Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Ökologie vektorübertragener Krankheiten zu beantworten, wie z. B. welche Rolle spielt das Vektormikrobiom für die Dynamik von Krankheitserregern und wie bilden und variieren Vektormikrobiome? Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie eine hohe Replikation sowie eine hohe Auflösung und Identifizierung ermöglicht, was es dem Benutzer ermöglicht, das Vektormikrobiom unter unterschiedlichen ökologischen und Umweltbedingungen genau zu charakterisieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die Einrichtungsschritte für die Mikrobiomsequenzierung schwer zu erlernen sind und es viele verschiedene Produkte und Techniken gibt, aber nur wenige Ressourcen zum Erlernen dieser Schritte.

Beginnen Sie diesen Vorgang mit der Sammlung von Ticks, wie im Textprotokoll beschrieben. Um Oberflächenverunreinigungen von den Zecken zu entfernen, fügen Sie 500 Mikroliter Wasserstoffperoxid hinzu und wirbeln Sie es 15 Sekunden lang ein. Wiederholen Sie diese Wäsche mit 70 % Ethanol und dann mit doppelt destilliertem Wasser.

Legen Sie die Zecken in ein neues PCR-Röhrchen und lassen Sie sie an der Luft trocknen. In dieser Röhre das Zeckengewebe mechanisch aufbrechen, indem Sie die Zecken mit einem Stößel zerquetschen. Reinigen Sie die DNA von einzelnen Zecken gemäß den Anweisungen in einem im Handel erhältlichen DNA-Extraktionskit.

Eluieren Sie auf ein Endvolumen von 100 Mikrolitern. Die Schaffung einer Negativkontrolle im Extraktionsschritt ist entscheidend für die spätere Unterscheidung von vermuteten Kontaminanten von echten Vektormikroben. Die Verwendung einer sterilen Technik während des Extraktionsschritts und späterer PCR-Schritte ist ebenfalls erforderlich, um die Auswirkungen der Kontamination, die bei der 16S-Sequenzierung üblich ist, zu minimieren.

Richten Sie die Amplikon-PCR in einer 27,5-Mikroliter-Reaktion ein, die fünf Mikroliter jedes Primers auf einem Mikromolar und 12,5 Mikroliter des kommerziell erhältlichen PCR-Mixes enthält. Dazu gehören auch fünf Mikroliter DNA, die aus einzelnen Zecken in einer Konzentration von fünf Nanogramm pro Mikroliter extrahiert wurden. Bringen Sie die Röhrchen in einen Thermocycler und führen Sie das im Textprotokoll aufgeführte Programm aus.

Sobald die PCR abgeschlossen ist, visualisieren Sie das PCR-Produkt, indem Sie vier bis sechs Mikroliter pro Probe auf ein 1,5%iges Agarose-Gel laden. Suchen Sie nach einer Bande bei 460 Basenpaaren, um die Verstärkung zu bestätigen. Kombinieren Sie das PCR-Produkt mit einem neuen PCR-Röhrchen für jede Probe mit doppelt destilliertem Wasser, um insgesamt 60 Mikroliter zu erhalten.

Bei Proben mit niedrigen DNA-Konzentrationen führen Sie eine Amplikon-PCR in dreifacher Ausfertigung durch, um die Amplifikationsverzerrung zu reduzieren, und poolen Sie die Proben, um sie zu konzentrieren. Bringen Sie paramagnetische Kügelchen auf Raumtemperatur und wirbeln Sie sie vor Gebrauch gut ein. Geben Sie 48 Mikroliter paramagnetische Kügelchen zu 60 Mikrolitern der Probe und inkubieren Sie fünf Minuten lang.

Legen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang auf ein Magnetgestell, bis die Lösung klar wird. Entfernen Sie dann den Überstand. Mit Röhrchen auf dem Magnetgestell 500 Mikroliter frisch zubereitetes 80%iges Ethanol hinzufügen.

Unmittelbar nach der Zugabe von Ethanol zu allen Röhrchen pipettieren Sie die Flüssigkeit heraus und entfernen Sie nicht die Kügelchen. Wiederholen Sie die Zugabe und Entfernung von Ethanol noch einmal. Trocknen Sie die Proben an der Luft, um überschüssiges Ethanol zu entfernen, indem Sie die Röhrchen fünf Minuten lang offen auf dem Magnetgestell lassen oder bis kleine Risse in den Kügelchen sichtbar sind.

Fügen Sie nun 20 Mikroliter TE-Puffer hinzu und inkubieren Sie die Proben vom Magneten bei Raumtemperatur. Nach fünf bis 10 Minuten setzen Sie die Röhren wieder auf den Magneten. Sobald die Kügelchen und die Flüssigkeit getrennt sind, übertragen Sie die Überstände in ein frisches Röhrchen, um das gereinigte PCR-Produkt zu erhalten.

Weisen Sie jeder Probe einzigartige Primerkombinationen zu, indem Sie entweder Vorwärts- oder Rückwärtsprimer oder beides aus einem kommerziell erhältlichen Bibliotheksindexkit auswählen. Um die dualen Primer oder Indizes an den Proben zu befestigen, bereiten Sie eine PCR-Reaktion vor, die 2,5 Mikroliter jedes Primers, 12,5 Mikroliter des im Handel erhältlichen PCR-Mastermix, fünf Mikroliter doppelt destilliertes Wasser und 2,5 Mikroliter gereinigtes Amplikonprodukt enthält. Bewegen Sie die Röhrchen zu einem Thermocycler, der wie im Textprotokoll beschrieben programmiert ist.

Sobald die PCR abgeschlossen ist, visualisieren Sie das PCR-Produkt, indem Sie vier bis sechs Mikroliter pro Probe auf ein 1,5%iges Agarose-Gel laden. Suchen Sie nach einer Bande bei 550 Basenpaaren, um die Verstärkung zu bestätigen, bevor Sie den Reinigungsvorgang wie zuvor durchführen. Um eine genaue Quantifizierung jedes gereinigten barcodierten Produkts durchzuführen, führen Sie qPCR auf jeder Probe und jeden Standard in dreifacher Ausfertigung durch und führen Sie jede Probe in drei oder mehr Verdünnungsstufen durch.

Bereiten Sie 10 Mikroliter qPCR-Reaktionen vor, die sechs Mikroliter qPCR-Mastermix, zwei Mikroliter doppelt destilliertes Wasser und zwei Mikroliter der Probe oder des Standards enthalten. Bewegen Sie die qPCR-Platte auf ein real-time PCR-Gerät, das wie im Textprotokoll beschrieben programmiert ist, und führen Sie den Lauf durch. Erstellen Sie nach der Quantifizierung die kombinierte Bibliothek, indem Sie die gleichen Volumina aller einzelnen Bibliotheken in eine einzige Röhre addieren.

Nach dem Verdünnen und Denaturieren der kombinierten Bibliothek und der Sequenziersteuerung wird das kombinierte Gemisch auf die Sequenzierdurchflusszelle geladen. Reinigen Sie die Durchflusszelle vor dem Beladen gründlich, um eine optimale Optik zu erzielen. Laden Sie dann die Durchflusszelle auf den Sequenzer und führen Sie eine Amplikonsequenzanalyse durch.

Hier sind Verdünnungskurven für die Normalisierung der Sequenzanzahl dargestellt. Diese Kurven zeigen, dass eine Verdünnung auf 2000 Sequenzen pro Probe ausreichen sollte, um die gesamte Vielfalt der beobachteten operationellen taxonomischen Einheiten zu erfassen. Nach der Verdünnung und Qualitätsfilterung der Sequenzlesevorgänge wird eine Alpha- und Beta-Diversitätsausgabe durchgeführt.

Hier ist ein automatisch generiertes Diagramm der Prinzipkoordinaten-Analyse dargestellt, das zeigt, wie sich die Zusammensetzung des Mikrobioms von Zecken je nach Behandlung unterscheidet. Darüber hinaus wird für alle Proben automatisch eine Visualisierung der in jeder Probe vorhandenen Mikroben erstellt, die hier auf Stammebene dargestellt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die sterile Technik beizubehalten, um die Auswirkungen einer mikrobiellen Kontamination zu minimieren, die sich entscheidend auf die Interpretation von Sequenzdaten auswirken kann.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die histologische Färbung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wo befinden sich die beobachteten Mikroben innerhalb des Vektors? Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Methode den Weg für Forscher auf dem Gebiet der molekularen Ökologie, die Rolle mikrobieller Wechselwirkungen innerhalb des Vektors zu erforschen und zu untersuchen, wie sich dies auf die Übertragung von Krankheitserregern auswirken kann.