Name: Verwendung von Autometallography zu lokalisieren und semi-Quantifizierung Silber im Wal Gewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Autometallographie zur Lokalisierung von Silber in Wal-Leber- und Nierengewebe. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die semi-quantitative Analyse von Schwermetallen in marinen Säugetieren.

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Wir danken dem Taiwan Cetacean Verseilung Netzwerk für Probenentnahme und Lagerung, einschließlich der Taiwan Cetacean Society, Taipei; Das Cetacean Research Laboratory (Prof. Lien-Siang Chou), das Institut für Ökologie und Evolutionsbiologie, National Taiwan University, Taipei; das National Museum of Natural Science (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; und die Meeresbiologie und Cetacean Research Center, National Cheng-Kung University. Wir danken auch der Forestry Bureau, Rat für Landwirtschaft, Exekutiv-Yuan für ihre Genehmigung.

Die Studie wurde nach internationalen Richtlinien durchgeführt und die Verwendung von Cetacean Gewebeproben durfte durch den Rat der Landwirtschaft von Taiwan (Forschung erlauben 104-07.1-SB-62).
(1) Gewebe Probenvorbereitung für ICP-MS-Analyse
Hinweis: Die Leber und Niere Gewebe wurden gesammelt von frisch Tote und mäßig Autolysierte gestrandete Wale24, darunter 6 gestrandete Wale und Delfine von 4 verschiedenen Arten, 1 Grampus früh (Gg), 2 Kogia spp. (Ko), 2 Lagenodelphis Hosei (Lh), 1 Stenella Attenuata (Sa). Jede gestrandeten Wal hatte eine Feldnummer für individuelle Kennung. Die Gewebe-Probenvorbereitung für ICP-MS-Analyse folgte die Methode M.H. Chens Lab gegründet, und M.H. Chen Labor durchgeführt der ICP-MS-Analyse11,13,25.
<ol><li>Leber und Niere Gewebe für ICP-MS-Analyse von gestrandeten Walen zu sammeln und bei −20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.</li>
	<li>Sammeln Sie paar passende Leber und Niere Gewebe aus dem gleichen gestrandeten Walen für AMG-Analyse (siehe Schritt 2).</li>
	<li>Schneiden Sie die äußere Schicht der Gewebeproben für ICP-MS-Analyse mit einem Edelstahl-Skalpell gesammelt. Schneiden Sie den inneren Teil der Gewebeproben in kleine Würfel (ca. 1 cm3) und legen Sie sie in Zip-Lock Beutel aus Kunststoff. Normalerweise enthält jede Tasche 10 g der Gewebe.</li>
	<li>Speichern Sie die Plastiktüten mit Gewebeproben −20 ° C für nachfolgende Verfahren.</li>
	<li>Setzen Sie die 1 cm3 Würfel, die Proben in ein Einfrieren System (-50 ° C, Vakuumpumpe mit einem Hubraum von mindestens 98 L/min, 0.002 mBar) für mindestens 72 Stunden bis zum Trocknen vollständig getrocknet durch wiegen auf die Konstante.</li>
	<li>Die getrockneten Würfel zu Pulver mit einem Homogenisator für nachfolgende Gewebe Verdauung zu homogenisieren.</li>
	<li>Wiegen Sie 0,3 g homogenisierte gefriergetrocknet Proben in 30 mL Polytetrafluorethylen (PTFE) Flaschen und mischen sie mit 10 mL Salpetersäure 65 % w/w.</li>
	<li>Die PTFE-Flaschen anziehen Sie Verschlüsse, aber lassen Sie die Verschlüsse aufdreht. Hinweis: Dadurch den braunen Rauch in der PTFE-Flaschen und Reflux zu bilden in der Flasche für die Verdauung bis braunen Rauch verschwindet und wird klar.</li>
	<li>Erwärmen Sie die verdauten Proben mit einer Heizplatte von 30 ° C bis 110/120 ° C (nach der braunen Rauch bilden Zustand) in der PTFE-Flaschen für 2 bis 3 Wochen bis bräunliche Gas in den Flaschen PTFE farblos wird und die Flüssigkeit in der PTFE-Flaschen durchscheinend Gree wird Nish blass gelb oder ganz klar. Hinweis: Führen Sie den Erwärmungsprozess in chemischen Dampfhaube.</li>
	<li>Erhitzen Sie die verdauten Proben bei 120 ° C zu verdampfen der Salpetersäure in der PTFE-Flaschen bis nur 0,5-1 mL bleibt. Hinweis: Durchführen Sie der Aufheizvorgang in einem chemischen Abzug, und immer überwachen Sie die Temperaturerhöhung um sicherzustellen, dass keine bräunliche Gas aus der PTFE-Flaschen-Verschlüsse entweicht.</li>
	<li>Ziehen Sie die Verschlüsse und kühlen sie bei Raumtemperatur für ca. 1 h.</li>
	<li>Stelle den Trichter mit Filter Papiere auf 25 mL Volumetrische Fläschchen und waschen die restliche Flüssigkeit mit 1 M Druckaufschluss3 zu einem Endvolumen von 25 mL. Anmerkung: Waschen Sie die Flasche für mindestens dreimal und die Schließung zweimal.</li>
	<li>Überprüfen Sie die analytische Qualität der ICP-MS-Analyse mithilfe der standard-Referenz-Materialien, einschließlich DOLT-2 (Dogﬁsh Leber) und Wohnheim-2 (Dogﬁsh Muskel).</li>
	<li>Verwenden Sie Duplikate jeder analytische Probe und Triplicates von standard Referenzmaterialien für ICP-MS-Analyse.</li>
	<li>Im Durchschnitt der Ag-Konzentrationen von jedem analytischen Proben und präsentieren der Daten als Trockengewicht Grundlage Konzentration (μg/g Trockengewicht).</li>
</ol>(2) Gewebe Probenvorbereitung für die AMG-Analyse
<ol><li>Paar passende Leber und Niere Gewebe für AMG Analyse von einem gestrandeten Wal zu sammeln und bis zum Gebrauch in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixieren. Hinweis: Bewahren Sie die Gewebeproben in Plastikflaschen in 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF, pH 7.0) für 24 bis 48 Stunden. Das Volumen der NBF sollte mindestens 10-mal größer als die Gewebevolumens.</li>
	<li>Trimmen Sie der Formalin fixiert Leber und Niere Gewebe mit Einweg-Mikrotom Klingen aus rostfreiem Stahl und die getrimmten Gewebeschnitte in Kassetten mit Etiketten. Hinweis: Die Größe der einzelnen Gewebeschnitte sollte ca. 2 cm x 1 cm und die Dicke der einzelnen Gewebe sollte höchstens 3 mm. Legen Sie die Leber und Niere Gewebe von der gleichen Person in der gleichen Kassette.</li>
	<li>Austrocknen der getrimmte Gewebe Abschnitte mit einem Gewebe-Prozessor durch eine Reihe von abgestuften Ethanol (70 % für 1 h, 80 % für 1 h, 95 % 1 h, 95 % für 2 h, 100 % für 1 h x 2 Färbung Gerichte und 100 % für 2 h), nicht-Xylol (für 1 h und 2 h in verschiedenen befleckenden Gerichte) , und Tauchen Sie die dehydrierte Gewebeproben in Parafﬁn (für 1 h und 2 h in verschiedenen befleckenden Gerichten).</li>
	<li>Legen Sie die dehydrierte Gewebeproben in den Böden von Stahl Histologie Formen und Betten Sie dehydrierte Gewebeproben mit Paraffin ein.</li>
	<li>Kühlen Sie die Formalin Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe Blöcke auf kalte Platte fest, bis das Paraffin erstarrt. Schneiden Sie die Proteinkinase-Blöcke mit Mikrotom, bis die Gewebeoberfläche ausgesetzt ist.</li>
	<li>Entspannen Sie die Proteinkinase Blöcke −20 ° C für 10 min. Abschnitt die Proteinkinase-Blöcke bei 5 µm Mikrotom.</li>
	<li>Füllen Sie ein Wasserbad mit bidestilliertem Wasser bei 45 ° C. Heben Sie die Bänder von Gewebeschnitten und machen sie auf der Oberfläche des warmen Wassers Schwimmen mit Pinzette und Pinsel.</li>
	<li>Trennen Sie die Bänder der Gewebeschnitte mit einer Pinzette. Legen Sie einen Abschnitt auf einen Objektträger.</li>
	<li>Legen Sie den Objektträger auf einer Folie wärmer und lassen Sie Abschnitte über Nacht trocknen bei 37 ° C.</li>
	<li>Setzen Sie den Objektträger in Folie-Racks und deparaffinize sie durch Einweichen in 3 verschiedenen befleckenden Gerichte der reine nicht-Xylol (ca. 200 bis 250 mL) für 8, 5 und 3 min.</li>
	<li>Hydrat die Gewebeschnitte in Folie-Racks durch Einweichen in verschiedenen befleckenden Gerichten abgestufte Ethanol Lösungen (100 % Äthanol zweimal, einmal 90 % Ethanol und 80 % Ethanol einmal [1 min]), und spülen Sie sie in bidestilliertem Wasser. Hinweis: Diese Lösungen sind etwa 200 bis 250 mL in verschiedenen befleckenden Gerichten. Bei jedem Waschgang reicht 30 sec.</li>
	<li>Das Gewebe in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,5 % Triton x-100, Waschen mit PBS für mehrere Male Abschnitten, und spülen Sie sie dann in bidestilliertem Wasser spülen. Hinweis: Diese Lösungen sind etwa 200 bis 250 mL in verschiedenen befleckenden Gerichten. Für jeden war, reicht 30 sec.</li>
	<li>Bereiten Sie gleiche Mengen der drei Komponenten (Initiator, Moderator und Aktivator) zur Verfügung gestellt vom Silber Erweiterung Kit in Dunkelheit und mischen Sie gründlich. Hinweis: Die Lösungen der Moderator und Aktivator sind klebrig, so benutzen Sie bitte pipette mit Breite Spitze Öffnungen (oder schneiden Sie die Tipps für größere Öffnungen zu erstellen). Für jede Folie ist in der Regel genug 300 μL der gemischten Lösung (abhängig von der Größe des Abschnitts Gewebe). Wenn 10 Folien verwendet werden, also die Menge der einzelnen Komponenten (Initiator, Moderator und Aktivator) 1000 μL (gemischte Lösung ist 3000 μl für 10 Folien).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Gewebeschnitte in der gemischten Lösung für 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Decken Sie vollständig die Gewebeschnitte auf den Folien mit der gemischten Lösung. Eine längere Inkubationszeit kann zu falsch-positiven AMG Signale führen.</li>
	<li>Der Objektträger mit bidestilliertem Wasser waschen und Färben sie in Hämatoxylin für 10 s als eine gegenfärbung.</li>
	<li>Der Objektträger mit fließendem Leitungswasser waschen, abtrocknen und mit Eindeckmittel zu montieren.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Folien unter einem Lichtmikroskop.</li>
	<li>Nach dem Zufallsprinzip erfassen Sie zehn histologische Bilder mit einem 40 X Objektiv von jedem Gewebe Abschnitt mithilfe einer angeschlossenen Digitalkameras mit Bildbearbeitungssoftware Computer.</li>
</ol>(3) Semi-Quantitative Analyse für AMG Positive Werte der histologische Bilder
Hinweis: AMG positiver Wert bedeutet den Prozentsatz des Bereichs mit AMG positive Signale.
<ol><li>Die histologische Bilder analysieren mittels Bildanalyse-Software (ImageJ).</li>
	<li>Das histologische Bild durch Drücken Datei öffnen | Offene.</li>
	<li>Das ausgewählte Bild in drei Farbkanäle (rot, blau und grün) aufgeteilt, durch Drücken der Bild | Typ | RGB-Stack.
</li>
	<li>Quantifizieren Sie die AMG positive Signale mit den Blau-Kanal. Nukleare falsche positive Signale sind in der Regel unter den blauen Kanal verringert, wenn Hämatoxylin Fleck für nukleare gegenfärbung (Abbildung 2) angewendet wird.</li>
	<li>Messen Sie den Prozentsatz des Bereichs mit AMG positive Signale in jeder histologischen Bild mit dem Schwellenwert-Werkzeug (Bild | Anpassen | Schwelle).</li>
	<li>Manuell anpassen der Grenzwert des Schwellenwerts für jedes histologischen Bild (von 90 bis 110) basierend auf das Vorhandensein der falschen positive Bereiche in Kerne und/oder roten Blutkörperchen. Hinweis: In Verzug zu setzen, sollte die AMG positive Signale in rot hervorgehoben werden.</li>
	<li>Presse analysieren | Legen Sie Messungen, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bereich Bruchteil angeben, dass der Bereich Bruchteil erfasst wird.</li>
	<li>Presse analysieren | Maßnahme. Die positive Prozent Bereich jedes histologischen Bildes wird in der Spalte % Bereich des Ergebnisfensters angezeigt.</li>
	<li>Im Durchschnitt die positive prozentuale Bereiche 10 histologische Bilder von jedem Gewebe-Abschnitt und definieren Sie das Ergebnis als der AMG positive Wert für jeden Abschnitt des Gewebes.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig2.jpg"> Abbildung 2: das Vorhandensein von nuklearen falsche positive Signale unter verschiedenen Farbkanäle (gegenfärbung: Hämatoxylin Fleck). Repräsentative nuklearen falsche positive Signale sind durch gelbe Pfeile angedeutet. PPA = positiven Prozentwert der Bereiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
4. Einrichtung der Wale histologischen Ag-Assay (CHAA) durch Regressionsmodell
Hinweis: Die folgende Analyse wird im Prisma 6.01 für Windows durchgeführt.
<ol><li>Die Korrelation zwischen den Ergebnissen der ICP-MS und AMG positive Werte zu bewerten.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software, erstellen Sie eine neue Projektdatei enthält, und wählen Sie XY und Korrelation.
</li>
	<li>Input-Daten einschließlich der Ergebnisse der ICP-MS und AMG positive Werte.</li>
	<li>Presseschau und Korrelation zu wählen, unter der Kategorie XY-Analyse , die Stärke der Verbindung zwischen den Ergebnissen der ICP-MS und AMG bei positiven Werten von Pearson Korrelationsanalyse zu analysieren. Hinweis: Die Ergebnisse der ICP-MS und AMG positive Werte müssen positiv miteinander korreliert werden. Andernfalls sollten die nachfolgenden Regressionsmodell nicht entwickelt werden.</li>
	<li>Vergleichen Sie statistisch die Regressionsmodelle, einschließlich lineare Regression, quadratische Regression, kubische Regression und lineare Regression über Origin, durch Statistiken Software12,26,27. Hinweis: Wenn das Regressionsmodell eine unrealistische Ag Konzentration erzeugt, sollte das Regressionsmodell verlassenen12sein.</li>
	<li>Zurück in der Datentabelle (links) und Presseschau | Nicht-lineare Regression (Kurvenanpassung) unter der Kategorie XY Analyse | "OK".</li>
	<li>Im Fenster Parameter: nicht-lineare Regression, wählen Sie verschiedene Regressionsmodell in der Seite passen und dann vergleichen verschiedene Regressionsmodelle auf der Seite vergleichen.</li>
	<li>Wählen Sie auf der Seite vergleichendie Vergleichsmethoden, einschließlich der Summe der Quadrate extra F-Test und Akaikes Information Kriterium (AIC). Verwenden Sie nach den Ergebnissen der Vergleichsmethoden eine relativ angemessene Regressionsmodell in der CHAA.</li>
	<li>Schätzen Sie Ag-Konzentrationen der Wale Leber und Niere Gewebe mit unbekannten Ag Konzentrationen mithilfe der CHAA.</li>
	<li>Die Genauigkeit und Präzision von CHAA für Leber und Niere Gewebe zu bewerten. Der Unterschied zwischen Präzision und Genauigkeit ist in Abbildung 3dargestellt.</li>
	<li>Genauigkeit: Berechnen Sie die mittlere Standardabweichung (SD) aus den Unterschieden zwischen bekannten und geschätzten Ag-Konzentrationen.</li>
	<li>Präzision: Führen Sie wiederholte Messung (mindestens dreifacher) AMG positive Werte von Schnittserien aus dem gleichen FFPE-Gewebe. Berechnen Sie den Mittelwert SD der Messungen von Leber oder Niere Gewebe aus Unterschieden zwischen bekannten und geschätzten Ag-Konzentrationen Hinweis: Die Methoden zur Bewertung der Genauigkeit und Präzision sind in Abbildung 4dargestellt.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig3.jpg"> Abbildung 3: der Unterschied zwischen Genauigkeit und Präzision. Genauigkeit bedeutet, wie nah die Messung an den wahren Wert (d. h. Ag Konzentration bestimmt durch ICP-MS); Präzision bedeutet die Reproduzierbarkeit der Messung (d. h., die Konsistenz zwischen der wiederholten Messungen von AMG positive Werte von dreifacher Gewebeschnitte). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig4.jpg"> Abbildung 4: das Schema, die Darstellung der Methoden zur Bewertung der Genauigkeit und Präzision. CHAA = Wal histologischen Ag Assay; Proteinkinase = Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten; ICP-MS = induktiv gekoppelten Plasma Massenspektroskopie; AI = jeweils der Ag Konzentrationen bestimmt durch ICP-MS von jedem Paar abgestimmt Gewebeprobe; BI = jeweils der Ag Konzentrationen geschätzt von CHAA jedes Paar abgestimmt Gewebeprobe; CI, Di und Ei = jeweils der Ag-Konzentrationen geschätzt von CHAA dreifacher Proben aus jedem Paar abgestimmt Gewebeprobe; Ich = 1 bis n. Finden Sie die Rohdaten der Genauigkeit und Präzision Tests im Bereich der repräsentative Ergebnisse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
5. Abschätzung der Ag-Konzentrationen von CHAA.
<ol><li>Die Leber und Niere Gewebe von gestrandeten Walen zu sammeln und in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixieren.</li>
	<li>Das Formalin fixiert Gewebe routinemäßig zu verarbeiten (siehe Schritt 2).</li>
	<li>Die Ag-Konzentrationen der Wale Leber und Niere Gewebe mit unbekannten Ag-Konzentrationen von CHAA zu schätzen (siehe Schritte 3 und 4).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der Zweck der Artikel Studie soll eine adjuvante Methode, Ag Quantil Unterorgan Ebenen und Ag-Konzentrationen im Gewebe Wale abzuschätzen. Die aktuellen Protokolle umfassen (1) Ermittlung der Ag-Konzentrationen in Wale Geweben von ICP-MS, (2) AMG Analyse von paar abgestimmt Gewebeproben mit bekannten Ag Konzentrationen (3) Einrichtung des Regressionsmodells (CHAA) für die Schätzung der Ag-Konzentrationen von AMG positive Werte, 4) Bewertung der Genauigkeit und Präzision von CHAA und 5) Schätzung der Ag-Konzentrationen vo...

Silber-Nanopartikel (AgNPs) wurden ausgiebig in kommerziellen Produkten, einschließlich Textilien, Kosmetika und Gesundheitswesen Elemente, aufgrund ihrer großen antimikrobiell1,2eingesetzt. Daher sind die Herstellung von AgNPs und die Anzahl der Psychopharmakologie-haltigen Arzneimitteln über Zeit3,4erhöht. Jedoch AgNPs in die Umwelt freigesetzt werden und reichern sich in den Ozean5,6. Sie sind die wichtigste Quelle der Verunreinigung Ag geworden, und das öffentliche Bewusstsein für die ökologische Toxizität der Ag steigt.
Der Status des AgNPs und der Ag in der Meeresumwelt ist kompliziert und verändert sich ständig. Früheren Studien ergaben, dass AgNPs bleiben kann, wie Partikel, Aggregat, auflösen, mit verschiedenen chemischen Spezies reagieren oder vom Ag+ -Ionen7,8regeneriert werden. Verschiedene Arten von Ag-Verbindungen, wie AgCl, wurden in marinen Sedimenten gefunden, wo sie können von benthischen Organismen aufgenommen werden und geben Sie die Nahrungskette9,10. Nach einer früheren Studie in der Chi-Ku-Lagune entlang der südwestlichen Küste von Taiwan Ag-Konzentrationen von marinen Sedimenten sind extrem niedrig und ähnlich wie die Erdkruste Fülle und denen der Fisch Leber Gewebe sind in der Regel unter den Nachweis begrenzen Sie (&lt; 0,025 μg/g nass/nass)11. Frühere Studien, die in verschiedenen Ländern haben jedoch relativ hohe Ag-Konzentrationen in den Lebern von Walen12,13gezeigt. Die Ag-Konzentration in den Lebern von Walen ist altersabhängig, was darauf hindeutet, dass die Quelle AG in ihrem Körper am ehesten ihre Beute12. Diese Ergebnisse weiter deuten die Biomagnifikation Ag bei Tieren auf höheren trophischen Ebenen. Wale und Delfine, können als Spitzenprädatoren in den Ozean negative gesundheitliche Auswirkungen der Ag/Ag Verbindungen12,13,14erlitten haben. Am wichtigsten ist, wie Wale sind Menschen Säugetiere und die negativen gesundheitlichen Auswirkungen der Ag/Ag-Verbindungen in Walen auch beim Menschen auftreten können. Mit anderen Worten könnte Wale Sentinel Tiere für die Gesundheit der Meeresumwelt und der Menschen. Daher sind die Auswirkungen auf die Gesundheit, die Gewebeverteilung und Konzentration der Ag in Wale von großer Bedeutung.
Obwohl die Konzentrationen von Ag/Ag-Verbindungen in Wale Gewebe durch Massenspektroskopie induktiv gekoppelte Plasma (ICP-MS) gemessen werden können, ist der Einsatz von ICP-MS durch seine hohe Kapitalkosten (Instrument und Wartung) und die Anforderungen für die Lagerung von Gewebe begrenzt. Definition-12,-15. Darüber hinaus ist es in der Regel schwierig, umfassende Gewebeproben bei allen Untersuchungen der gestrandete Wale Fälle aufgrund logistischer Schwierigkeiten, ein Mangel an Arbeitskräften und ein Mangel an verwandte Ressourcen12zu sammeln. Die gefrorene Gewebeproben für ICP-MS-Analyse liegen nicht einfach aus Platzgründen begrenzt Kältetechnik und gefrorene Gewebeproben können aufgrund der gebrochenen Kältetechnik Anlagen12verworfen werden. Diese vorgenannten Hindernisse erschweren Untersuchungen der Kontamination in Wale Geweben von ICP-MS-Analyse mit gefrorene Gewebeproben. Im Gegensatz dazu Formalin fixiert Gewebeproben sind relativ einfach, während der Autopsie der Toten-Stranded Wale zu sammeln. Daher ist es notwendig, eine benutzerfreundliche und kostengünstige Methode, um erkennen/Schwermetalle in Wale Geweben Messen mit Formalin fixiert Gewebeproben zu entwickeln.
Obwohl die Unterorgan Distributionen und Konzentrationen von Alkali- und Alkali-Erden-Metalle während der Formalin fixiert verändert werden können, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Prozess, nur weniger Auswirkungen auf die Übergangsmetalle wie Ag, wurden bekannte16. Daher galt als ideale Probe Ressource für Metall Lokalisierung und Messungen16,17FFPE Gewebe. Autometallography (AMG), eine histochemische Prozess können Schwermetalle als variabel Größe goldgelb bis schwarz AMG positive Signale auf FFPE Gewebe Abschnitte zu verstärken, und diese verstärkt Schwermetalle unter Lichtmikroskopie18, visualisiert werden 19 , 20 , 21. daher die AMG-Methode informiert über die Unterorgan Verteilungen von Schwermetallen. Es kann wichtige zusätzliche Informationen für das Studium der Stoffwechselwege von Schwermetallen in biologischen Systemen, weil ICP-MS nur, die Konzentration von Schwermetallen an der Orgel Level18 messen könnenbieten. Darüber hinaus hat die Quantitative Analyse der histologischen Gewebe Abschnitte22,23digitale Bildanalyse-Software, wie z. B. ImageJ, zugewiesen. Variabel-Größe goldgelb bis schwarz AMG positive Signale der FFPE Gewebe Abschnitte kann quantifiziert und verwendet, um die Konzentrationen von Schwermetallen zu schätzen. Obwohl die absolute Konzentration Ag direkt nach der AMG-Methode mit quantitativen Bildanalyse bestimmt werden kann, kann es geschätzt werden durch ein Regressionsmodell, basierend auf den Daten aus der quantitativen Bildanalyse und ICP-MS, die Cetacean benannt ist histologischen Ag-Assay (CHAA). Angesichts der Schwierigkeiten bei der Messung der Ag-Konzentrationen durch ICP-MS-Analyse in die meisten gestrandeten Walen, CHAA ist eine wertvolle adjuvante Methode zur Ag-Konzentrationen im Wal Gewebe zu schätzen, die von ICP-MS-Analyse aufgrund der fehlenden nicht ermittelbar eingefroren Gewebeproben. Dieses Papier beschreibt das Protokoll einer histochemische Technik (AMG-Methode) zur Lokalisierung Ag auf Unterorgan Ebene und ein Test namens CHAA, die Ag-Konzentrationen in der Leber und Niere Gewebe von Walen zu schätzen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig1.jpg"> Abbildung 1: Flussdiagramm Darstellung der Einrichtung und Anwendung der Wale histologischen Ag-Assay (CHAA) für die Schätzung der Konzentration Ag. CHAA = Wal histologischen Ag-Assay, Proteinkinase = Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten, ICP-MS = induktiv gekoppelten Plasma Massenspektroskopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>HQ Silber Verbesserungskit</td><td>Nanosonden</td> <td># 2012</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td>Paraffin</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>4026</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-Xylol</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>4328</td><td></td></tr><tr><td>Silan beschichteter Objektträger</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>511614</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas (25 x 50 mm)</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>24501</td><td></td></tr><tr><td>Malinol</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>20092</td><td></td></tr><tr><td>GM Hämatoxylin-Färbung</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>3008-1</td><td></td></tr><tr><td>10% neutrale gepufferte Formalinlösung</td><td>Chin I Pao Co., Ltd</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>Spitze (1000 &mu; L)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic P1000</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td>F123602</tr><tr><td>15 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>GeneDireX, Inc.</td><td>PC115-0500</td><td></td></tr><tr><td>Dornhaileber</td> National <td>Research Council of Canada</td><td>DOLT-2</td><td></td></tr><tr><td>Dornhaimuskel</td><td>National Research Council of Canada</td><td>DORM-2</td><td></td></tr><tr><td>Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS)</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>PE-SCIEX ELAN 6100 DRC</td><td></td></tr><tr><td>FreeZone 6 Liter Gefriertrocknungssystem</td><td>Labconco</td><td>7752030</td><td>Für die Gefriertrocknung</td></tr><tr><td>MARKE&reg; SILBERBRAND Messkolben</td><td>Merck</td><td>Z326283</td><td></td></tr><tr><td>30 mL Standardfläschchen, flacher Innenraum mit 33 mm Verschluss</td><td>Savillex Corporation</td><td>200-030-12</td><td>Für die Diagestion</td></tr><tr><td>Salpetersäure, superpur&reg;, 65,0%</td><td>Merck</td><td>1.00441</td><td>Für die Diagestion</td></tr><tr><td>Heizplatte/Rührer</td><td>Corning&reg;</td><td>PC-220</td><td>Für die Diagestion</td></tr><tr><td>High-Shear-Labormischer</td><td>Silverson</td><td>SL2T</td><td>Für die Homogenisierung</td></tr><tr><td>Steriles Probengefäß aus Polypropylen (250 ml)</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>6186L05</td><td>Für die Homogenisierung</td></tr><tr><td>Digitalkamera</td><td>Nikon Corporation</td><td>DS-Fi2</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Nikon Corporation</td><td>ECLIPSE Ni-U</td><td></td></tr><tr><td>Shandon&trade; Finesse&Handel; 325 manuelles Mikrotom</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td></td><td></td>A78100001H</tr><tr><td>Accu-Cut&reg; SRM&Handel; 200 rotierendes Mikrotom</td><td>Sakura</td><td>1429</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom-Klinge S35</td><td>FEATHER&reg;</td><td>207500000</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger-Färbeschale und -abdeckung</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3215</td><td></td></tr><tr><td>Färbegestell aus Stahl</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3003</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Einbettungszentrum</td><td>Thermo Scientific & trade;</td><td>S-EC</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Citadel&reg; Tissue-Verarbeiter</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td></td><td></td>69800003</tr><tr><td>Diawärmer</td><td>Lab-Line Instruments</td><td>26005</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Shandon Capshaw</td><td>3964</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Merck</td><td>1541-070</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6.01 für Windows</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>Statistiksoftware</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl Gewebeeinbettungsform</td><td>Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd</td><td>RD-TBM003</td><td>Für Paraffin-Emedding</td></tr></tbody></table>

verwendung von autometallography zu lokalisieren und semi-quantifizierung silber im wal gewebe

Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues

Silber-Nanopartikel (AgNPs) wurden ausgiebig in kommerziellen Produkten, einschließlich Textilien, Kosmetika und Gesundheitswesen Elemente aufgrund ihrer starken antimikrobiellen Wirkung eingesetzt. Sie auch in die Umwelt freigesetzt werden und reichern sich in den Ozean. Daher AgNPs sind die Hauptquelle der Ag Kontamination und Sensibilisierung der Umwelttoxizität von Ag steigt. Frühere Studien haben die Bioakkumulation (in Produzenten) und Vergrößerung (in Verbraucher/Raubtiere) der Ag gezeigt. Wale und Delfine, können als Spitzenprädatoren des Ozeans, negativ von der Ag/Ag-Verbindungen betroffen sind. Obwohl die Konzentrationen von Ag/Ag-Verbindungen in Wale Gewebe durch Massenspektroskopie induktiv gekoppelte Plasma (ICP-MS) gemessen werden können, ist der Einsatz von ICP-MS durch die hohen Investitionskosten und die Forderung nach Gewebe Lagerung/Vorbereitung begrenzt. Daher, eine Autometallography (AMG) Methode mit einer quantitativen Bildanalyse mit Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe möglicherweise eine adjuvante Methode Ag Vertrieb Ebene Unterorgan zu lokalisieren und schätzen die Ag-Konzentration im Wal Gewebe. Die positiven Signale von AMG sind vor allem braun bis schwarz Granulate in verschiedenen Größen im Zytoplasma der proximalen renale tubuläre Epithel, Hepatozyten und Kupffer Zellen. Gelegentlich sind einige amorphen goldgelb bis braun AMG positive Signale in das Lumen und Basalmembran von einigen proximalen Nierentubuli zur Kenntnis genommen. Der Assay für die Schätzung der Konzentration Ag ist die Cetacean histologischen Ag Assay (CHAA), benannt, die ein Regressionsmodell festgelegten Daten aus quantitativen Bildanalyse der AMG-Methode und ICP-MS ist. Die Verwendung von AMG mit CHAA lokalisieren und semi-Quantifizierung Schwermetalle bietet eine bequeme Methode für räumlich-zeitliche und Cross-Arten.

Repräsentative Bilder der AMG positive Signale in den Wal Geweben Leber und Niere sind in Abbildung 5dargestellt. Die AMG positive Signale sind variabel große braune bis schwarze Granulate in verschiedenen Größen im Zytoplasma der proximalen renale tubuläre Epithel, Hepatozyten und Kupffer Zellen. Gelegentlich sind amorphe goldgelb bis braun AMG positive Signale in das Lumen und Basalmembran von einigen proximalen Nierentubuli zur Kenntnis genommen. Es gibt e...

Ein Protokoll wird zum Ag in Wale Leber und Niere Geweben zu lokalisieren von Autometallography präsentiert. Darüber hinaus ist ein neue Assay, benannt die Wale histologischen Ag-Assay (CHAA) entwickelt, um die Ag-Konzentrationen in den Geweben zu schätzen.

Verwendung von Autometallography zu lokalisieren und semi-Quantifizierung Silber im Wal Gewebe

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Umwelttoxikologie über Suborganverteilungen und die Konzentration von Schwermetallen in biologischen Systemen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass AMG eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methodik ist, das ein wertvolles Adjuvans für die Untersuchung von Schwermetallen in Geweben ist. Wir verwenden das Gewebe von Delfinen und Walen, um das Protokoll zu demonstrieren.Wir glauben jedoch, dass das Protokoll bei einer Vielzahl von Tierarten verwendet werden könnte. Demonstriert wird das Verfahren mit Wen-Ta Li, einem Arzt unseres Instituts. Beginnen Sie mit dem Sammeln von paarabgestimmten Leber- und Nierengewebefür die AMG-Analyse von einem gestrandeten Wal und fixieren Sie das Gewebe in 10-mal dem Volumen von 10% neutral gepuffertem Formalin für 24 bis 48 Stunden.Als nächstes verwenden Sie Einweg-Mikrotomklingen aus Edelstahl, um das formal fixierte Leber- und Nierengewebe um einen Zentimeter, Drei-Millimeter-Abschnitte, in zwei Zentimeter zu trimmen und leber- und Nierenabschnitte desselben Individuums in die gleichen beschrifteten Kassetten zu legen. Dehydrieren Sie die Abschnitte in einem Gewebeprozessor durch eine Reihe von abgestuften Ethanol- und Xylol-Eintauchen, gefolgt von einstündigen und zweistündigen Paraffin-Eintauchen. Nach dem zweistündigen Paraffin-Eintauchen das Gewebe auf die Böden der Stahlhistologieformen übertragen und die dehydrierten Gewebeproben mit frisch geschmolzenem Paraffin einbetten.Kühlen Sie die formalfixierten, paraffin-eingebetteten Gewebeblöcke auf einer kalten Platte, bis das Paraffin erstarrt, und trimmen Sie jeden Block am Mikrotome, bis die Gewebeoberfläche freigelegt ist. Kühlen Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius für 10 Minuten, und erhalten Sie fünf Mikrometer Gewebeabschnitte auf dem Mikrotom. Heben Sie die Bänder des Gewebeteils mit Einer Pinzette und Bürsten an, während sie erworben werden, und schweben Sie sie auf die Oberfläche eines 45 Grad Celsius doppeldestillierten Wasserbades, bis sie getrennt werden können, und legen Sie sie auf einzelne Mikroskopschlitten.Dann legen Sie die Rutschen auf einem Diawärmer für eine Stunde, bei 60 Grad Celsius. Legen Sie dann die Dias in Diagestelle und deparaffinisieren Sie die Abschnitte in drei verschiedenen Färbeschalen, die 200 bis 250 Milliliter reines Nicht-Xylol für acht-fünf- und dreiminütige Inkubationen enthalten. Hydratisieren Sie die deparrafinisierten Proben in verschiedenen Färbeschalen von abgestuften Ethanollösungen, gefolgt von dem Spülen in doppelt destilliertem Wasser.Spülen Sie die Abschnitte einmal in PBS, ergänzt mit 5%Triton X 100, mehrmals in PBS allein und einmal in frischem doppelt destilliertem Wasser für 30 Sekunden pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche jede Probe mit 300 Mikroliter n.A. gemischte silber Verbesserung Kit Lösung, für nicht mehr als 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Dias mit doppelt destilliertem Wasser waschen und die Abschnitte in 300 Mikroliter Hämatoxylin pro Schlitten 10 Sekunden lang gegenfärben.Waschen Sie die Rutschen mit fließendem Leitungswasser. Trocknen Sie sie und montieren Sie die Abschnitte mit Montagemedium. Erfassen Sie dann 10 zufällige histologische Bilder von jedem Gewebeabschnitt unter dem 40-fachen Objektiv eines Lichtmikroskops.Um die Positivität der Stichproben zu analysieren, oder AMG, öffnen Sie die Bilder in einem geeigneten Bildanalyse-Softwareprogramm, und wählen Sie Bild, Typ und RGB-Stack aus, um das erste Bild in die roten, blauen und grünen Farbkanäle aufzuteilen. Wählen Sie im blauen Kanal Bild, Anpassen und Schwellenwert aus, um den Prozentsatz der Fläche mit AMG-positiven Signalen in jedem Bild zu messen, wobei der Grenzwert für den Schwellenwert jedes Bildes manuell basierend auf dem Vorhandensein falsch-positiver Bereiche in den Kernen oder roten Blutkörperchen angepasst wird. Klicken Sie auf Analysieren, Festlegen von Messungen, und überprüfen Sie den Flächenanteil, um anzugeben, dass der Flächenanteil aufgezeichnet wird.Klicken Sie auf Analysieren und Messen, um den positiven Prozentbereich jeder histologischen Bildprozentbereichsspalte des Ergebnisfensters anzuzeigen. Um die Korrelation zwischen den Ergebnissen der induktiv gekoppelten Plasmamassenspektroskopie und AMG-positiven Werten zu bewerten, öffnen Sie die entsprechende Graphiksoftware. Erstellen Sie eine neue Projektdatei, und wählen Sie XY und Korrelation aus.Geben Sie die Ergebnisse der induktiv gekoppelten Plasmamassenspektroskopie und AMG-Analysen ein, und wählen Sie Analyse und Korrelation aus, um die Stärke der Assoziation zwischen den Ergebnissen der Analyse durch Pearson-Korrelationsanalyse zu analysieren. Wählen Sie im nichtlinearen Regressionsfenster ein anderes Regressionsmodell auf der Anpassungsseite aus, und wählen Sie die Vergleichsmethoden auf der Vergleichsseite aus. Schließen Sie die zusätzliche Summe der Quadrate F-Test und Akaikes Informationskriterium ein.Wählen Sie nach den Ergebnissen der Vergleichsmethoden ein relativ geeignetes Regressionsmodell im walesischen histologischen Silbertest aus und verwenden Sie den Assay, um die Silberkonzentrationen der Walleber und des Nierengewebes mit unbekannten Silberkonzentrationen zu schätzen. AMG-positive Signale sind variabel große, braune bis schwarze Granulate im Zytoplasma von Hepatozyten und Kupffer-Zellen sowie gelegentlich emorphe, goldgelbe bis braune AMG-positive Signale im Lumen und in der Kellermembran einiger proximaler Nierentubuli. Es besteht eine positive Korrelation zwischen den Ergebnissen der induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektroskopie und AMG-Positivitätswerten im analysierten Leber- und Nierengewebe, mit einer bevorzugten linearen Regression durch den Ursprung, entsprechend der zusätzlichen Summe der Quadrate F-Test, und Akaikes Informationskriterium.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die AMG-Methode eine adjuvante Methode ist und mit anderen spezifischen Methoden wie ICPMS zur Überwachung der tatsächlichen Zusammensetzung von Schwermetallen in Geweben verwendet werden muss.

use-autometallography-to-localize-semi-quantify-silver-cetacean

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Quelle: Hare, D. J., et.al.  Bildgebung von Metallen im Hirngewebe durch Laserablation - Induktiv gekoppeltes Plasma - Massenspektrometrie (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert die Verwendung der Laserablations-Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (LA-ICP-MS) zur Visualisierung und Quantifizierung von Metallverteilungen im Hirngewebe von Mäusen. Das Protokoll umfasst die Laserablation zur Erzeugung eines Aerosols aus Probenpartikeln, die Ionisierung der...

Laserablations-induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie zur Visualisierung von Metallen im Hirngewebe von Mäusen

Dieses Papier zeigt die zum Sondieren räumlich korrelierten chemischen, strukturellen und mechanischen Eigenschaften des Mehrschicht Maßstab Atractosteus Spatel (A. Spatel) mit Nanoindentierung Methoden, Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR), Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Röntgen Strahl-Computertomographie (Röntgen-CT). Die experimentellen Ergebnisse wurden verwendet, um die Konstruktionsprinzipien der Schutz biologischen Materialien zu untersuchen.

Charakterisierung von mehrschichtigen Fischschuppen (<em&gt; Atractosteus Spachtel</em&gt;) Verwendung Nanoindentierung, Röntgen-CT-, FTIR-und SEM

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung von zwei monoklonalen Antikörpern (mAbs) der IgG-Klasse, die stark auf Myoglobin von Walen reagieren. Diese mAbs werden auf einen kolloidalen immunchromatographischen Goldteststreifen aufgebracht, der auf dem Sandwichformat basiert, um das Mb von Walen und Delfinen von Robben und anderen Tieren zu unterscheiden.

Entwicklung eines Kolloidales-Gold-basierten Immunchromatographischer Teststreifen zum Nachweis von Cetacean Myoglobin

Embryonale Stadien sind am anfälligsten für Xenobiotika. Obwohl die chemische Toxizität vom Salzgehalt abhängt, gibt es keine Methode, um die Abhängigkeit der Toxizität von Wasserorganismen vom Salzgehalt zu testen. Hier beschreiben wir eine neue Hochdurchsatzmethode zur Bestimmung der Salzgehaltsabhängigkeit der Toxizität an aquatischen Embryonen.

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Besondere Sorgfalt bei der Verwendung von "sauberen Techniken" ist erforderlich, um Wasserproben für Spurenmetallstudien in aquatischen Umgebungen ordnungsgemäß zu sammeln und zu verarbeiten. Es wird ein Protokoll für Probenahme-, Verarbeitungs- und Analyseverfahren mit dem Ziel vorgestellt, zuverlässige Umweltüberwachungsdaten und -ergebnisse mit hoher Sensitivität für detaillierte Spurenmetallstudien zu erhalten.

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Quantitativ Metalle in Gewebe durch Laserablation Kartierung - induktiv gekoppelter Plasma - Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) ist eine empfindliche analytische Technik, die in neue Erkenntnisse liefern kann, wie Metalle in normaler Funktion und Krankheitsprozessen teilzunehmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Metalle in dünnen Schnitten von Mausgewebe neurologischen Bildgebung.

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Wir demonstrieren die Verwendung verschiedener Mikroskopiemethoden, die nützlich sind, um die Verkalkung eines Röhrenwurms, Hydroides elegans, zu beobachten sowie das erste verkalkte Material zu lokalisieren und zu charakterisieren. Lebendmikroskopie und Elektronenmikroskopie werden zusammen verwendet, um funktionelle und materielle Informationen zu liefern, die für die Untersuchung der Biomineralisation wichtig sind.

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Plankton und Schwebeteilchen spielen eine wichtige Rolle in den biogeochemischen Zyklen im Ozean. Hier bieten wir eine Ultra-clean, low-Stress-Methode für die Sammlung verschiedener Größen von Partikeln und Plankton auf hoher See mit der Fähigkeit zur Handhabung großer Mengen von Meerwasser.

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Wir präsentieren einen Test zur einfachen Quantifizierung von Metallen, die in Proben eingeführt werden, die mit der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie hergestellt werden. Das Verfahren verwendet Hydroxynaphtholblau als farbmetrischemetallanzeige und ein UV-Vis Spektralphotometer als Detektor.

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Erfahren Sie die Autometallographie zur Lokalisierung von Silber in Wal-Leber- und Nierengewebe. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die semi-quantitative Analyse von Schwermetallen in marinen Säugetieren.

Verwendung von Autometallography zu lokalisieren und semi-Quantifizierung Silber im Wal Gewebe

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