Name: Messung der Konzentration der Ionen in der ungerührte Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipette: Auswirkungen auf die Kontrolle der Ionenkanäle durch Flüssigkeit fließen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Ionenkonzentrationen in der ungerührten Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipetten messen. Diese Methode verbessert die Genauigkeit bei der Untersuchung mechanosensitiver Ionenkanäle.

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Diese Forschung wurde durch den Pionier Research Center Program (2011-0027921), von Basic Science Research Programme (2015R1C1A1A02036887 und NRF-2016R1A2B4014795 durch die National Research Foundation of Korea gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT) unterstützt. & Zukunft planen, und durch einen Zuschuss der Korea Health Technology R & D Projekt durch Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziert durch das Ministerium für Gesundheit & Wohlbefinden, Republik Korea (HI15C1540).

Alle Versuche wurden nach den institutionellen Vorgaben der Konkuk Universität durchgeführt.
(1) Agarose Salz Brücken zwischen dem Bad-Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode
Hinweis: Agarose 3M KCl Salz Brücken wie zuvor entstehen beschrieben12 mit geringfügigen Änderungen.
<ol><li>Bildung von Brücken<ol>
<li>Beugen Sie Feuer Glas-Kapillarröhrchen um eine U-Form entsprechend bilden. Der Innendurchmesser der Kapillaren sollte groß genug für die Verringerung der Serienwiderstand beim großen Ionen-Strömungen aufnehmen. Rohre mit einem Innendurchmesser von 2-5 mm sind in der Regel akzeptabel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Agarose 3 M KCl-Lösung<ol>
<li>Bereiten Sie 100 mL 3 M KCl-Lösung (1 M oder 2 M ist auch akzeptabel).</li>
		<li>Wiegen Sie 3 g Agarose.</li>
		<li>Lösen der Agarose in 100 mL KCl (d. h. 3 % Agarose) auf einer heißen Platte zwischen 90 und 100 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laden die Brücken mit 3 M KCl agarose<ol>
<li>Zum einfachen beladen, Tauchen Sie die u-förmige Glasbrücken in der Agarose-KCl-Lösung. Hinweis: Es ist leicht zu graben, die gläserne Brücken, wenn die Agarose-KCl-Lösung in einem flachen und breiten Container enthalten ist.</li>
		<li>Halten Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur (RT) für die Agarose zu setzen und zu härten.</li>
		<li>Sorgfältig die Agarose-KCl-geladen Glasbrücken aus dem Satz/gehärtet Agarose-Salz auszugraben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Speicherung der Brücken<ol>
<li>Bereiten Sie genügend Volumen (z.B. 500 mL) der 3 M KCl-Lösung in einer weiten-necked Flasche.</li>
		<li>Die vorbereiteten Agarose-Salz-Brücken in der Flasche im Kühlschrank aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Anwendung der Flüssigkeitsströmung Querkraft auf Zellen in einer Patch-Klemmung Kammer
Hinweis: Ein schematisches Diagramm der Patch-Clamp-Versuchsanordnung ist in Abbildung 1dargestellt.
<ol><li>Ort ein Container beladen Bade-Lösung (Volumen und Höhe sollte bereits gemessen werden) über die Patch-Clamp-Kammer.</li>
	<li>Füllen Sie die Patch-Clamp-Kammer mit der Baden-Lösung durch Absaugen der Röhre.</li>
	<li>Um die Strömung zu stoppen, clip das Rohr seitlich des Containers, die Strömung zu blockieren, dann clip den Schlauch auf der Saugseite, das Saugen zur gleichen Zeit zu stoppen. Dies ist der "stationären" Kontrollbedingung.</li>
	<li>Um Flüssigkeitsströmung Querkraft anzuwenden, öffnen Sie beide Rohre an den Container und Absaugung Seiten zur gleichen Zeit.</li>
	<li>Vor oder nach der Anwendung die Flüssigkeitsströmung Scherkraft auf die Zelle, die Durchflussmenge in mL/min messen.</li>
	<li>Den Durchfluss durch die Messung des Rückgang Flüssigkeitsvolumen über einen bestimmten Zeitraum zu berechnen.</li>
	<li>Aus dem gemessenen Volumenstrom und Geometrie (Struktur) der Kammer Baden sollte die Scherkraft, die von der Strömung auf die Zelle angewendet (siehe Diskussion) geschätzt werden.</li>
	<li>Alternativ zur Steuerung der Durchflussmenge (für Schritte 2,3-2,6) verwenden Sie eine Perfusion Pumpe. In diesem Fall achten Sie, eine konstante, anstatt eine pulsierende Strömung.</li>
</ol>3. Messung der Veränderungen der Flüssigmetall-Junction-Potenzial durch Strömung zwischen Bad-Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode (Abbildung 3A)
<ol><li>Verwenden Sie die Ag/AgCl-Elektrode oder Pellets, die von der Fertigprodukte, ohne die Agarose Salzbrücke erhältlich ist.</li>
	<li>Bereiten Sie eine normale physiologische Salz Kochsalzlösung für die Baden-Kammer (z.B., 143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-Glucose, pH 7.4 mit NaOH angepasst).</li>
	<li>Legen Sie eine Patch-Pipette mit einer 3 M KCl-Lösung in der Kammer, die Kreuzung Potenzialverschiebung zwischen der Pipette und Baden Lösungen zu minimieren.</li>
	<li>Beheben den Voltage-Clamp-Verstärker in den aktuellen Klemme-Modus ("ich = 0" oder "CC").</li>
	<li>Messen Sie nach zunichte macht das erste Offset Potenzial Änderungen in der Spannung induziert durch verschiedene Durchflussmengen.</li>
	<li>Erneut prüfen Sie, um sicherzustellen, dass die Änderungen in der Spannung Flüssigmetall/Kreuzung Potentiale sind, die Wirkung der Strömung auf die Kreuzung Potenzial über die Agarose-Salz-Brücke zwischen dem Bad-Lösung und Ag/AgCl-Elektrode.</li>
</ol>4. experimentelle Abschätzung der Real Cl– -Konzentration in der ungerührte Schicht neben Ag/AgCl-Elektrode unter statischen Zustand (Abb. 3 b)
<ol><li>Zeichnen Sie aus den Ergebnissen von Schritt 3 die Kreuzung Potenzial-Durchfluss-Beziehungen und schätzen Sie den Wert der maximalen (Sättigung) der Kreuzung Potenzialverschiebung durch die supra-Fluid Flow Rate.</li>
	<li>Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen von Cl (d.h., 50, 99, 147, 195 und 288 mM NaCl).</li>
	<li>Zeichnen Sie durch eine Änderung der Cl– -Konzentration in der Flüssigkeit Baden die Kreuzung Potential-[Cl–] Beziehung. Beachten Sie, dass die flüssige Rate konstant und hoch genug sein sollte (> 30 mL / min), die Abnahme der Konzentration der Cl– mit derjenigen der angrenzenden Ag/AgCl-Referenzelektrode zu verhindern.</li>
	<li>Schätzen Sie aus den beiden Beziehung Kurven die Konzentrationsänderungen Cl– aus der gemessenen Kreuzung Potenzialverschiebung.</li>
</ol>

<ol><li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li>
<li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li>
<li>Langille, B. L., O’Donnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductions+in+arterial+diameter+produced+by+chronic+decreases+in+blood+flow+are+endothelium-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent.</a> Science. 231, 405-407 (1986).</li>
<li>Pohl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+endothelium+in+the+vasodilator+response+to+increased+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo.</a> Hypertension. 8, 37-44 (1986).</li>
<li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+mechanically+activated+ion+channel%2C+is+required+for+vascular+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).</li>
<li>Hoger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li>
<li>Mendoza, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV4-mediated+endothelial+Ca2%2B+influx+and+vasodilation+in+response+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).</li>
<li>Brahler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deficit+of+SK3+and+IK1+channels+disrupts+the+endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+vasodilator+pathway+and+causes+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension.</a> Circulation. 119, 2323-2332 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+pressure+modulates+L-type+Ca2%2B+channel+via+enhancement+of+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K%2B+current+by+convectively+restoring+%5BK%2B%5D+at+the+cell+membrane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface.</a> Scientific Report. 6, 39585(2016).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluid+flow+on+voltage-dependent+calcium+channels+in+rat+vascular+myocytes%3A+fluid+flow+as+a+shear+stress+and+a+source+of+artifacts+during+patch-clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).</li>
<li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmosis+in+membranes%3A+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li>
<li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmosis+in+membranes%3A+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li>
<li>Barry, P. H., Diamond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unstirred+layers+on+membrane+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Effects of unstirred layers on membrane phenomena.</a> Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+remodeling+is+a+critical+mechanotransduction+mechanism+of+the+stretch-induced+L-type+Ca2%2B+channel+activation+in+vascular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).</li>
<li>A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018).</li>
<li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium%3A+for+better+and+for+worse%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Studie haben wir eine Methode, um echte Cl– -Konzentration in der ungerührte Schicht angrenzend an die Ag/AgCl-Referenzelektrode messen durch die Bestimmung der potentiellen Flüssigmetall-Kreuzung mit einer offenen Patch-Clamp-Pipette gefüllt mit einem hohen KCl gezeigt. Konzentration. Die Veränderung der Cl– -Konzentration in der Grenzschicht führt zu einer Verschiebung der Kreuzung Potenzial beim Wechsel von statischen zu Flüssigkeit Strömungsverhältnisse. Einfach mit einer Agarose KCl B...

Strömung ist eine wichtige ökologische Cue, die vielen physiologische und pathologische Prozessen wie Fluid Flow-induzierte Vasodilatation und Flüssigkeit Scherkräfte Kraft-abhängige Gefäße Umgestaltung und Entwicklung1,2steuert, 3,4,5. Obwohl die molekularen Mechanismen für die biologischen Reaktionen auf Flüssigkeitsströmung Querkraft nicht vollständig verstanden sind, wird angenommen, dass Fluid Flow-vermittelten Regulierung der Ionen-Kanal gating kritisch zur Fluid strömungsinduzierte Antworten5 beitragen können , 6 , 7 , 8. Z. B. Aktivierung von Endothelzellen nach innen Gleichrichter Kir2.1 und Ca2 +-aktivierte K+ (KCa2,3, KCNN3) Kanäle nach Ca2 + Zustrom von Flüssigkeitsströmung vorgeschlagen worden ist, beizutragen zur Flüssigkeit strömungsinduzierte Vasodilatation6,7,8. Daher viele Ionenkanäle, vor allem mechanisch aktiviert oder -gehemmte Kanäle wurden untersucht im Hinblick auf die Kraftempfindlichkeit Fluid Flow/Scherung mit der Patch-Clamp Technik6,9,10 , 11. abhängig vom experimentellen Protokoll während Patch-Clamp-Aufnahme durchgeführt, Ergebnisse und Interpretation der Daten auf Fluid Flow-Vorschriften von Ionenkanälen können jedoch fehlerhafte10,11.
Eine Quelle der Flüssigkeit strömungsinduzierte Artefakte in der Patch-Clamp-Aufnahme ist aus der Kreuzung zwischen der Badflüssigkeit und Ag/AgCl Referenz-Elektrode11möglichen. Es wird allgemein angenommen, dass die Flüssigmetall/Kreuzung Potenzial zwischen Baden Fluid und Ag/AgCl Elektroden konstant ist wie die Cl– -Konzentration der Flüssigkeit Baden konstant gehalten, ist unter Berücksichtigung der chemischen Reaktion zwischen der Baden-Lösung und Ag/AgCl-Elektrode zu werden:
AG + Cl–↔ AgCl + Elektron (e–) (Gleichung 1)
Jedoch in einem Fall, wo die insgesamt elektrochemische Reaktion zwischen dem Baden Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode (Gleichung 1) von links nach rechts verläuft, verweisen die Cl– -Konzentration der Baden Flüssigkeit neben der Ag/AgCl Elektrode (ungerührte Grenzschicht12,13,14,15) möglicherweise viel geringer als die in der Masse der Lösung, Baden, sofern genügend Konvektion Transport gewährleistet ist. Mit einer alten oder nicht-ideale Ag/AgCl-Elektrode mit unzureichenden Chlorierung der Ag kann dieses Risiko erhöhen. Dieses Fluid Flow-bezogene Artefakt an der Referenzelektrode, in der Tat kann ausgeschlossen werden, indem Sie einfach eine herkömmliche Agarose-Salz-Brücke zwischen Baden Fluid und Referenz Elektrode, da das Artefakt auf Veränderungen im realen Cl– Angrenzend an die Ag/AgCl-Elektrode11Konzentration. Das Protokoll in dieser Studie vorgestellt beschreibt die verhindern, dass die Junction Flow-im Zusammenhang mit möglichen Änderungen und echte Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht zu messen.
Nach dem Platzieren einer Agarose KCl-Brücke zwischen dem Baden Flüssigkeit und Ag/AgCl-Referenzelektrode, ist ein weiterer entscheidender Faktor, der berücksichtigt werden sollte: nur als Referenz Ag/AgCl-Elektrode wirkt wie ein Cl– -Elektrode, die Ionenkanäle auch funktionieren können wie eine ionenselektive Elektrode. Die Situation der eine ungerührte Grenzschicht zwischen dem Baden Flüssigkeit und Ag/AgCl-Referenzelektrode entsteht während der Bewegung der Ionen zwischen den extrazellulären und intrazellulären Lösungen durch die Membran-Ionenkanäle. Dies impliziert, dass Vorsicht bei Auslegung der Verordnung von Ionen durch Flüssigkeitsströmung Kanäle verwendet werden soll. Wie in unserer vorherigen Studie11besprochen, die Bewegung von Ionen durch eine Lösung, in denen eine elektrochemische Steigung vorliegt, kann auftreten, über drei verschiedene Mechanismen: Diffusion, Migration und Konvektion, wo Diffusion die Bewegung ist induziert durch Konzentrationsgradienten, Migration ist die Bewegung von elektrischen Gradienten angetrieben und Konvektion ist die Bewegung durch Fluid-Flow. Unter diesen drei Transportmechanismen trägt Konvektion-Modus die meisten um die Bewegung von Ionen11 (> 1.000 Mal größer als Diffusion oder Migration unter üblichen Patch-Clamp-Einstellungen). Dies bildet die theoretische Basis warum Kreuzung Potenzial zwischen Baden Fluid und Ag/AgCl-Referenzelektrode sehr unter verschiedenen statischen und Fluid-Flow Bedingungen11kann.
Gemäß der Hypothese oben vorgeschlagen, einige facilitatory Effekte der Strömung auf die aktuellen Ionenkanal können entnommen werden die konvektive Wiederherstellung der realen Ionenkonzentrationen angrenzend an die Kanal-Einlass an der Membranoberfläche (ungerührte Grenzschicht) 10. In diesem Fall die strömungsinduzierte Effekte von Flüssigkeiten auf Ionen-Kanal Strömungen entstanden einfach aus elektrochemischen Ereignisse nicht von der Regelung der Ionen-Kanal gating. Eine ähnliche Idee wurde zuvor von Barry und Kollegen12,13,14,15 basierend auf strengen theoretischen Überlegungen und experimentelle Beweise, auch bekannt als die ungerührte Schicht vorgeschlagen oder Transport-Nummer-Effekt. Wenn einige Ionenkanäle genügend auftreten Einkanal-Leitfähigkeit und lange genug offene Zeit, ausreichend Transport Preise durch die Kanäle (Transport schneller in der Membran als in der ungerührte Membranoberfläche), einen Grenzschicht-Effekt zur Verfügung zu . So kann die Konvektion-abhängige Transport zum eventuellen Flüssigkeit-strömungsinduzierte Erleichterungen von Ionen-aktuelle10,12,13,14,15beitragen.
In dieser Studie betonen wir, wie wichtig es ist, mit einem Agar oder Agarose Salz-Brücke während des Studiums Flüssigkeit-strömungsinduzierte Verordnung von Ionen strömen. Wir bieten auch eine Methode zur Messung der realen Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht angrenzend an die Ag/AgCl Referenz-Elektrode und Membran Ionenkanäle. Darüber hinaus bieten die theoretische Interpretation der Flüssigkeit strömungsinduzierte Modulation der Ionen-Kanal Ströme (z. B. Konvektion Hypothese oder ungerührte Transport Nummer Ebeneneffekt) wertvolle Erkenntnisse für die Gestaltung und Interpretation von Studien auf die Scherung Kraftregelung von Ionenkanälen. Nach dem ungerührte Grenzschicht Transport Nummer Effekt sagen wir voraus, dass Ionen-Kanal Ströme durch alle Arten von Ionenkanälen Membran durch Flüssigkeitsströmung, unabhängig von ihrer biologischen Empfindlichkeit gegenüber Flüssigkeitsströmung Querkraft, aber nur wenn gefördert werden kann die Ionenkanäle haben ausreichende Einkanal-Leitfähigkeit und lange offene Zeit. Höheren Stromdichten der Ionen-Kanal kann die ungerührte Grenzschicht Wirkung an der Oberfläche der Zellmembran erhöhen.

<table><tbody><tr><td>RC-11 offene Badkammer</td><td>Warner instruments, USA</td><td>W4 64-0307</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl Elektrodenpellet</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>EP1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-aldrich, USA</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Voltage-Clamp-Verstärker</td><td>HEKA, Deutschland</td><td>EPC8</td><td></td></tr><tr><td>Voltage-Clamp-Verstärker</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigkeitspumpe</td><td>KNF Flodos, Schweiz</td><td>FEM08</td><td></td></tr></tbody></table>

messung der konzentration der ionen in der ungerührte grenzschicht mit offenen patch-clamp-pipette: auswirkungen auf die kontrolle der ionenkanäle durch flüssigkeit fließen

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Strömung ist ein wichtiger ökologischer Impuls, der viele physiologische und pathologische Prozesse, wie Fluid Flow-induzierte Vasodilatation steuert. Obwohl die molekularen Mechanismen der biologischen Reaktionen auf Fluid Flow/Querkraft nicht vollständig verstanden sind, kann kritisch Fluid Flow-vermittelten Regulierung der Ionen-Kanal gating beitragen. Daher wurde Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit Ionenkanäle mit der Patch-Clamp-Technik untersucht. Jedoch können abhängig von den experimentellen Protokoll die Ergebnisse und Interpretation der Daten fehlerhaft sein. Hier präsentieren wir experimentelle und theoretische Belege für Fluid Flow-bezogene Fehler und Methoden für die Schätzung, Vorbeugung und Korrektur dieser Fehler bereitzustellen. Veränderungen der Kreuzung Potenzial zwischen Ag/AgCl-Referenzelektrode und Baden Flüssigkeit wurden gemessen mit einer offenen Pipette gefüllt mit 3 M KCl. Strömung konnte dann die Flüssigmetall/Kreuzung Potenzial für ca. 7 mV zu verlagern. Im Gegensatz dazu durch die Messung der Spannung-Verschiebung durch Strömung induzierte, schätzten wir die Ionenkonzentration in der ungerührte Grenzschicht. Im statischen Zustand erreichen die echte Ionenkonzentrationen angrenzend an den Ag/AgCl Referenz Elektrode oder Ionen-Kanal Einlass an der Zellmembran Oberfläche so niedrig wie etwa 30 % davon in den Flow-Zustand. Platzieren einer Agarose 3 M kann KCl-Brücke zwischen der Baden-Flüssigkeit und Referenz-Elektrode dieses Problem der Kreuzung mögliche Verschiebung verhindert. Das ungerührte Ebeneneffekt angrenzend an der Oberfläche der Zellmembran konnten jedoch nicht auf diese Weise gelöst werden. Hier bieten wir eine Methode zur Messung der realen Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht mit einer offenen Patch-Clamp-Pipette, betonend, wie wichtig es ist, mit einer Agarose Salz-Brücke während des Studiums Fluid strömungsinduzierte Verordnung von Ionen strömen. Daher kann dieser neuartige Ansatz, unter Berücksichtigung der realen Konzentrationen von Ionen in der ungerührte Grenzschicht, nützlichen Einblick auf die experimentelle Gestaltung und Interpretation der Daten im Zusammenhang mit Fluid Schubspannung Regulierung von Ionenkanälen bereitstellen .

Ganze Zelle spannungsabhängige L-Typ Ca2 + -Kanal (VDCCL) Strömungen verzeichneten die enzymatisch verteilten Ratten mesenterialen arteriellen Myozyten, wie oben beschrieben11. Die arteriellen Myozyten wurden mit einer Cs-reiche Pipette Lösung unter der Nystatin-perforierten Konfiguration mit zweiwertigen kationen frei Baden Lösung zur Erleichterung des Stromfluss durch VDCCL11,16...

Mechanosensitive Ionenkanäle sind oft in Bezug auf Fluid Flow/Scherung Kraftempfindlichkeit mit Patch-Clamp-Aufnahme untersucht. Allerdings kann je nach experimentellen Protokoll, das Ergebnis auf Fluid Flow-Vorschriften von Ionenkanälen fehlerhaft sein. Hier bieten wir Methoden zur Vermeidung und Korrektur solcher Fehler mit einer theoretischen Grundlage.

Messung der Konzentration der Ionen in der ungerührte Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipette: Auswirkungen auf die Kontrolle der Ionenkanäle durch Flüssigkeit fließen

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Diese Einreichung kann helfen, Schlüsselfragen im elektrophysiologischen Bereich zu beantworten, wie z. B. den Flüssigkeitsfluss in den Vorschriften von Ionenkanälen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die tatsächliche Ionenkonzentration in der ungerührten Grenzschicht der Membranoberfläche für die Dateninterpretation im Zusammenhang mit der Strömungsregulation von Ionenkanälen abschätzen kann. Um dieses Verfahren zu beginnen, biegen Sie das gebrannte Glaskapillarrohr zu einer U-Form.Der Innendurchmesser der Kapillare sollte groß genug sein, um den Serienwiderstand bei der Aufnahme großer Ionenströme zu reduzieren. Als nächstes drei Gramm Agarose in 100 Milliliter n.G. dreimolarem Kaliumchlorid auflösen und zwischen 90 und 100 Grad Celsius auf eine Kochplatte legen. Dann laden Sie die Brücke mit der Kaliumchlorid-Agarose, indem Sie die Glasbrücke in die Lösung eintauchen.Halten Sie es über Nacht bei Raumtemperatur für die Agarose zu setzen und auszuhärten. Am nächsten Tag die mit Agarose Kaliumchlorid beladene Glasbrücke vorsichtig aus dem gehärteten Agarosesalz herausgraben. Bewahren Sie die Brücke in einer breithalsigen Flasche mit dreimolarem Kaliumchlorid im Kühlschrank auf.Legen Sie bei diesem Verfahren einen mit Badelösung beladenen Behälter über die Patch-Klemmkammer. Als nächstes füllen Sie die Patch-Klemmenkammer mit der Badelösung, indem Sie das Rohr absaugen. Um den Flüssigkeitsfluss zu stoppen, klemmen Sie das Rohr an der Seite des Behälters, um den Flüssigkeitsfluss zu blockieren.Beklemmen Sie dann das Rohr an der Saugseite, um gleichzeitig die Absaugung zu stoppen. Dies ist die stationäre Steuerungsbedingung. Um Flüssigkeitsdurchflussscherkraft anzuwenden, öffnen Sie beide Rohre am Behälter und die Saugseiten gleichzeitig.Berechnen Sie vor oder nach dem Anwenden der Flüssigkeitsdurchflussscherkraft auf die Zelle den Durchfluss in Milliliter pro Minute, indem Sie die Abnahme des Flüssigkeitsvolumens über einen bestimmten Zeitpunkt messen. Um Veränderungen des Flüssigkeits-Metall-Kreuzungspotentials zu messen, bereiten Sie eine normale physiologische Salzkochsalzlösung für die Badekammer vor und vergleichen Sie sie in Abwesenheit und Vorhandensein einer Agar-Kaliumchlorid-Brücke. Als nächstes legen Sie eine Patchpipetette mit dreimolarer Kaliumchloridlösung in die Kammer, um die Verzweigungspotentialverschiebung zwischen Pipette und Badelösungen zu minimieren.Stellen Sie dann den Spannungsklemmenverstärker in den aktuellen Klemmmodus ein. Messen Sie nach der Aufhebung des anfänglichen Offsetpotentials die Spannungsänderungen, die durch Variation der Durchflussraten induziert werden. Um zu überprüfen, ob es sich bei den Spannungsänderungen um Flüssigkeits-Metall-Anschlusspotentiale handelt, untersuchen Sie die Auswirkungen des Flüssigkeitsflusses auf das Anschlusspotential anhand der Agarose-Salzbrücke zwischen der Badlösung und der Referenzelektrode.Zeichnen Sie mit den Ergebnissen der Veränderungen des Flüssigkeits-Metall-Knotenpotentials die Funktionspotential-Durchflussbeziehungen und schätzen Sie den sättigenden Wert der Knotenpotentialverschiebung durch die suprafluide Durchflussrate. Ändern Sie dann die Chloridkonzentration in der Badeflüssigkeit und ziehen Sie das Anschlusspotential-Chlorid-Konzentrationsverhältnis. Beachten Sie, dass die Flüssigkeitsrate konstant und ausreichend hoch sein sollte, um eine Abnahme der Chloridkonzentration auf die der angrenzenden Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode zu verhindern.Schätzen Sie anhand der beiden Beziehungskurven die Veränderungen der Chloridkonzentration aus der gemessenen Knotenpotentialverschiebung. VDCC-L-Ströme wurden in den enzymatisch dispergierten mesenterischen arteriellen Myozyten der Ratte aufgenommen, wobei Nystatin perforierte Patch-Clamp-Aufnahmen wurden. Mit der Agarose-Kaliumchlorid-Brücke konnte das Anschlusspotenzial zwischen Referenzelektrode und Badelösungen minimiert und der Flüssigkeitsfluss die Spannung des VDCC-L-Stroms unabhängig voneinander erhöht.Wenn jedoch die Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode ohne agarose Kaliumchloridbrücke direkt mit der Badeflüssigkeit verbunden war, verlagerte sich die IV-Beziehung in Gegenwart eines Flüssigkeitsflusses nach rechts, verglichen mit denen der VDCC-L-Ströme unter einem statischen Zustand. Die Strömungs-induzierte Zunahme von Kerr 2.1-Strömen, die in basophilen Leukämiezellen der Ratte mit der Agarosebrücke aufgezeichnet wurden, lässt sich durch den ungerührten Schichteffekt erklären. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in der Überelektrophysiologie.So ist es für die Regulierung des Flüssigkeitsflusses in den Ionenkanalströmen. In Bezug auf elektrochemische Phänomene, in der ungerührten Grenzschicht an der Zellmembranoberfläche.

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