Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Ein Tandem RNA Isolierung (Reise) für die Verwertung von endogen gebildeten mRNA-Protein-komplexe Vorgehensweise wird. Speziell, RNA-Protein-komplexe sind vernetzt in VivoPolyadenylated RNAs sind isoliert aus Extrakten mit oligo(dT) Perlen und besonderen mRNAs werden mit modifizierten RNA antisense Oligonukleotide erfasst. Proteine gebunden, mRNAs werden vom Immunoblot Analyse erkannt.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Genexpressionsregulation zu beantworten, z. B. wie RNA-bindende Proteine sich in vivo an bestimmte RNAs anlagern und dadurch eine posttranskriptionelle Genregulation erzwingen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie weder Klonen noch genetische Manipulation benötigt. Es kann an jeden Modellorganismus oder -subtyp angepasst werden.

Um Oligonukleotide zu entwerfen, analysieren Sie die Sekundärstruktur der mRNA oder eines Fragments davon mit Hilfe von Online-Tools. Geben Sie zuerst die Nukleotidsequenz in das leere Feld ein, dann wählen Sie im Feld "Grundlegende Optionen" die Option "Minimale freie Energie" und vermeiden Sie isolierte Basenpaare. Wählen Sie im Feld Ausgabeoptionen die Option Interaktives RNA-Sekundärstrukturdiagramm aus, und klicken Sie schließlich auf die Schaltfläche Fortfahren.

Es öffnet sich ein neues Fenster, in dem die Sekundärstruktur der interessierenden mRNA angezeigt wird. Wählen Sie mindestens drei verschiedene 21 bis 24 Nukleotide lange Sequenzen innerhalb der interessierenden mRNA aus, vorzugsweise in Regionen ohne umfangreiche Sekundärstrukturen und in 3-Prime-untranslatierten Regionen. Wählen Sie Regionen mit einem Guanidin/Cytosin-Verhältnis von nahezu 50 % und ohne Nukleotid-Tandem-Wiederholungen, um eine mögliche Bildung von Haarnadeln oder Selbstglühen zu vermeiden.

Manuelles Entwerfen von 2-Prime-Methoxy-modifizierten RNA-Oligonukleotiden mit einer Biotin-Einheit an der 3-Prime, die vollständig komplementär zu den ausgewählten Regionen innerhalb der gewünschten Ziel-mRNA sind. Verwenden Sie ein geeignetes Online-Tool, um die Schmelztemperatur der RNA-Hybride auf 60 bis 65 Grad einzustellen und eine gute linguistische Sequenzkomplexität zu haben. Verwenden Sie das Basic Local Alignment Search Tool, um nach einer potenziellen ASO-Kreuzhybridisierung mit anderen mRNAs im Transkriptom zu suchen.

Wählen Sie Nukleotid-BLAST, geben Sie die Sequenz in das leere Feld ein und wählen Sie den gewünschten Organismus aus. Behalten Sie die restlichen Parameter als Standard bei, und klicken Sie auf BLAST. HEK293-Zellen werden bei 70 % Konfluenz in einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturschale transfiziert, indem zwei Mikrogramm des Reportergens mit 20 Mikrolitern Transfektionsreagenz gemischt und den Zellen hinzugefügt werden.

Legen Sie die Zellen vor der Ernte 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Am Tag der Ernte entfernen Sie das Medium mit einer serologischen Pipette und waschen Sie die Zellen zweimal schnell mit 10 Millilitern PBS, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurden. Als nächstes sechs Milliliter PBS in die Schüssel geben und auf Eis legen.

Anschließend werden die Zellen in einem UV-Vernetzer mit 100 Millijoule pro Quadratzentimeter UV-Licht ausgesetzt. Nach der UV-Einwirkung die Zellen und das PBS abkratzen und in ein 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Dann schleudern Sie die Zellen bei 250 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius herunter.

Nachdem Sie den Überstand mit einer Pipette entfernt haben, resuspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern vorgekühltem Lysepuffer, indem Sie fünf- oder sechsmal auf und ab pipettieren, während Sie das Röhrchen auf Eis halten. Übertragen Sie das Lysat mit einer Pipette in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen, das auf Eis gestellt wird, und beschallen Sie es für drei Runden, bestehend aus 20-Sekunden-Stößen mit einer Amplitude von 10 Mikrometern und 30 Sekunden Abkühlperioden auf Eis. Nach dem Überfüllen des Lysats in Zwei-Milliliter-Röhrchen zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 15.000 g Celsius.

Sammeln Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein neues Röhrchen. Um mit der RNA-Isolierung zu beginnen, äquilibrieren Sie ein Milligramm oligo(dT)gekoppelter magnetischer Kügelchen in 500 Mikrolitern Lysepuffer. Nehmen Sie das Röhrchen aus dem Rotator, legen Sie es auf ein Magnetgestell und entfernen Sie den Lysepuffer.

Kombinieren Sie vier Milligramm HEK293-Proteinextrakt mit den Oligo(dT)25-gekoppelten magnetischen Kügelchen. Mischen Sie die Proben kräftig und inkubieren Sie sie dann 10 Minuten lang bei 25 Grad Celsius. Legen Sie die Röhrchen 10 Sekunden lang auf einen Magnetständer und entfernen Sie dann den Überstand.

Halte den Überstand für nachfolgende Bergungsrunden auf Eis. Geben Sie 500 Mikroliter Waschpuffer A zu den Kügelchen und wirbeln Sie sie fünf Sekunden lang ein. Sammeln Sie die Kügelchen mit einem Magneten und waschen Sie die Kügelchen dann zweimal mit 500 Mikrolitern Waschpuffer B.To eluieren Sie die RNA, fügen Sie 30 Mikroliter 10-millimolare Tris-HCl hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen zwei Minuten lang bei 80 Grad Celsius unter kontinuierlichem Schütteln bei 1.000 U/min.

Übertragen Sie das Röhrchen direkt auf den Magnetständer und sammeln Sie das Eluat so schnell wie möglich nach etwa 10 Sekunden, um eine mögliche erneute Bindung von mRNAs an die Beads bei niedrigeren Temperaturen zu verhindern. Die Eluate aus wiederholten Patronen werden dann kombiniert und können bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Um spezifische mRNAs zu erfassen, fügen Sie 30 Mikroliter Streptavidin-gekoppelte magnetische Kügelchen zu einem Milliliter Bindungs- und Waschpuffer hinzu, der 0,1 Milligramm pro Milliliter E.coli-Transfer-RNA enthält.

Stunde lang auf einem Rotator bei Raumtemperatur äquilibrieren. Waschen Sie die Kügelchen nach einer Stunde dreimal mit 750 Mikrolitern Binde- und Waschpuffer. Vertexen Sie das Röhrchen, entfernen Sie dann den B&W-Puffer, resuspendieren Sie es in 30 Mikrolitern Puffer und bewahren Sie es bis zur Verwendung auf Eis auf.

Verdünnen Sie etwa 35 Mikrogramm Gesamtprotein aus der zuvor Poly(A)-Isolierung in 100 Mikrolitern Bindungs- und Waschpuffer, fügen Sie dann 200 Picomole des entsprechenden Antisense-Oligonukleotids hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 70 Grad Celsius, um das Glühen zu erleichtern. Entfernen Sie den gesamten Heizblock vom Gerät und stellen Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf, um es langsam abzukühlen. Geben Sie dann die 30 Mikroliter äquilibrierter Streptavidin-gekoppelter magnetischer Kügelchen in die Probe und inkubieren Sie die Mischung dann 30 Minuten lang bei 25 Grad Celsius unter ständigem Schütteln bei 950 U/min in einem Mischer.

Legen Sie die Tube auf den Magnetständer, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 750 Mikrolitern vorgewärmter Bindung und Waschpuffer bei 55 Grad Celsius. Fügen Sie 20 Mikroliter 10-millimolare Tris-HCl hinzu und stellen Sie sie 10 Minuten lang bei 90 Grad Celsius unter ständigem Schütteln bei 950 U/min, um die RNA zu eluieren. Legen Sie das Röhrchen nach 10 Minuten in den Magnetständer und sammeln Sie sofort das Eluat.

Hierbei handelt es sich um ein Agarosegel, das für den Nachweis von mRNAs mit RT-PCR unter Verwendung spezifischer Primer nach der Erfassung mit Oligo(dT) und einem Antisense-Oligonukleotid zu p27-mRNAs aus HEK293-Zellextrakt verwendet wird. Gezeigt wird auch eine Kontrolle ohne Antisense-Oligonukleotide. Die Eingabebahnen zeigen die Gesamt-RNA der vernetzten Zellen an.

Darüber hinaus werden auch Ergebnisse aus der Konkurrenz mit Poly(A) gezeigt. Hier ist eine Immunoblot-Analyse von mRNA-gebundenen Proteinen mit Antikörpern zu sehen, die das humane Antigen R, ein unbekanntes RNA-bindendes Protein, und beta-Aktin, ein negatives Kontrollprotein, nachweisen. Der Blot zeigt, dass das humane Antigen R in Poly(A)RNA-Isolaten nach dem Einfangen von p27-mRNAs mit Antisense-Oligonukleotiden erfolgreich nachgewiesen werden konnte.

Das humane Antigen R wurde in Kontrollisolaten ohne Antisense-Oligonukleotid nicht nachgewiesen. Die Eingangsbahnen zeigen die Proteine im Extrakt aus vernetzten Zellen und Ergebnisse aus der Konkurrenz mit Poly(A) sind ebenfalls dargestellt. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Massenspektrometrie durchgeführt werden, um die gesamte Probe des Proteins, das mit einer bestimmten RNA in vivo interagiert, systematisch zu analysieren.

Wichtig ist, dass TRIP ein vielseitiger Ansatz ist, der an alle Arten von polyadenylierten RNAs in verschiedenen Organismen angepasst werden kann, um die dynamische Anordnung von RNA-Protein-Wechselwirkungen zu verstehen. Daher kann es zur Untersuchung entwicklungskontrollierter oder krankheitsbezogener RNAs verwendet werden und möglicherweise zu neuen Angriffspunkten für therapeutische Interventionen führen.