Integrin Antikörper in Vivo.

<table><tbody><tr><td>48-Well-Platte</td><td>Sarstedt</td><td>833,923</td><td></td></tr><tr><td>Adhäsionspuffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocklösung: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Applichem</td><td>A1391,0100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren: Rechteckige Boro-Schläuche 0,20 mm x 2,00 mm ID, 50 mm Länge</td><td>CM Scientific</td><td>3520-050</td><td></td></tr><tr><td>CCL-2, humane</td><td>Immunotools</td><td>11343384</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Mikrokügelchen, humane</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&trade; CFSE Cell Proliferation Kit</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge (Rotixa 50 RS)</td><td>Hettrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coating Puffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop (TCS SP8)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CXCL-10,</td><td>humane Immunotools</td><td>11343884</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 500</td><td>Roth</td><td>9219.3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA KE/9 mL Monovette</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falken (50 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>Fc-Chimären-Isotyp-Kontrolle</td> R<td>& D Systems</td><td>110-HG</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusspumpen (LabV1)</td><td>Baoding Shenchen Precision Pump Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>J848-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG Isotype Control</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31154</td><td></td></tr><tr><td>Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc Chimera</td><td>R& D Systems</td><td>720-IC-050</td><td></td></tr><tr><td>LS-Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG-Isotypkontrolle</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-545</td><td></td></tr><tr><td>Mukosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc-Chimäre</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>6056-MC</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>Natalizumab</td><td>Biogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Zählkammer</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, human</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-601000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L 182-10</td><td>ohne Mg und Ca</td></tr><tr><td>Paraffinfolie aus Kunststoff: Parafilm (PM-996)</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>gereinigtes Anti-Human-CD18</td><td>Biolegend</td><td>302102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Gummischlauch: SC0059T 3-Stopp LMT-55 Schlauch, 1,02 mm ID, 406,4 mm Länge</td><td>Ismatec</td><td>SC0059</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td>Sarstedt</td><td>861,254,025</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Roth</td><td>CN76.1</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimäre</td><td>Biolegend</td><td>553706</td><td></td></tr><tr><td>Vedolizumab (Entyvio)</td><td>Takeda</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dynamische adhäsion assay für die funktionelle analyse von anti-adhäsion therapien bei chronisch entzündlichen darmerkrankungen

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Darm-Homing von Immunzellen ist wichtig für die Pathogenese der entzündlichen Darmerkrankungen (IBD). Integrin-abhängige Zelladhäsion, Addressins ist ein entscheidender Schritt in diesem Prozess und therapeutische Strategien stören Adhäsion haben erfolgreich etabliert. Der Anti-α4β7 Integrin Antikörper, Vedolizumab, dient der klinischen Behandlung von Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC) und weitere Verbindungen sind wahrscheinlich folgen.
Die Einzelheiten des Verfahrens Adhäsion und Wirkungsmechanismen von Anti-Integrin-Antikörper sind in vielerlei Hinsicht aufgrund der begrenzten verfügbaren Techniken für die funktionelle Forschung in diesem Bereich noch unklar.
Hier präsentieren wir Ihnen eine dynamische Adhäsion-Assay für die funktionelle Analyse der menschlichen Zelle Adhäsion unter Strömungsverhältnisse und die Auswirkungen der Anti-Integrin-Therapien im Rahmen der IBD. Es basiert auf die Perfusion der primären humanen Zellen durch Bearbeit-beschichtete ultradünnen Glaskapillaren mit mikroskopischen Analysen in Echtzeit. Der Test bietet eine Vielzahl von Möglichkeiten für Verbesserungen und Modifikationen und Potenziale für die mechanistischen Entdeckungen und Translationale Anwendungen hält.

Die vorgestellte Methode in diesem Manuskript zielt darauf ab, die in Vivo -Prozess der menschlichen Zelle Adhäsion an der endothelialen Wand so nah wie möglich an funktionell simulieren bewerten Zelladhäsion und die Rolle der störende Antikörper. Daher sind ultradünne Kapillaren mit Addressins beschichtet und mit Gewebekulturen beschriftete menschliche Zellen mit einer Perfusion Pumpe durchströmt. Mit live Cell imaging das Anhaften von menschlichen Zellen, die Addressins kann in...

Dynamische Adhäsion von Immunzellen, die Gefäßwand ist eine Voraussetzung für Darm-Homing. Hier präsentieren wir ein Protokoll für einen funktionellen in Vitro Assay für die Impact-Analyse der Antikörper Anti-Integrin, Chemokine oder andere Faktoren auf die dynamische Zelladhäsion von menschlichen Zellen mit Bearbeit-beschichteten Kapillaren.

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselnotwendige Fragen der grundlegenden Immunbiologie und entzündlichen Darmerkrankungen Forschung in Bezug auf die Adhäsionskaskade von Immunzellen für homing zu peripheren Organen erforderlich zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es ein bequemer und unkomplizierter Ansatz ist, um funktionale Fragen im Kontext der Zellhaftung unter Strömungsbedingungen zu beantworten. Obwohl diese Methode für die Erforschung des Mechanismus der Zell poietischen Anti-Integrin-Antikörper bei entzündlichen Darmerkrankungen entwickelt wurde, Kann es modifiziert werden, um ähnliche Probleme in anderen entzündlichen Erkrankungen zu analysieren.Beginnen Sie, indem Sie ein Stück Gummischläuche auf einer Seite mit einer kleinen Schere dehnen, um das Einführen einer rechteckigen Kapillare etwa 0,5 Zentimeter in das Rohr zu ermöglichen. Dann versiegeln Sie die Verbindung mit Paraffinfolie. Beschichten Sie die Kapillare mit 20 Mikrolitern der Adressein von Interesse und versiegeln Sie die Seite, die nicht mit dem Schlauch verbunden ist, mit Kunststoffparaffinfolie für mindestens eine Stunde Inkubation bei 37 Grad Celsius.Am Ende der Inkubation die Kunststof

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine Haftung Frequenz-Assay zur Messung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung Kinetik, wenn beide Moleküle auf der Oberfläche der interagierenden Zellen verankert sind beschrieben. Diese mechanisch-basierter Assay wird beispielhaft mit einer Mikropipette unter Druck menschlichen roten Blutkörperchen als Haftvermittler Sensor und Integrin αLβ2 und ICAM-1 als interagierende Rezeptoren und Liganden.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

Experimentelle Modelle von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen haben uns erlaubt, die komplexen angeborenen und adaptiven Immunantwort mit Pathogenese assoziiert zu untersuchen. Mit histologische Scoring, Quantifizierung von pro-inflammatorischen Zytokinen und Myeloperoxidase-Aktivität, kann man anfangen, diese Reaktionen in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen gesehen zu beurteilen.

Untersuchung Darmentzündungen in DSS-induzierten Modell der IBD

Verfahren zum Quantifizieren von Adhäsion von Neutrophilen berichtet. Dieses Verfahren erzeugt eine dynamische Fließumgebung ähnlich der in einem Blutgefäß auftreten. Es erlaubt die Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen an entweder gereinigte Adhäsionsmoleküle (Ligand) oder Endothelzell-Substrat (HUVEC) in einem Rahmen ähnlich der in vivo Umgebung mit Scherbeanspruchung.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Statischen Adhäsionsassay ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und andere Zelltypen zu modellieren. Interaktionen werden durch Injizieren markierten T-Zellen in Vertiefungen, die mit Adhäsionsmolekülen beschichtet ist, während ein Plattenlesegerät verwendet wird, um die Anzahl der anhaftenden Zellen zu quantifizieren folgenden seriellen Waschungen erzeugt.

Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

Hier präsentieren wir eine einfache, schnelle Methode zur Charakterisierung der intrinsischen Adhäsionseigenschaften von mutmaßlichen Zelladhäsionsmolekülen.  Die sezernierte, mit Epitopen markierte Ektodomäne eines Zelladhäsionsmoleküls wird aus dem Kulturmedium auf kleinen, einheitlich funktionalisierten Kügelchen eingefangen.  Diese Kügelchen können dann sofort in einfachen Bead-Aggregations-Assays verwendet werden.

Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

Dieser Strömungs Adhäsionsassay stellt eine einfache, hochschlag Modell von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen. Eine Spritzenpumpe wird verwendet, Scherspannung zu erzeugen, und die konfokale Mikroskopie erfasst Bilder für die Quantifizierung. Das Ziel dieser Studien ist es, um effektiv T Zelladhäsion quantifizieren Strömungsbedingungen.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Aktuelle Behandlungen von entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) zielen darauf ab, die Krankheitssymptome zu lindern, kann aber schwere Nebenwirkungen verursachen. Somit sind alternative Strategien in Tier Colitis-Modellen untersucht. Hier erklären wir, wie die positiven Wirkungen von Nahrungsergänzungsmitteln auf die klinische IBD Zeichen sind in einer solchen ulcerosa Modell analysiert.

Analyse wohltuende Wirkung von Nahrungsergänzungsmitteln auf Darmepithel Barrierefunktionen Während Experimental ulcerosa

Die systematische Bewertung von Darmentzündungen mit einem freien computergestützten System ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um histopathologische Veränderungen in Kolitismodellen, die durch das Vorhandensein von Geschwüren und entzündlichen Veränderungen gekennzeichnet sind, quantitativ zu vergleichen. Die auswertung der histologischen Colitis-Score-Bewertung stärkt klinische Beobachtungen und erleichtert die Dateninterpretation.

Systematische Scoring-Analyse für Darmentzündungen in einem Murine Dextran Natriumsulfat-induzierte Colitis Modell

In der vorliegenden Studie wird Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes (FITC) Dextran Mäusen über eine orale Sonde verabreicht, um die Darmpermeabilität sowohl in vivo als auch in Plasma- und Kotproben zu bewerten. Da die Barrierefunktion des Darms bei vielen Krankheitsprozessen beeinträchtigt ist, kann dieser direkte und quantitative Assay in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden.

Beurteilung der Integrität der Darmbarriere bei Mäusen unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat-markiertem Dextran

Es wird ein detailliertes Protokoll für die Abbildung einzelner migrierender Thrombozyten unter Verwendung von RGD-funktionalisierten Avidin-Biotin-Ethern mit einstellbarer Dichte bereitgestellt, das zeigt, dass Thrombozyten genügend Kraft erzeugen, um die Avidin-Biotin-Bindung zu brechen.

Ein in vitro Assay zur Untersuchung der Thrombozytenmigration mit RGD-funktionalisierten Avidin-Biotin-Ethern

Dieses Protokoll zeigt, wie das Src-Homologie-2-Domänen-enthaltende 5'-Inositolphosphatase (SHIP)-defiziente Mausmodell für Morbus Crohn (CD)-ähnliche ileale Entzündung und Fibrose verwendet werden kann, um neuartige Therapeutika für Zöliakie zu testen.

Evaluierung therapeutischer Interventionen im SHIP-defizienten Mausmodell der Morbus Crohn-ähnlicher Ileitis und Fibrose

Lernen Sie einen dynamischen Adhäsionsassay zur funktionellen Analyse von Anti-Integrin-Antikörpern bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Immunzelladhäsion unter Flussbedingungen.

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

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