Name: Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Erfahren Sie die longitudinalen intravitalen Bildgebung von Thymozyten mittels Laser-Scanning-Mikroskopie in thymischen Implantaten der Mäusevorderkammer. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitverfolgung von Progenitorzell-Rekrutierung und reifer T-Zell-Egress.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH-Stipendien R56DK084321 (AC), R01DK084321 (AC), R01DK111538 (AC), R01DK113093 (AC) und R21ES025673 (AC) und durch die besten/2015/043-Bewilligung (Consellería de Educació, Cultura ich Esport, Generalitat Valenciana, Valencia, Spanien) (EO). Autoren danken dem SENT-Team an der Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, Valencia, Spanien und Alberto Hernandez am Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, Spanien für ihre Hilfe mit video Dreh und Schnitt.

Die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Miami genehmigt die Experimente nach IACUC Richtlinien.
1. Isolierung und Trimmen des Neugeborenen Thymi
<ol><li>Bereiten Sie alle Reagenzien und Instrumente durch Autoklavieren oder andere Methoden, sterile Bedingungen zu gewährleisten.</li>
	<li>Um Verunreinigungen zu minimieren, führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter einem Laminar-Flow-Haube.</li>
	<li>Füllen Sie vor euthanizing Spender Mäuse einen sterile 60 Millimeter-Teller mit sterilen prechilled 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) und auf Eis. Es wird zum Spülen und speichern die ausgeschnittenen Thymi von Spender-Mäuse vor der Transplantation verwendet werden.</li>
	<li>Fahren Sie mit Neugeborenen Spender Mäuse durch Enthauptung, im Einklang mit ethischen Richtlinien einschläfern.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf sterile saugfähiges Küchenpapier in einen dorsalen aufrecht und Spray, und später wischen Sie, die Maus Bauch mit 70 % Ethanol.</li>
	<li>Aussetzen der Brusthöhle durch eine oberflächliche v-förmigen Einschnitt auf der Ebene des Unterleibs und schneiden Sie die Haut mit einem Paar von gerade 10 cm präparierscheren nach einer ventralen Mittellinie lassen Sie eine Öffnung von ca. 0,5-1 cm auf der Brust-Ebene. Falten Sie die Haut auf jeder Seite der Brust, der Brusthöhle verfügbar zu machen.</li>
	<li>Machen zwei tiefer 0,5-1 cm seitliche Einschnitte durch das Zwerchfell und Brustkorb mit der gleichen Art der Schere auf die überlegene Mediastinum in der vorderen Brusthöhle zugreifen. Der Thymus sollte als zwei blasse Lappen direkt über dem Herzen erscheinen.</li>
	<li>Legen Sie die gebogene Pinzetten unter dem Thymus und ziehen vertikal um die komplette Orgel zu extrahieren. Verhindern Sie die Foldback des Brustkorbs mit ein paar Zangen. Wenn nötig, feine Pinzette verwenden, um das Bindegewebe rund um die Orgel ohne Unterbrechung die Kapsel vor dem Extrahieren der Orgel sorgfältig auseinander zu reißen. Hinweis: Dieser Schritt ist durch die Verwendung eines sezierenden Bereichs erleichtert.</li>
	<li>Tauchen Sie die isolierten Thymus in kalten sterilen 1 X PBS (pH 7,4) zuvor in eine sterile Schale 60 mm angezeigt, und die verbindende Landenge mit einem Skalpell schneiden die zebrafischembryonen Lappen zu trennen. Entfernen Sie jeglichen Schmutz aus der Schale ohne Schädigung der Kapsel. Zur Minimierung der Zeit Thymi ausgesetzt sind, schneiden Sie Thymian Lappen vor dem Implantat. Hinweis: Jede isolierte Neugeborenen Thymus in der Regel sechs Segmente von ca. 1 mm breit für ein Maximum von drei Mäusen, Host rendert beim Empfang Implantate in beiden Augen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.4-1.9 für jede Spender-Maus. Zur Minimierung der Zeit Thymi ausgesetzt sind, isolieren Sie eine Thymus zu einem Zeitpunkt.</li>
</ol>(2) Thymus Implantation in die Vorderkammer des Auges
<ol><li>Taggen Sie vor der Transplantation und wiegen Sie jeder Empfänger Maus.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Dosis zwischen 1-2 % des Isofluorane Dämpfe um die Empfänger Maus zu betäuben. Richtige Anesthetization durch das Fehlen von reflex folgende Zehe Prise vor dem chirurgischen Eingriff zu gewährleisten.</li>
	<li>Mit Thymus-Segmente-Transplantation wie folgt vorgehen:<ol>
<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in eine seitliche Liegerad Seitenlage, dass ein Auge nach oben direkt auf die Linse des Bereichs sezierenden ausgesetzt.</li>
		<li>Verbrauchssteuern eines isolierten zebrafischembryonen Lappen liegen mit der kalten 1 X PBS-Puffer (pH 7,4)-60 Millimeter-Teller in Stücke mit bis zu 1 mm Breite für Implantat gefüllt. Folgen Sie einem Zick-Zack-Muster um sicherzustellen, dass jedes Segment zebrafischembryonen Cortex und Medulla enthält. Verwenden Sie Vannas Schere zum Zuschneiden nach Richtlinien in Figur 1A. Hinweis: Trimmen des Thymus sollte vor Implantat Gewebe Engraftment Optimierung erfolgen.</li>
		<li>Beginnend in der Basis der Hornhaut, der OP-Bereich entspricht, stellen Sie eine 40 mm G18 Nadelspitze einen kleinen Schnitt in externen Hornhaut Schichten, so dass die sezierenden Schere Tipp eingeführt werden kann.</li>
		<li>Machen Sie eine 5-10 mm Einschnitt direkt um die Basis der Hornhaut mit Vannas Schere halten Sie die Hornhaut Öffnung fest um zu verhindern Wiederverschließen flankieren. Verwenden Sie Zange mit flachen enden, um Gewebeschäden zu vermeiden.</li>
		<li>Fassen Sie die geschnittenen Hornhaut-Epithel und setzen Sie die Öffnung durch die Hornhaut mit einem Paar der Wohnung beendet Zange halten, während ein zebrafischembryonen Segment durch die Öffnung schieben. Befeuchten Sie das Auge mit sterilen 1 x PBS (pH 7,4) oder künstliche Tränen Bedarf Gewebe Austrocknung zu verhindern, bis die Bearbeitung abgeschlossen ist.</li>
		<li>Drücken Sie sanft auf die Augenoberfläche gleiten Segment eingeführten Gewebe zu einer seitlichen Position in Bezug auf die Pupille zu Archiv-Funktion zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Transplantat an einem Standort gegenüber dem Auge öffnenden hinteren Störungen mit Bildgebung durch Trübung liegt.</li>
		<li>Mit Hilfe der flachen Zange, drücken Sie fest, für ca. 3-5 s, die beiden Seiten der Hornhaut Eröffnung gegeneinander selbstdichtend zu fördern. Die Operation erfordert kein Heften oder nähen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn die Transplantate an beiden Augen durchgeführt werden, schalten Sie die Maus über die seitlichen Gegenseite direkt aussetzen des zweiten Auges zu sezierenden Mikroskop-Objektiv und wiederholen die Schritte 2.3.2-2.3.7.</li>
	<li>Nachdem die Operation abgeschlossen ist, zurück die Maus auf einen leeren Käfig mit einer Wärmelampe vorgewärmt.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass jeder transplantierte Maus komplette Mobilität und Bewusstsein wiedererlangt, bevor sie in einen Käfig geteilt mit anderen Tieren platziert. Dies erfolgt in der Regel innerhalb von 1 h nach der Operation.</li>
	<li>Nach Transplantation behandeln Sie die Mäuse mit Schmerzmitteln zu, je nach Bedarf und liefern Sie die Mäuse mit Paracetamol in einer Konzentration von 1,6 mg/mL im Trinkwasser.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,9 für jede Empfänger Maus.</li>
	<li>Monitor postoperative tierische Aktivität sowie das Erscheinungsbild der implantierten Augen, potenzielle gesundheitliche Komplikationen zu erkennen.</li>
</ol>(3) Confocal Imaging implantiert Thymi mit 3D Single Photon konfokale Fluoreszenzmikroskopie
<ol><li>Die Empfänger Maus mit einer Dosis zwischen 1-2 % des Isofluorane Dämpfe zu betäuben. Richtige Anesthetization durch das Fehlen von reflex folgende Zehe Prise vor Beginn der bildgebenden Verfahrens zu gewährleisten</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine fest installierte Bühne-Mikroskop-Plattform in einem seitlichen Liegerad Seitenlage, dass ein Auge nach oben. Ein Wärmekissen befindet sich auf der Mikroskop-Plattform um konstante Körpertemperatur von Mäusen während der Aufnahmen zu gewährleisten. Hinweis: Weitere Informationen ergänzende Abbildung1 .</li>
	<li>Stecken Sie den Kopf der Maus in einer stereotaktischen Headholder und passen Sie den Regler, um die Maus-Kopf auf der lateralen Seitenlage erlaubt Direktzugriff auf das Mikroskopobjektiv für das Auge hält der Thymus-Transplantats zurückhalten.</li>
	<li>Setzen Sie die Maus-Schnauze in eine Gasmaske, das Tier während des gesamten Verfahrens betäubt zu halten. Dies ermöglicht die Anpassung der Isofluorane Dämpfe nach Bedarf.</li>
	<li>Um die Stabilisierung des Auges bei Aufnahmen unter Vermeidung der Retraktion der Augenlider zu erleichtern, nach hinten ziehen die Augenlider halten Sie das Auge auf die Hornhaut-Marge mit einer Pinzette, die haben ihre Spitzen bedeckt von einem Polyethylen-Rohr die beigefügt sind eine UST-2 feste Kreuzgelenk. Diese Anordnung ermöglicht eine stabile Fixierung des Kopfes und des Auges und Flexibilität ohne Unterbrechung des Blutflusses im Auge, wie zuvor beschrieben22. Hinweis: Zusätzliche Figuren 1 b, C zeigen die Komplettmontage.</li>
	<li>Fügen Sie einige Tropfen der sterilen Kochsalzlösung oder künstliche Tränen wie die Immersion Flüssigkeit zwischen die Hornhaut und die Linse vor dem Inverkehrbringen der Maus Auge das Mikroskopobjektiv. Hinweis: zusätzliche Tropfen entfallen auf Notwendigkeit während des Verfahrens zu den Mikroskop Weg und verhindern, dass Auge trocknen.</li>
	<li>Zuerst verwenden Sie geringer Vergrößerung (5 X) Objektiv, um Thymus im Mikroskop-Bereich zu finden. Wechseln Sie dann zu höheren Auflösung (10, 20 und 40 X) Eintauchen in Wasser eintauchen Ziele mit langem Arbeitsabstand. Vermeiden Sie LSM lichtbedingten und Bleichen von zebrafischembryonen Implantat durch die Anwendung minimal Laserleistung und reduzieren Sie Scan-Zeit so weit wie möglich. Dies wird erreicht durch die Verwendung des resonanten Scanners des Mikroskops. Hinweis: Die confocal Mikroskop verwenden wir ist mit resonanten Scan Spiegel in der Lage, Sammeln von Bildern bei 25 Frames/s ausgestattet. Andere Marken haben ihre eigenen Mikroskope mit resonanten Scanner.</li>
	<li>Wählen Sie den Kauf-Modus mit der Mikroskop-Software und starten Sie die resonante Scanner-Modus zu. Dann wählen Sie den XYZT-imaging-Modus und konfigurieren Sie die Übernahme Einstellungen wie folgt:<ol>
<li>Den Argon-Laser einschalten und Einstellen der Leistung um 30 % für Fluoreszenzanregung.</li>
		<li>Wählen Sie eine Laserlinie Erregung und den Akusto-optischen Beam Splitter (AOBS) Regler für verschiedene Emission Wellenlängen. Zusätzlich zur Erkennung Backscatter und Gewebestruktur abzugrenzen, verwenden Sie Reflexion Erkennung gleichzeitig. Hinweis: Wenn Sie eine Reihe von Farben zur Anregung (GFP und RFP) auswählen, ist die AOBS automatisch programmiert leiten diese Erregung Linien auf die Probe und die Emission zwischen ihnen übertragen. Zum Beispiel für GLP und RFP, verwenden wir schmale Reflexion Bänder für Anregungslicht rund 488 nm und 561 nm, beziehungsweise. Dadurch Breite Bändern für die Sammlung von Fluoreszenz emittierten Photonen, wodurch die Notwendigkeit für Laser macht und Erwerb. Im reflektionsmodus dient der AOBS als ein 50/50 Strahlteiler reflektiertes Licht in jede Wellenlänge vom für Fluoreszenz-Emission-Erkennung verwendet Image.</li>
		<li>Sammeln die Emission bei ausgewählten Wellenlänge, dann wählen Sie eine Auflösung von 512 × 512 Pixel und starten live imaging durch Drücken der Schaltfläche " Live ", das Gewinn-Niveau anpassen, je nach Bedarf (typische Gewinn beträgt rund 600 V).</li>
		<li>Definieren Sie Beginn und Ende der Z-Stapel durch die Konzentration auf die Oberseite der zebrafischembryonen Implantats zu und wählen Sie beginnen, dann verschieben Sie zur letzten Ebene, die im implantierten Thymus konzentriert werden und wählen Sie Ende. Verwenden einer Z-Schrittweite von 5 µm. Die Software berechnet automatisch die Anzahl der konfokalen Flugzeuge.</li>
		<li>Wählen Sie das Zeitintervall für den Erwerb von jedem Z-Stapel (in der Regel 1,5 bis 2 Sekunden) und wählen Sie die Option bis zum Stillstand gekommen zu erwerben , für die kontinuierliche Bildgebung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drücken Sie die Starttaste zu initialisieren .</li>
	<li>Bild der Grafts wiederholt zu verschiedenen Zeitpunkten aus dem gleichen Tier durch Wiederholen der Schritte 3.1-3.9. Hinweis: Wenn das Tier Transplantate an beiden Augen hält, können durch Wiederholung der Schritte 3.2-3.9 nach dem Einschalten der aufrechten Position Seite der Maus Aufnahmen aus beiden Augen genommen werden.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Aufgrund der Bedeutung der T-Zell-Reifung für individuelle immun-Kompetenz4 und die mutmaßlichen Auswirkungen der Vorläufer Zelldynamik auf Reifen T-Zellen produziert die Thymusdrüse2,3wurden umfangreiche Bemühungen investiert Alternativen zu den klassischen fixierte Gewebe Snapshot Ansatz zu entwickeln.
Obwohl Gewebe Scheiben und andere Explantaten deutlich überlegen bei der Reproduktion Gewebearchitektur als M...

Intrathymic T-Zell-Differenzierung und T-Zell Subpopulation Auswahl bilden wichtige Prozesse für die Entwicklung und Wartung von zellvermittelte Immunität in Wirbeltieren1. Dieser Prozess beinhaltet eine komplexe Abfolge von straff organisierten Veranstaltungen, einschließlich der Rekrutierung von Vorfahren aus Blut, Zell-Proliferation und Migration, differentielle Expression der Membranproteine und massive programmierten Zelltod für Teilmengen Auswahl. Das Ergebnis ist die Freisetzung von Reifen T-Zellen reagiert auf eine ausreichend Bandbreite an fremde Antigene während der Anzeige minimierter Antworten auf selbst-Peptide, welche enden besiedeln die peripheren lymphatischen Organen der einzelnen2,3. Aberranten Thymocyte Auswahl des Repertoires αβTCR führt zur Autoimmunerkrankung oder immun Ungleichgewicht4 , die vor allem von Mängeln während der Prozesse des negativen oder positiven Vorläufer Auswahl bzw. abgeleitet werden.
Gerichtete Migration von Thymozyten in den Thymus ist untrennbar mit allen Phasen der T-Zell-Reifung und es ist geplant als eine Reihe von gleichzeitige oder sequentielle mehrere Reize, einschließlich Chemokine, Klebstoff, und de-Kleber extrazellulären Matrix (ECM) Protein-Interaktionen3,5. Die Studie von festen Geweben hat wiedergegeben, kritische Informationen über die Muster des Ausdrucks für Thymocyte wandernden Cues in definierten zebrafischembryonen Mikroumgebungen5,6, während Ex-Vivo -Studien ergab zwei weit verbreitet wandernde Verhalten der Thymozyten in zwei histologisch verschiedene Bereiche der Orgel: langsame stochastische Bewegungen im Kortex und schnelle, engen Motilität in der Medulla7,8,9,10 , 11 , 12 , 13. erhöhte wandernden Preise korrelieren mit zebrafischembryonen Positivauswahl13 und negative Auslese krabbelverhalten unterstützen die Hypothese, dass die Kinetik der Reise durch die Thymusdrüse richtig bestimmt zugeordnet ist Reifung der Thymozyten. Trotz ihrer Relevanz bleiben die Topologie des Thymocyte Stromazellen Zell-Interaktionen und die Dynamik der Thymocyte Motilität über Orgel Mikroumgebungen während der T-Zell-Reifung nicht ausreichend geregelt.
Die meisten ex Vivo -Studien durchgeführt, um Datum gehören fetalen oder reaggregate zebrafischembryonen Orgel Kulturen14,15, Gewebe-Scheiben oder intakte zebrafischembryonen Lappen Explantaten wo Thymocyte Bewegungen von zwei-Photonen-Laser-scanning visualisiert werden Mikroskopie (TPLSM)8, untersucht ein intravitalen bildgebendes Verfahren mit einem eingeschränkten Maximum Arbeitsabstand und imaging-Tiefe von 1 mm im Einklang mit dem Gewebe16. Im Gegensatz zu den mühsamen zebrafischembryonen Orgel Kulturen die längere Inkubationszeiten zu 3D-Strukturen abhängen, vorab mit der Bezeichnung zebrafischembryonen Slice-Technik sowohl die intakte zebrafischembryonen Lappen Ansatz Genehmigung kontrolliert Einführung von bestimmten Teilmengen von Thymozyten in einer nativen Gewebe Architektur Umgebung. Jedoch fehlt da Blutfluss ist in diesen Modellen sind sie für das Studium des Recruiting-Prozesses der Thymus Ansiedlung Stammväter (FDA), Thymus Parenchym oder die Dynamik von zebrafischembryonen heraustreten von Reifen T-Zellen deutlich begrenzt.
In-Vivo -Modelle für das Studium der zebrafischembryonen T-Zell-Reifung-Physiologie in den Mäusen gehören die Transplantate Fragmente oder ganze Organ Lappen gelegt, entweder innerhalb der Niere Kapsel17 oder mikrodialysemembranen18. Obwohl sich diese Optionen ihre Nützlichkeit, systemische funktionale Engraftment des Gewebes zu befragen, schränkt die Position des zebrafischembryonen Transplantate tief in das Tier oder durch undurchsichtige Gewebeschichten ihre Verwendung zur in-Vivo -Untersuchung von Implantaten durch TPLSM.
Die Vorderkammer des Auges bietet eine leicht zugängliche Raum zur direkten Überwachung der transplantierten Gewebe aufgrund der Transparenz der Hornhaut Schichten. Von Vorteil ist die Basis der Kammer durch die Iris gebildet reich an Blutgefäßen und autonomen Nervenendigungen, ermöglicht rasche Revaskularisation und Reinnervation der Transplantate19,20. Dr. Caicedo wurde erfolgreich diesen anatomischen Raum für die Wartung und Längsschnittstudie des Pankreas Inseln in den letzten21verwendet. Hier zeigen wir, dass diese Strategie nicht nur einen gültigen Ansatz ist um Thymozyten Dynamik innerhalb der nativen Orgel-Struktur zu studieren, sondern auch eindeutig erlaubt, um die in Vivo längs Aufnahmen zum Studium der Stammvater Rekrutierung zu erweitern und Reife T-Zell-heraustreten Schritte bei der Maus.

<table><tbody><tr><td>Isofluoran-Verdampfer mit Isofluoran</td><td>Kent Scientific Corp</td><td>VetFlo-1215</td><td></td></tr><tr><td>Präparierendoskop mit Lichtquelle</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Feine Dissektionszange</td><td>WPI</td><td>500455</td><td></td></tr><tr><td>Zange mit mittlerer Dissektion</td><td>WPI</td><td>501252</td><td></td></tr><tr><td>Feine Dissektionszange mit gebogener Spitze</td><td>WPI</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Schere</td><td>WPI</td><td>503371</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>WPI</td><td>503243</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>WPI</td><td>500353</td><td></td></tr><tr><td>40 mm 18G Nadeln</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Transferpipette</td><td>Thermofisher</td><td>201C</td><td></td></tr><tr><td>Wärmekissen und Wärmelampe</td><td>Kent Scientific Corp</td><td>Infrarot</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>VWR</td><td>83,813,360</td><td></td></tr><tr><td>60 mm sterile Schale</td><td>SIGMA</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>Steril 1x PBS pH(7,4)</td><td>Thermofisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sterile</td><td>Tücher Kimberly-Clark</td><td>LD004</td><td></td></tr><tr><td>Medikamente zur Schmerzbehandlung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3035-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung oder Viscotears</td><td>Novartis</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ FLIII</td><td></td></tr><tr><td>Kopfhalter Adapter</td><td>Narishige</td><td>SG-4N-S</td><td></td></tr><tr><td>Gasmaske</td><td>Narishige</td><td>GM-4_S</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 II</td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Haube</td><td>Telstar</td><td>BIO IIA</td><td></td></tr></tbody></table>

echtzeit- in vivo verfolgung von thymozyten in die vorderkammer des auges durch laser-scanning-mikroskopie

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Die vorgestellte Methode soll zeigen, zum ersten Mal die Transplantation von Neugeborenen Thymi in die vorderen Auge Kammer isogenen Erwachsener Mäuse für in Vivo längs Echtzeit-Überwachung der Thymocytes´ Dynamik innerhalb einer vaskularisierte Thymus-Segment. Nach der Transplantation kann Laser-scanning-Mikroskopie (LSM) durch die Hornhaut in Vivo nicht-invasive wiederholte Bildgebung auf zelluläre Auflösung Ebene. Wichtig ist, verleiht der Ansatz vorherigen intravitalen T-Zell-Reifung imaging-Modelle die Möglichkeit für die kontinuierliche Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg-Aufnahmen im gleichen Tier. Weitere Vorteile des Systems sind die Transparenz der transplantierten Bereich makroskopische schnelle Überwachung des implantierten Gewebes, bei schönem und der Zugriff auf das Implantat, so dass für lokalisierte neben systemischen Behandlungen. Die Haupteinschränkung wird das Volumen des Gewebes, das passt im reduzierten Raum der Auge Kammer die Forderungen nach Lappen trimmen. Orgel-Integrität wird maximiert durch Sezieren Thymus Lappen in den Mustern, die zuvor gezeigt, dass funktional für Reife T-Zell-Produktion. Die Technik eignet sich möglicherweise um ein Milieu der medizinisch relevanten Fragen im Zusammenhang mit Thymus-Funktion zu verhören, die Autoimmunität, Immunschwäche und zentrale Toleranz enthalten; Prozesse, die mechanisch schlecht definierten bleiben. Die feinere Zerlegung des Mechanismen führen Thymocyte Migration, Differenzierung und Auswahl sollte für neue therapeutische Strategien zielen entwickelnde T-Zellen führen.

Thymus von Neugeborenen Mäusen wurden isoliert von B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas Mäuse wie in diesem Protokoll (Schritte 1.1-1.9) beschrieben. In diesen transgenen Mäusen leitet Huhn Beta-Actin Promotor den Ausdruck der roten fluoreszierenden Proteins Variante DsRed. MST unter dem Einfluss von unmittelbaren frühen Enhancer Cytomegalovirus (CMV) Erleichterung der Verfolgung von Implantaten.
Zu verhindern Gewebe Able...

Das Ziel des Protokolls ist längs intravitalen Echtzeitverfolgung der Thymozyten durch Laser-scanning-Mikroskopie in der zebrafischembryonen Implantate in die Vorderkammer des Auges Maus zeigen. Die Transparenz der Hornhaut und Vaskularisierung des Transplantats ermöglicht kontinuierlich aufzeichnen Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg.

Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Immunologie über die Mechanismen der Autoimmunität, Immunschwäche, zentrale Toleranz und Thymus-Involution zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie in vivo Längsaufzeichnung von VorläuferRekrutierung und reife T-Zell-Egression in vaskularisierten und transplantierten Maus-Thymus-Segmenten ermöglicht. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Entwicklung und Funktion des Thymus geben kann, kann auch auf andere Gewebe wie Pankreasinseln oder Nierenglomeruli angewendet werden.Um den Thymus zu isolieren, legen Sie die Maus auf sterile saugfähige Papierhandtücher in der dorsalen aufrechten Position in einer laminaren Durchflusshaube und sprühen und wischen Sie den Mausbauch mit 70% Ethanol ab. Machen Sie einen oberflächlichen V-förmigen Schnitt im Unterbauch, um die Brusthöhle freizulegen, und verwenden Sie ein Paar gerade 10-Zentimeter-Sezieren der Schere, um einen 0,5 bis 1 Zentimeter großen Schnitt in der Brust entlang der ventralen Mittellinie zu machen. Falten Sie die Haut über jede Seite der Brust, um die Brusthöhle freizulegen, und machen Sie zwei zusätzliche tiefere 0,5 bis ein Zentimeter seitliche Einschnitte durch das Zwerchfell und den Rippenkäfig, um auf das überlegene Mediastinum in der vorderen Brusthöhle zuzugreifen.Der Thymus sollte als zwei blasse Lappen direkt über dem Herzen erscheinen. Legen Sie gekrümmte Kraftspitzen unter den Thymus und ziehen Sie vertikal, um das komplette Organ zu extrahieren, wodurch das Faltenrücken des Brustkorbs mit einem Paar gerader Zange verhindert wird. Dann tauchen Sie den isolierten Thymus in eine sterile 60-Milliliter-Schale mit kaltem sterilem PBS auf Eis und schneiden Sie den Bindegang, um die Thymianlappen zu trennen, mit einem Skalpell.Vor der Transplantation jede Empfängermaus markieren und wiegen und das erste Tier in eine seitliche Liegeposition mit einem Auge legen, das direkt der Linse eines Sezierendes Mikroskops ausgesetzt ist. Mit der Vannas-Schere, verbrauchen Sie einen der isolierten thymischen Lappen bis zu einem Millimeter in der Breite nach einem Zickzack-Muster, um sicherzustellen, dass jedes Segment enthält einige thymische Kortex und Medulla Gewebe. Es ist wichtig, den Thymus direkt vor der Implantation zu trimmen, da große Stücke nicht richtig eingraviert werden können.Als nächstes, beginnend an der Basis der Hornhaut des Operationsbereichs, verwenden Sie die Spitze einer 40-Millimeter 18-Spur-Nadel, um einen kleinen Schnitt in externe Hornhautschichten zu machen, so dass die Spitze einer Sezierenderin eingeführt werden kann. Verwenden Sie die Schere, um einen Fünf- bis 10-Millimeter-Flankenschnitt direkt um die Basis der Hornhaut zu machen, während Sie flache Zangen verwenden, um die Hornhaut fest offen zu halten, um eine Erneutversiegelung zu verhindern. Das geschnittene Hornhautepithel mit den flach endenen Zangen greifen, die Öffnung in der Hornhaut beibehalten, während sie ein thymisches Segment durch die Öffnung einfügen.Es ist wichtig, das Thymusstück schnell durch die Hornhautöffnung einzufügen, um eine spontane Wiederversiegelung vor dem Einleiten des Gewebes zu verhindern. Achten Sie darauf, die Gewebeintegrität in diesem Schritt zu bewahren. Drücken Sie sanft auf die Augenoberfläche, um das eingeführte Gewebesegment in eine seitliche Position in Bezug auf die Pupille zu schieben, um die Funktion des Auges zu erhalten.Und verwenden Sie flache Zangen, um beide Seiten der Hornhautöffnung drei bis fünf Sekunden lang fest gegeneinander zu drücken, um die Selbstversiegelung zu fördern. Wenn die Transplantation an beiden Augen durchgeführt werden soll, drehen Sie die Maus auf die gegenüberliegende Seitenseite für eine zweite Implantation, wie gerade gezeigt. Wenn die Operation abgeschlossen ist, kehren Sie die Maus in einen leeren Käfig zurück, der mit einer Wärmelampe mit Überwachung bis zur vollständigen Reemumbency vorgewärmt ist.Platzieren Sie zum entsprechenden versuchsmäßigen Zeitpunkt eine anästhesierte Empfängermaus auf einer mikroskopischen Plattform mit fester Bühne in einer seitlichen Liegeposition auf einem Heatpad mit einem Auge nach oben. Und setzen Sie den Kopf der Maus in einen stereotaxic Kopfhalter. Stellen Sie den Knopf ein, um den Mauskopf in der seitlichen Seitenposition zurückzuhalten, um den direkten Zugang des Mikroskopobjektivs zum Auge zu ermöglichen, das das Thymustransplantat hält, und ziehen Sie die Augenlider zurück, während Sie das Auge am Hornhautrand mit einem Paar Pinzettspitzen halten, die von einem Polyethylenrohr bedeckt sind, das an einem festen Gelenk gelenk UST-2 befestigt ist.Fügen Sie ein paar Tropfen steriler Saline oder künstlicher Risse zwischen der Hornhaut und der Linse hinzu, bevor Sie das 5X-Mikroskopobjektiv auf das Mausauge legen und den Thymus im Mikroskopfeld lokalisieren. Wechseln Sie dann zu einem höher auflösenden Wassertauch-Tauchziel mit einem langen Arbeitsabstand und wählen Sie den Erfassungsmodus in der Mikroskopsoftware aus. Starten Sie den Resonanzscanner-Modus und wählen Sie den XYZT-Bildmodus aus.Schalten Sie den Argonlaser ein und stellen Sie die Leistung für die Fluoreszenzerregung auf 30 % ein. Wählen Sie eine geeignete Anregungslaserlinie aus und stellen Sie die akusto-optische Strahlteilersteuerung für die entsprechenden Emissionswellenlängen ein, indem Sie gleichzeitig Reflexionserkennung verwenden, um Rückstreuung zu erkennen und die Gewebestruktur abzuschrägen. Sammeln Sie die Emission bei der gewählten Wellenlänge und legen Sie eine Auflösung von 512 x 512 Pixeln fest.Klicken Sie dann auf live, um die Bildgebung zu starten, und passen Sie die Verstärkungsstufen bei Bedarf an. Konzentrieren Sie sich auf die Oberseite des Thymianimplantats und wählen Sie beginnen, den Anfang des Z-Stacks zu definieren. Konzentrieren Sie sich dann auf die letzte Ebene im implantierten Thymus, die visualisiert werden kann, und wählen Sie Ende aus, um das Ende des Z-Stacks mit einer Z-Schrittgröße von fünf Mikrometern zu definieren.Legen Sie das Zeitintervall für die Erfassung jedes Z-Stacks für 1,5 bis zwei Sekunden fest, und wählen Sie die Option Acquire-until-Stopped für die kontinuierliche Bildgebung aus. Klicken Sie dann auf Starten, um die Aufzeichnung zu initialisieren. Hier werden Hellfeld- und Fluoreszenzbilder aus dem gleichen Bereich des Thymusimplantats gezeigt, die für eine doppelte makroskopische Nachbeobachtung von Gewebewachstum und Involution- und Fortsetzungsstudien dienen können.Das Hellfeldbild erleichtert auch die Visualisierung der Vaskularisation des implantierten Gewebes und ermöglicht die einzigartige Untersuchung der Abhängigkeit der Thymusphysiologie von der Blutversorgung im Laufe der Zeit. Dieses Modell ermöglicht die Visualisierung der Zelltransmigration aus dem Blutstrom in den implantierten Thymus, die Verfolgung der Kontakte zwischen GFP-positiven Vorläuferzellen, die in das Thymianimplantat mit RFP-markierten ansässigen Thythel- und Stromalzellen während differenzierungs- und Selektionsprozessen eindringen, sowie die Überwachung der egressiven Immunzellen aus dem Thymusmus in periphere Blutgefäße. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Gewebeexposition für eine optimale Engraftmentierung zu minimieren und auch die Schnittgröße im Auge zu begrenzen, um eine unversehrte Fragmentexzision durch die Hornhaut zu ermöglichen und gleichzeitig die Fibrose während der Heilung zu reduzieren.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie lokalisierte Kontrollbehandlungen und das Einschnitten anderer Gewebe in das kontralaterale Auge durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über Immunfunktionsstörungen im Zusammenhang mit Infektionen, Involution-Determinanten und Transplantationstoleranzmechanismen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die Entwicklung von T-Zellen zu erforschen, einschließlich Derrekrutierung von Vorläufern, Thymus-Augen-Dynamik und reifen T-Zell-Egressionsschritten in vivo.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir präsentieren Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Erzeugung von Chimären Neugeborenen sowie die Präparation und Vorbereitung des Thymus für die Ex-vivo-Bildgebung durch 2-Photonen-Mikroskopie.

In situ Imaging der Maus Thymus mit 2-Photonen-Mikroskopie

Wir haben neuartige Labormethoden und Protokolle zur intravitale Bildgebung des Thymus entwickelt. Unsere Technik sollte bei der Identifizierung von „Nischen“ im Thymus helfen, in denen die Entwicklung von T-Zellen stattfindet.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Jüngste Fortschritte in der 2-Photonen-Mikroskopie sind in Echtzeit...

Bildgebung des dem Maus-Kniekehlen-Lymphknoten

Dieses Video beschreibt die Bildgebung von residenten tumorinfiltrierenden CD8-T-Zellen, die mit fluoreszenzgekoppelten Antikörpern in menschlichen Lungentumorschnitten markiert wurden. Diese Technik ermöglicht Echtzeitanalysen der Migration von CD8-T-Zellen mittels konfokaler Mikroskopie.

Echtzeit-Analyse der residenten T-Zell-Migration in verschiedenen Tumorregionen mittels konfokaler Mikroskopie

Ein neuer Ansatz, der intraokularen Transplantation und konfokale Mikroskopie ermöglicht Längs-, non-invasive Bildgebung in Echtzeit mit Single-Cell Auflösung innerhalb gepfropft...

Transplantation in die Vorderkammer des Auges für Längs-, Non-invasive<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging mit Single-cell Auflösung in Echtzeit

Die Mechanismen, die die interstitielle Motilität von CD4 Effektor T-Zellen an Entzündungsstellen bestimmen, sind relativ unbekannt. Wir stellen eine nicht-invasive Ansatz zu visualisieren und in vitro -geprimte CD4 - T - Zellen in den entzündeten Ohr Dermis, so dass für das Studium des dynamischen Verhaltens dieser Zellen in situ zu manipulieren.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild resident Tumor infiltrieren CD8 T-Zellen beschriftet mit Gewebekulturen gekoppelten Antikörpern im menschlichen Lunge Tumor Scheiben. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen von CD8 T Zelle Migration mit der konfokalen Mikroskopie.

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt wie hochauflösende bildgebende Verfahren wie spectral-Domain optische Kohärenztomographie und scanning Laser Ophthalmoskopie in kleine Nagetiere, mit einer ophthalmologischen Bildgebung Plattform-System, um Auskunft über genutzt werden Netzhautdicke und Microglial Zelle Verteilung, beziehungsweise.

In Vivo Darstellung der Cx3cr1GLP/Gfp Reporter Mäuse mit Spectral-Domain optische Kohärenztomographie und Scanning Laser Ophthalmoskopie

Wir beschreiben eine Methode zur Visualisierung von GFP-markierten IELs mit intravitaler Bildgebung des murinen Dünndarms durch invertierte Konfokalmikroskopie der Spinnscheibe. Diese Technik ermöglicht die Verfolgung von lebenden Zellen innerhalb der Schleimhaut für bis zu 4 h und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von darmen immun-epitheliale Wechselwirkungen zu untersuchen.

Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm

Wir stellen ein Protokoll für den Einsatz der faseroptischen konfokalen Lasermikroendoskopie (CLM) vor, um die räumlich-zeitliche Verteilung von Liposomen im Auge nach subkonjunktivaler Injektion nicht-invasiv zu untersuchen.

Räumlich-zeitliche In-vivo-Bildgebung von okulären Wirkstoffabgabesystemen mittels faseroptischer konfokaler Lasermikroendoskopie

Diese Arbeit demonstriert eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung der Mikroglia-Motilität und des Kontakts mit postsynaptischen Puncta in der Netzhaut mittels rotierender Scheiben-Konfokalmikroskopie.

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik und Wechselwirkungen mit Synapsen in erkrankter Maus-Netzhaut

Erfahren Sie die longitudinalen intravitalen Bildgebung von Thymozyten mittels Laser-Scanning-Mikroskopie in thymischen Implantaten der Mäusevorderkammer. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitverfolgung von Progenitorzell-Rekrutierung und reifer T-Zell-Egress.

Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie

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