Engineering-Transplantation geeignet retinalen Pigment Epithel Gewebe abgeleitet aus humanen embryonalen Stammzellen

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Selbsttherapie des Auges zu beantworten, z. B. wie wirksam ein speziell entwickeltes biotechnologisch hergestelltes Gewebe in vivo ist. Mit dieser Technik bieten wir eine Methode zur Herstellung und Konturierung des Netzhautgewebes sowie eine Strategie zur Verarbeitung des Gewebes für die Augenimplantation im Tiermodell an. Beginnen Sie mit dem Waschen von ein bis vier 30 x 30 mm großen Stücken menschlicher Amnionmembran (hAM).

Befestigen Sie ein Nylongerüst zweimal in 80 ml PBS pro Waschgang in einer 250-ml-Flasche auf einem Shaker bei hoher Geschwindigkeit für fünf Minuten. Geben Sie nach dem zweiten Waschen 40 ml funktionierende Thermolysinlösung in jede Flasche und schütteln Sie die Flaschen zweimal fünf Minuten lang bei 450 U/min, gefolgt von 30 Sekunden Vortexen. Nach der zweiten Runde der Thermolysin-Behandlung waschen Sie die Stücke noch zwei weitere Male mit 80 ml PBS pro Waschgang, wie gezeigt.

Verwenden Sie dann eine lange sterile Pinzette, um die hAMs einzeln in eine 10-cm-Kulturschale zu übertragen, die 10 ml PBS enthält. Legen Sie dann eine Membran mit dem Nylon nach unten in eine zweite 10-cm-Kulturschale aus PBS und lösen Sie zwei der vier Clips, mit denen die Membran am Nylon befestigt ist. Führen Sie den kleineren Ring des Kultureinsatzes zwischen dem Nylon und der Membran ein und achten Sie darauf, dass die Membran den kleineren Ring vollständig bedeckt.

Befestigen Sie den zweiten Teil des Kultureinsatzes an der Oberseite der Membran, so dass die Basalmembran des hAM mit der rechten Seite nach oben im Kultureinsatz zeigt, und lösen Sie die letzten beiden Clips. Verwenden Sie dann eine sterile Schere, um die Membran außerhalb des Kultureinsatzes bei Bedarf zu kürzen. Und verwenden Sie eine Pinzette, um die Membran in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte zu übertragen, die PBS für die Lagerung bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 enthält.

Erwärmen Sie vor der Aussaat Kryo-Fläschchen mit einer mal 10 bis der sechsten RPE-Zellen in 3 ml RPE-Medium in einem konischen 15-ml-Röhrchen pro Fläschchen. Wenn die Zellen aufgetaut sind, pipettieren Sie, um Einzelzellsuspensionen in jedem der Röhrchen zu erhalten, und zählen Sie die Anzahl lebensfähiger Zellen durch Tri-Pan-Blue-Ausschluss. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie die Pellets bei einer Konzentration von sieben mal 10 bis zum fünften Zellen pro Milliliter in frischem RPE-Medium.

Als nächstes aspirieren Sie das PBS aus jeder Vertiefung der vorbereiteten 12-Well-Platte und fügen Sie 500 Mikroliter Zellen in die Mitte jedes Kultureinsatzes und 1 ml RPE-Medium in den Boden jeder Vertiefung hinzu. Stellen Sie die Platte dann für 30 Tage wieder in den Zellkultur-Inkubator und wechseln Sie das Medium bis zum Ende der Kultur zweimal pro Woche. Am 30. Kulturtag eine 8%ige Gelatinelösung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad 30 Minuten lang erwärmen.

Und füllen Sie die innere Kammer eines Vibratoms mit vier Grad Celsius CO2-unabhängigem Medium. Schneide mit einem Skalpell einen 5 cm x 5 cm großen Block aus einem 20%igen Gelatineblock, der bei vier Grad Celsius gelagert wird. Befestigen Sie die Oberseite des Blocks mit einem geeigneten Kleber an der Stütze.

Und setzen Sie eine neue Klinge in das Vibratom ein. Stellen Sie den Block so ein, dass er sich auf der gleichen Höhe wie die Rasierklinge befindet, und füllen Sie die Badewanne um die Stütze herum mit frischem, vier Grad Celsius CO2-unabhängigem Medium. Schneiden Sie den Block mit mittlerer Geschwindigkeit, bis der Block gleichmäßig geschnitten ist und eine glatte Führungsfläche hat, und setzen Sie die Position auf Null.

Saugen Sie dann das Medium um die Gelatine herum an, bis die Gelatine vollständig trocken ist. Und verwenden Sie eine Pinzette, um vorsichtig einen mit RPE ausgesäten Kultureinsatz auf dem Block zu öffnen. Entfernen Sie mit einer Schere die gesamte Membran außerhalb des Einsatzrings und saugen Sie das gesamte Volumen des Restmediums an.

Geben Sie bis zu 1 ml 8%ige flüssige Gelatinelösung in die Membran, bis sie bedeckt ist. Und überschüssige Gelatine vorsichtig entfernen. Geben Sie nach fünf bis acht Minuten frisches, vier Grad Celsius CO2-unabhängiges Medium in das Bad, bis die erstarrte Membran bedeckt ist.

Und mit dem Vibratom in der 100-Mikron-Position schneiden Sie einen Abschnitt der Membran bei mittlerer Geschwindigkeit und achten Sie darauf, die Ausrichtung des Gewebes beizubehalten. Schneiden Sie mit einem Skalpell eine Ecke des Abschnitts ab, um die Ausrichtung des Abschnitts erkennen zu können. Und verwenden Sie einen Spatel, um die in Gelatine eingebettete Membran auf eine von sechs Vertiefungen gefüllte Platte zu übertragen, die mit vier Grad Celsius Konservierungsmedium gefüllt ist.

Die Ausrichtung der Scheibe konnte durch die freie Bewegung vor der zu schneidenden Ecke invertiert werden. Achten Sie also darauf, die Position der Scheibe direkt nach dem Schnitt zu sichern. Die Größe des Implantats kann dann vor der Transplantation unter dem Operationsmikroskop an die Größe des Empfängerauges angepasst werden.

Typischerweise verbleiben einige tote Zellen auf der Oberfläche der Membran, nachdem sie auf dem Kultureinsatz fixiert wurden, aber diese Zellen werden eliminiert, wenn das Kulturmedium gewechselt wird. Die Fasern der Basalmembran sind bei einer höheren Vergrößerung sichtbar, wenn keine Zellen mehr vorhanden sind, was darauf hindeutet, dass die Thermolysin-Behandlungsdauer optimiert wurde. Das retinale Epithel wird unter dem Mikroskop leichter zu erkennen, während es reift und nach drei Wochen eine vollständige kopfsteinpflasterartige Monoschicht bildet.

Mit vier Wochen ist das Epithel reif genug, um für die Implantation vorbereitet zu werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Zustand der Gelatine von der Temperatur abhängt. Achten Sie also darauf, die empfohlenen Temperaturen strikt einzuhalten.

Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Stammzelltherapie den Weg, um das therapeutische Potenzial eines biotechnologisch hergestellten Gewebes in einem Tiermodell der Retinitis pigmentosa zu erforschen. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um ein Gewebe auf einem Gerüst für seine anschließende Transplantation vorzubereiten, kann sie auch auf komplexere Systeme angewendet werden, die Photorezeptorschichten enthalten. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da der Umgang mit den menschlichen Amnionmembranen schwierig ist, die sehr dünn sind und dazu neigen, sich leicht zu falten.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Fixierung der menschlichen Amnionmembran und zur Einbettung von Gelatine schwer zu erlernen sind und einen besonderen Handhabungsansatz erfordern.