Messung der Konzentration der Ionen in der ungerührte Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipette: Auswirkungen auf die Kontrolle der Ionenkanäle durch Flüssigkeit fließen
7. Januar 2019
Mechanosensitive Ionenkanäle sind oft in Bezug auf Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit mit Patch-Clamp-Aufnahme untersucht. Allerdings kann je nach experimentellen Protokoll, das Ergebnis auf Fluid Flow-Vorschriften von Ionenkanälen fehlerhaft sein. Hier bieten wir Methoden zur Vermeidung und Korrektur solcher Fehler mit einer theoretischen Grundlage.
Diese Einreichung kann helfen, Schlüsselfragen im elektrophysiologischen Bereich zu beantworten, wie z. B. den Flüssigkeitsfluss in den Vorschriften von Ionenkanälen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die tatsächliche Ionenkonzentration in der ungerührten Grenzschicht der Membranoberfläche für die Dateninterpretation im Zusammenhang mit der Strömungsregulation von Ionenkanälen abschätzen kann. Um dieses Verfahren zu beginnen, biegen Sie das gebrannte Glaskapillarrohr zu einer U-Form.
Der Innendurchmesser der Kapillare sollte groß genug sein, um den Serienwiderstand bei der Aufnahme großer Ionenströme zu reduzieren. Als nächstes drei Gramm Agarose in 100 Milliliter n.G. dreimolarem Kaliumchlorid auflösen und zwischen 90 und 100 Grad Celsius auf eine Kochplatte legen. Dann laden Sie die Brücke mit der Kaliumchlorid-Agarose, indem Sie die Glasbrücke in die Lösung eintauchen.
Halten Sie es über Nacht bei Raumtemperatur für die Agarose zu setzen und auszuhärten. Am nächsten Tag die mit Agarose Kaliumchlorid beladene Glasbrücke vorsichtig aus dem gehärteten Agarosesalz herausgraben. Bewahren Sie die Brücke in einer breithalsigen Flasche mit dreimolarem Kaliumchlorid im Kühlschrank auf.
Legen Sie bei diesem Verfahren einen mit Badelösung beladenen Behälter über die Patch-Klemmkammer. Als nächstes füllen Sie die Patch-Klemmenkammer mit der Badelösung, indem Sie das Rohr absaugen. Um den Flüssigkeitsfluss zu stoppen, klemmen Sie das Rohr an der Seite des Behälters, um den Flüssigkeitsfluss zu blockieren.
Beklemmen Sie dann das Rohr an der Saugseite, um gleichzeitig die Absaugung zu stoppen. Dies ist die stationäre Steuerungsbedingung. Um Flüssigkeitsdurchflussscherkraft anzuwenden, öffnen Sie beide Rohre am Behälter und die Saugseiten gleichzeitig.
Berechnen Sie vor oder nach dem Anwenden der Flüssigkeitsdurchflussscherkraft auf die Zelle den Durchfluss in Milliliter pro Minute, indem Sie die Abnahme des Flüssigkeitsvolumens über einen bestimmten Zeitpunkt messen. Um Veränderungen des Flüssigkeits-Metall-Kreuzungspotentials zu messen, bereiten Sie eine normale physiologische Salzkochsalzlösung für die Badekammer vor und vergleichen Sie sie in Abwesenheit und Vorhandensein einer Agar-Kaliumchlorid-Brücke. Als nächstes legen Sie eine Patchpipetette mit dreimolarer Kaliumchloridlösung in die Kammer, um die Verzweigungspotentialverschiebung zwischen Pipette und Badelösungen zu minimieren.
Stellen Sie dann den Spannungsklemmenverstärker in den aktuellen Klemmmodus ein. Messen Sie nach der Aufhebung des anfänglichen Offsetpotentials die Spannungsänderungen, die durch Variation der Durchflussraten induziert werden. Um zu überprüfen, ob es sich bei den Spannungsänderungen um Flüssigkeits-Metall-Anschlusspotentiale handelt, untersuchen Sie die Auswirkungen des Flüssigkeitsflusses auf das Anschlusspotential anhand der Agarose-Salzbrücke zwischen der Badlösung und der Referenzelektrode.
Zeichnen Sie mit den Ergebnissen der Veränderungen des Flüssigkeits-Metall-Knotenpotentials die Funktionspotential-Durchflussbeziehungen und schätzen Sie den sättigenden Wert der Knotenpotentialverschiebung durch die suprafluide Durchflussrate. Ändern Sie dann die Chloridkonzentration in der Badeflüssigkeit und ziehen Sie das Anschlusspotential-Chlorid-Konzentrationsverhältnis. Beachten Sie, dass die Flüssigkeitsrate konstant und ausreichend hoch sein sollte, um eine Abnahme der Chloridkonzentration auf die der angrenzenden Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode zu verhindern.
Schätzen Sie anhand der beiden Beziehungskurven die Veränderungen der Chloridkonzentration aus der gemessenen Knotenpotentialverschiebung. VDCC-L-Ströme wurden in den enzymatisch dispergierten mesenterischen arteriellen Myozyten der Ratte aufgenommen, wobei Nystatin perforierte Patch-Clamp-Aufnahmen wurden. Mit der Agarose-Kaliumchlorid-Brücke konnte das Anschlusspotenzial zwischen Referenzelektrode und Badelösungen minimiert und der Flüssigkeitsfluss die Spannung des VDCC-L-Stroms unabhängig voneinander erhöht.
Wenn jedoch die Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode ohne agarose Kaliumchloridbrücke direkt mit der Badeflüssigkeit verbunden war, verlagerte sich die IV-Beziehung in Gegenwart eines Flüssigkeitsflusses nach rechts, verglichen mit denen der VDCC-L-Ströme unter einem statischen Zustand. Die Strömungs-induzierte Zunahme von Kerr 2.1-Strömen, die in basophilen Leukämiezellen der Ratte mit der Agarosebrücke aufgezeichnet wurden, lässt sich durch den ungerührten Schichteffekt erklären. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in der Überelektrophysiologie.
So ist es für die Regulierung des Flüssigkeitsflusses in den Ionenkanalströmen. In Bezug auf elektrochemische Phänomene, in der ungerührten Grenzschicht an der Zellmembranoberfläche.
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Übersicht
Dieser Artikel behandelt die Bedeutung einer genauen Messung des Flüssigkeitsflusses und dessen Auswirkungen auf mechanosensitive Ionenkanäle. Er stellt Methoden vor, um Fehler in experimentellen Protokollen zu vermeiden und zu korrigieren.
Wesentliche Studienbestandteile
Bereich der Wissenschaft
- Elektrophysiologie
- mechanosensitive Ionenkanäle
- Strömungsmechanik
Hintergrund
- Mechanosensitive Ionenkanäle sind entscheidend für das Verständnis zellulärer Reaktionen auf mechanische Reize.
- Fehler bei der Messung des Fluidflusses können zu falschen Schlussfolgerungen über das Verhalten von Ionenkanälen führen.
- Die Patch-Clamp-Aufzeichnung ist eine gängige Technik, die in diesen Studien verwendet wird.
- Das Verständnis der unstirrten Grenzschicht ist für eine genaue Dateninterpretation unerlässlich.
Zweck der Studie
- Methoden zur genauen Messung der Auswirkungen von Flüssigkeitsströmungen auf Ionenkanäle bereitstellen.
- Mögliche Fehler in bestehenden experimentellen Protokollen hervorheben.
- Das Verständnis der Ionenkonzentrationsdynamik in der Nähe von Membranoberflächen verbessern.
Verwendete Methoden
- Verwendung einer U-förmigen, gebrannten Glas-Kapillarrohrleitung zur Messung des Flüssigkeitsflusses.
- Lösen von Agarose in Kaliumchlorid, um eine Brücke zur Aufzeichnung zu erzeugen.
- Erhitzen der Agarose-Lösung, um eine geeignete Konsistenz sicherzustellen.
- Befüllen der Brücke mit Kaliumchlorid-Agarose für eine effektive Aufzeichnung des Ionenstroms.
Hauptergebnisse
- Die vorgeschlagenen Methoden verbessern die Genauigkeit von Strömungsmessungen.
- Korrigierte Protokolle führen zu einem besseren Verständnis der Ionenkanalregulation.
- Die Abschätzung der Ionenkonzentration in der unstirrten Grenzschicht wird erreicht.
- Die Ergebnisse verdeutlichen die Bedeutung präziser experimenteller Aufbauten.
Schlussfolgerungen
- Genaue Messmethoden sind entscheidend für die Untersuchung mechanosensitiver Ionenkanäle.
- Fehler bei der Regulierung des Fluidflusses können durch geeignete Protokolle minimiert werden.
- Diese Studie leistet einen Beitrag zum Gebiet der Elektrophysiologie, indem sie experimentelle Methoden verfeinert.
Häufig gestellte Fragen
Praktische Bedeutung für die Industrie
Die genaue Messung der Ionenkonzentration in der unstirrten Grenzschicht ist entscheidend für eine zuverlässige Interpretation der Auswirkungen von Flüssigkeitsströmung auf die Gating-Mechanismen von Ionenkanälen. Diese Methode behebt experimentelle Artefakte in elektrophysiologischen Studien und verbessert die Datenqualität für die Zielvalidierung in der Forschung zu mechanosensitiven Ionenkanälen. Durch die Korrektur von Übergangspotentialverschiebungen erhöht sie die Vorhersagesicherheit in präklinischen Modellen der Reaktionen auf Scherkräfte durch Flüssigkeitsströmung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem echte Ionenkanal-Regulation von durch Flüssigkeitsströmung verursachten Artefakten unterschieden wird.
- Operativer Wert: Unterstützt die funktionelle Zielstrukturvalidierung durch verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis bei elektrophysiologischen Messungen.
- Prädiktiver Wert: Steigert die Zuverlässigkeit bei der Identifizierung von Leitverbindungen, indem falsch-positive Ergebnisse aufgrund von unstirred-layer-Effekten verringert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Bildschirmierung vor, indem die Messung der Ionenkonzentration in der Nähe der Membran stabilisiert wird.
- Reproduzierbarkeit: Behebt eine wesentliche Quelle der Variabilität in Patch-Clamp-Assays und unterstützt die Standardisierung von Assays zwischen verschiedenen Laboren.
- Quantitative Ausgabe: Ermöglicht die Messung echter Ionenkonzentrationen in der unstirred boundary layer und verbessert dadurch die Genauigkeit von Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die elektrophysiologische Entdeckungsphase mit der präklinischen Validierung, indem eine konsistente Modellierung der Ionenumgebung sichergestellt wird.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Klärt, ob beobachtete Veränderungen an Ionenkanälen auf direkte Mechanosensitivität oder sekundäre Effekte durch Ionenverarmung zurückzuführen sind.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem die Zuverlässigkeit präklinischer Wirksamkeits- und Sicherheitssignale verbessert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Lead-Optimierung bis zur präklinischen Bewertung ein, insbesondere für Ionenkanäle, die durch mechanische Reize reguliert werden.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem der Beitrag von Ionenkonzentrationsänderungen im Vergleich zur direkten Kanalaktivierung in Strömungsversuchen isoliert wird.
- Screening: Verbessert die Bereitschaft und Reproduzierbarkeit von Assays bei der Bewertung von Wirkstoffen, die auf strömungsempfindliche Ionenkanäle abzielen.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Messungen von Übergangspotentialverschiebungen, die zur Abschätzung der Ionenkonzentrationen in der Grenzschicht genutzt werden können.
- Translationale Forschung: Verbessert die klinische Übertragbarkeit, indem sichergestellt wird, dass die in-vitro-Reaktionen von Ionenkanälen physiologisch relevanten Bedingungen entsprechen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare elektrophysiologische Methode zur Untersuchung beliebiger mechanosensitiver Ionenkanalziele über therapeutische Bereiche hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei Untersuchungen zur Ionenkanalregulation, indem Effekte der unstirrten Schicht berücksichtigt werden.
- Operativer Wert: Erhöht die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Patch-Clamp-Experimenten unter Flüssigkeitsströmungsbedingungen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem fehlgeschlagene Folgestudien aufgrund artefaktbehafteter Daten reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Ionenkanal-Zielen basierend auf zuverlässigeren mechanistischen Daten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Elektrophysiologie und Strömungsmechanik, um die Strömungsregelung und Messungen des Übergangspotentials korrekt durchzuführen.
- Hängt von einer Instrumentierung ab, die eine präzise Kontrolle der Durchflussrate sowie Voltage-Clamp-Aufzeichnungen im Current-Clamp-Modus ermöglicht.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Herstellung der Agarosebrücken und der Zusammensetzung der Badlösung.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf verschiedene Zelltypen oder Ionenkanalziele angewendet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Notwendigkeit, ausreichend hohe Durchflussraten aufrechtzuerhalten, um eine Chlorid-Depletion in der Nähe der Referenzelektrode zu verhindern.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:30
Agarose Salt Bridges Between the Bath Solution and Reference Electrode
1:29
Application of Fluid Flow Shear Force to Cells in a Patch-Clamping Chamber
2:21
Measuring Changes in Liquid-Metal Junction Potential
3:18
Experimental Estimation of Real Chloride Concentration
4:07
Results: Effects of Fluid Flow on L-type VDCCL and Kir2.1 Currents With and Without Agarose 3 M KCl Bridge
5:14
Conclusion
