Name: Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Erfahren Sie die Rekonstitution mitotischer Oszillationen in Mikroemulsionen mit zellfreien Xenopus laevis-Eiextrakten. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatzanalysen zur Untersuchung der Zellzyklusdynamik.

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Wir danken Madeleine Lu für den Bau von securin mCherry Plasmid, Runde Mann Lee, Kenneth Ho und Allen P Liu für Diskussionen über Tröpfchen-Generation, Jeremy B. Chang und James E. Ferrell Jr für die Bereitstellung, GFP-NLS zu konstruieren. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation unterstützt (frühe Karriere Grant #1553031), die National Institutes of Health (MIRA #GM119688) und ein Forschungsstipendium Sloan.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of Michigan genehmigt.
1. Vorbereitung der Materialien für Zellzyklus Rekonstitution und Erkennung
<ol><li>
Gibson-Assembly für den Plasmid DNA-Bau und mRNA Reinigung des securin mCherry Klonen
	<ol>
<li>Bereiten Sie drei DNA-Fragmente, darunter ein pMTB2 Vektor Rückgrat, securin und mCherry durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und gel Reinigung21,22.</li>
		<li>Die Konzentrationen der Fragmente mit Hilfe eines Fluorospectrometer zu messen. Kombinieren 100 ng des Backbones mit securin und mCherry-Einsätze bei einer 1: Molekulare Verhältnis 1:1 und fügen deionisiertes Wasser um das Gesamtvolumen der Reaktion auf 5 µL anzupassen.</li>
		<li>Bereiten Sie 6 mL 5 x Isothermen Montage Reaktion Puffer mit 3 mL 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 300 µL 1 M MgCl2, 600 µL 10 mM dNTP 300 µL 1 m DTT, 1,5 g der PEG-8000 und 20 mg NAD23.</li>
		<li>Ein 15 µL 1 X Isothermen Montage Reaktion Puffer aliquoten kombinierten Fragmente hinzufügen. Inkubieren Sie die Reaktion in einer PCR-Reaktion-Röhre bei 50 ° C für 15 Minuten.</li>
		<li>Machen Sie eine 0,8 % Agarose-gel und laufen mit einer Spannung von 10 V/cm um das Glühen Effizienz dieser Fragmente zu überprüfen.</li>
		<li>Reinigen Sie das konstruierte Plasmid und eluieren mit 15 µL RNase-freies Wasser. Verwandeln Sie 1 µL gereinigtes Plasmid DNA in 50 µL DH5α kompetente E. Coli Zellen24 für die zukünftige Verwendung.</li>
		<li>Extrahieren und zu reinigen das Plasmid DNA securin mCherry aus den DH5α kompetente E. Coli Zellen.</li>
		<li>Die linearisierte securin mCherry Plasmid DNA in mRNA transkribieren und reinige die mRNA. Ein Spektralphotometer zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Konzentration der mRNA mehr als 100 ng/µL und das Verhältnis der Absorption bei 260 ist nm und 280 nm ist etwa 2.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Demembranated Xenopus Laevis Samenzellen DNA Hinweis: Adaptiert von Murray 19911.<ol>
<li>Erwachsene männliche Xenopus Laeviseinschläfern25 und sezieren Hoden aus vier männliche Frösche26,27.</li>
		<li>Platzieren Sie Hoden aus vier Frösche in der gleichen 100 mL Petrischale. Spülen Sie die Hoden dreimal in 50 mL kalten 1 X MMR-Lösung (0,1 M NaCl, KCl 2 mM, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, 0,1 mM EDTA).</li>
		<li>Entfernen Sie überschüssiges Blut und Fett aus den Hoden in einer Petrischale 100 mL und dann zweimal in kalten nuklearen Vorbereitung Puffer (NPB) (250 mM Saccharose, 15 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0,5 mM Spermidine Trihydrochloride 0,2 mM Spermin Tetrahydrochloride) waschen.</li>
		<li>Entfernen des nuklearen Vorbereitung Puffers (NFB) und Hoden in Stücke mit einer Länge kleiner als 0,2 cm mit scharfen sezierenden Schere in eine 100 mL Petrischale. 8 mL kalte NPB an den Hoden für weitere Aufschlüsselung hinzugeben.</li>
		<li>Verwendung Nylon mesh-Gewebe mit einer Porengröße von 70 µm filtern die Hoden und spermaprobe in ein 15 mL konische Röhrchen zu sammeln. Spin-down die gesammelten Spermien bei 1.730 x g für 10 Minuten bei 4 ° C und überstand zu entfernen.</li>
		<li>Liefern die Samenzellen mit 1 mL NFB und 50 µL 10 mg/mL Lysolecithin und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min zu Demembranate Spermien.</li>
		<li>Waschen Sie das Demembranated Sperma DNA mit 10 mL kalte NPB mit 3 % BSA Lösung dreimal.</li>
		<li>Die Dichte der Spermien-DNA mit einem Hemocytometer zu messen.</li>
		<li>Die Samenzellen DNA in 5 µL-Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° c Lagern Die optimale Konzentration der Spermien-DNA ist ca. 105 Kerne/µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Proteinreinigung von GFP-nuklearen Lokalisierung Signal (GFP-NLS)
	<ol>
<li>Verwandeln Sie das GST-Tags GFP-NLS-Plasmid in BL21 (DE3) kompetente E. Coli Zellen5.</li>
		<li>Brüten die Zellen ohne Antibiotika bei 37 ° C für 1 h und breitete sich dann auf eine LB-Agarose-Platte mit 100 µg/mL Ampicillin.</li>
		<li>Brüten Sie die Platte bei 37 ° C für 14 bis 18 Uhr die Zellen wachsen in einzelnen Kolonien. Wählen Sie und impfen Sie einzelne Kolonien in 4 mL LB-Medium mit 100 µg/mL Ampicillin zu. Schütteln Sie die Zellen bei 37 ° C für 12 Stunden.</li>
		<li>Bereiten Sie die autoklaviert YT-Medien (Bacto-Tryptone 16 g, 10 g Bacto-Hefeextrakt, 5 g NaCl) und Erhitzen Sie die YT-Medien auf 37 ° c</li>
		<li>Impfen Sie 1 mL der Nacht inkubierten Zellen in LB Medien in 250 mL vorgewärmten YT-Medien mit 100 µg/mL Ampicillin zu und schütteln Sie 2 Stunden Zelldichte erhöhen.</li>
		<li>Messen Zelle optische Dichte (OD) alle 30 Minuten mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm. Fügen Sie 0,1 mM IPTG in Zellen, GFP-NLS-Protein-Expression zu induzieren, sobald die OD-Wert 0,1 erreicht.</li>
		<li>Schütteln Sie die Zellen bei 18 ° C über Nacht reduzieren Zelle Wachstum und ermöglichen bessere Protein-Expression und Synthese.</li>
		<li>Spin-down der Zellen bei 34.524 x g bei 4 ° C für 5 Minuten und überstand zu entfernen.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie der Zelle Pellets in 40 mL PBS-Puffer (mit 800 µL 50 mg/mL Lysozym, 100 µL 0,2 M PMSF 13.2 µL einer 10 mg/mL Mischung aus Leupeptin, Pepstatin und Chymostatin und 8 µL 0,5 M EDTA geliefert) und 20 Minuten bei 4 ° C inkubieren.</li>
		<li>Brechen, Zellen mit einem sonikator mit einer Frequenz von 20 kHz für 4 x 30 s, 30 s Intervallen zwischen jeder Beschallung freizugebende ausgedrückt GFP-NLS-Protein.</li>
		<li>Drehen Sie mit 20.000 x g für 35 Minuten, um die defekten Zellen zu entfernen.</li>
		<li>Verwenden Sie Affinitätschromatographie zu extrahieren und zu reinigen GFP-NLS Protein.</li>
		<li>1,5 mL Wulst Gülle dreimal mit 15 mL PBS-Puffer waschen und 4 Stunden bei 4 ° C mit Inversion 250 mL mit Perlen lysate inkubieren.</li>
		<li>Spin-down der Perlen bei 2000 X g für 5 min und 10 mL Waschlösung (25 mM Tris Basis, pH 7.5, NaCl, 500 mM und 5 mM DVB-t), Perlen. Inkubieren Sie Perlen in 700 µL Elution Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM reduziert Glutathion und 5 mM DVB-t) mit Drehung bei 4 ° c Ein Aliquot der Elution mit einem Volumen von 50 µL zu sammeln.</li>
		<li>Messen der Konzentration des erfassten Proteins durch Ausführen einer Coomassie blau Gel28.</li>
		<li>Mit PD-10 Spalten mit 3 mL Puffer speichern (20 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 % Glycerin, pH 7,7) durch Buffer Tausch Proteine eluieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung des Radsports Xenopus -Extrakte
Hinweis: Das gesamte Verfahren der Vorbereitung die Extrakte ist in Figur 1Adargestellt. Adaptiert von Murray 19911.
<ol><li>Injizieren Sie drei ältere weibliche Xenopus Laevis mit 66 IU trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG) 10 Tage vor der Eiablage.</li>
	<li>Spritzen Sie diese Xenopus -Frösche mit 500 IU humanes Choriongonadotropin (HCG) zur Eiablage 18 Stunden vor der Präparation des Radsports Extrakte zu induzieren.</li>
	<li>Gelegten Eier über Nacht zu verwerfen. Basierend auf Experimente (Daten nicht gezeigt), Auszüge aus den frisch gepressten Eiern zubereitet generieren länger andauernde Aktivitäten als Extrakte aus gelegten Eier aus den gleichen fröschin vorbereitet. Drücken Sie die Eier von jeder fröschin in 100 mm Petrischalen mit 10 mL 0,2 X MMR Puffer und unter einem Stereomikroskop untersuchen.</li>
	<li>Die Chargen von Eiern, die unklare Grenzen zwischen Tier und Vegetal Pfosten oder unregelmäßige weiße Flecken auf Tier Pole zu verwerfen.</li>
	<li>Wählen Sie die Ladung von Eiern aus eine fröschin präsentiert eine homogene Bevölkerung von Eiern mit klar differenzierten Tier- und Vegetal Pfosten und übertragen Sie die Eier in einem 600 mL-Becherglas.</li>
	<li>Gießen Sie überschüssige 0,2 X MMR Puffer und sanft 250 mL Cystein (pH 7,7) 1 x Extrahieren von 2 g pro 100 mL Puffer (100 mM KCl, 0,1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 50 mM Saccharose, pH 7,7), Eier.</li>
	<li>Schütteln Sie die Eier mit der Hand kräftig und entfernen Sie die Gelee-Mäntel von Eiern über drei Waschungen mit einem Gesamtvolumen von 800 mL Cystein Puffer für 3 Minuten oder bis Sie Eier aggregieren und siedeln am Boden des Bechers, darauf hinweist, dass Gelee Mantel entfernen erfolgreich verläuft.</li>
	<li>Waschen Sie Eier mit 1 L 0,2 X MMR Lösung mehr als das Vierfache.</li>
	<li>Holen Sie ab und entsorgen Sie Eier, die weiß mit einer Glaspipette Transfer.</li>
	<li>Gießen Sie die MMR-Puffer und liefern Sie Eier mit 200 mL 0,1 µg/mL Kalzium Ionophore A23187 Lösung in 0,2 X MMR Puffer für die Aktivierung.</li>
	<li>Verwenden Sie die weite Öffnungsseite von einer Glaspipette die Eier vorsichtig rühren, bis die Eier aktiviert werden und Kalzium Ionophore Lösung zu entfernen.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Aktivierungs-Effizienz, nachdem Eier an der Unterseite des Bechers niederzulassen. Gut aktivierten Eier haben ca. 25 % der Tier-Pole und 75 % der Vegetal-Stange.</li>
	<li>Waschen Sie die aktivierten Eier zweimal mit 50 mL 1 x Extrakt Puffer mit Protease-Inhibitoren (10 µg/mL Leupeptin, Pepstatin und Chymostatin) ergänzt.</li>
	<li>Übertragen Sie Eier sorgfältig auf eine 0,4 mL Snap-Cap reaktionscup und dann packen Sie Eier durch Zentrifugation bei 200 X g für 60 Sekunden und dann 600 X g für 30 Sekunden.</li>
	<li>Entfernen Sie zusätzliche Puffer oben auf Eier mit einem Glas Pasteurpipette, um die Verdünnung der Extrakte zu reduzieren.</li>
	<li>Crush Eier bei 15.000 x g für 10 Minuten bei 4 ° C.</li>
	<li>Schneiden Sie die Rohre mit einer Rasierklinge zu drei Lagen zerkleinerte Eier trennen Rohöl Zytoplasma in der mittleren Schicht.</li>
	<li>Grobe Zytoplasma in neuen Ultrazentrifugen Röhren übertragen, und ergänzen mit Protease-Inhibitoren und Cytochalasin B 10 µg/ml.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie grobe Zytoplasma wieder bei 15.000 x g bei 4° C für 5 Minuten zum Zytoplasma weiter zu reinigen, indem überschüssige Lipid und Eigelb.</li>
	<li>Halten Sie frisch zubereitete Auszüge auf Eis.</li>
</ol>(3) Droplet-Generation
<ol><li>
2D Glasbearbeitung Kammer Hinweis: Die Rechteck-Glasröhren dienen als Kammern, die die Tröpfchen in einer 2-dimensionalen Ebene, zulassend einfacher Beobachtung und Sammlung von Daten zu beschränken.<ol>
<li>Schneiden Sie Rechteck-Glasröhren mit innere Dimension von 2 mm x 100 µm in 4 mm lange Stücke. Verwenden Sie die scharfe Kante einen Schleifstein, markieren Sie die gewünschten Grenzen auf der äußeren Oberfläche des Glasrohrs mit leichten Radierungen, dann üben Sie sanft Druck auf beiden Seiten der Radierungen, Stücke von Glasröhren abzubrechen.</li>
		<li>Einen Trockenbad-Inkubator auf 95 ° c vorheizen Nehmen Sie den Heizblock und legen Sie sie in eine Polycarbonat-Vakuum-Exsikkator.</li>
		<li>Legen Sie einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 30 µL Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silan in den Heizblock. Geschliffenes Glasrohre innerhalb der Vakuum Exsikkator ca. 5 cm zu den Heizblock lag.</li>
		<li>Verbinden Sie den Exsikkator mit einer Vakuumpumpe. Schalten Sie die Pumpe für 1 Minute, um das gewünschte Vakuumniveau erreichen, dann schließen Sie die 3-Wege-Ventil zu versiegeln der Exsikkator und lassen den Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silan Dampf die Innenwand der Glasröhren zu beschichten. Dadurch entsteht eine hydrophobe Umgebung zur Stabilisierung der Tröpfchen.</li>
		<li>Lassen Sie die Glasröhren im Exsikkator über Nacht Beschichtung. Die Rohre werden am nächsten Tag einsatzbereit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tröpfchen-Generation und Bildgebung Hinweis: Die Verfahren der Erzeugung von Tröpfchen und imaging sind in Figuren 1 b und 1 C. dargestellt.<ol>
<li>Extrakte, die in Schritt 2 mit 10 ng/µL zubereitet liefern securin mCherry mRNA für die einfach nur cytoplasmatische Zellzyklus-Experimente. Alternativ ändert Versorgung Extrakte mit Demembranated Spermien Chromatin (250 pro Mikroliter-Extrakt), 10 µM GFP-NLS Protein und 10 ng/µL securin mCherry mRNA Tröpfchen ausstellenden periodische Kerne Morphologie zu erstellen.</li>
		<li>In einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch geliefert Mischung 20 µL des Extraktes mit rekombinanten Proteins oder mRNA mit 200 µL 2 % Perfluoropolyether-Polyethylenglykol (PFPE-PEG) Fluorosurfactant in HFE7500 fluorierten Öl.</li>
		<li>Tröpfchen mit einem Vortex-Mixer zu generieren. Das Spektrum der tröpfchengrößen kann durch Wirbel Geschwindigkeit und Dauer moduliert werden. Erstellen Sie Tröpfchen mit Radien von 50 bis 200 µm, die Wirbel Geschwindigkeit 56 X g (3.200 u/min mit einem Radius von 4,9 mm) und drücken Sie vorsichtig die Microcentrifuge Schlauch mit dem Extrakt und Tensid Mischung am Mischpult für 3,5 Sekunden. Überprüfen Sie, wenn die Tröpfchen einheitlich groß sind.</li>
		<li>Mithilfe einer 20 µL Pipette die Tröpfchen schweben auf Oberseite und ein gleiches Volumen an PFPE-PEG Tensid in ein PCR-Rohr übertragen. Tauchen Sie das Glasrohr, vorbereitet vom Schritt in die Tröpfchen-Schicht in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und warten, bis Tropfen ca. 75 % des Rohres ausgefüllt haben, dann schieben Sie den Schlauch nach unten in die Tensid-Schicht, bis der Schlauch vollständig gefüllt ist. Dies senkt die Tröpfchen-Dichte und ermöglichen die Tröpfchen einer einzige Schicht im Inneren der Kammer ohne Überlappung oder Form Verzerrungen durch Überbelegung zu bilden.</li>
		<li>Füllen Sie eine Glasschale unten mit einem Durchmesser von 40 mm mit Mineralöl. Tauchen Sie die Tröpfchen-gefüllte Schläuche in Öl, indem man sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette.</li>
		<li>Nach dem laden alle Proben, mit einem Glas pipette entfernen Sie sichtbare Fremdkörper oder Tröpfchen zugespielt. Fügen Sie weitere Mineralöl, wenn die Röhren nicht oder nicht in den imaging-Prozess vollständig werden.</li>
		<li>Bildgebung der Tropfen auf einem Epifluoreszenz-Mikroskop, ausgestattet mit einer motorisierten X-y-Bühne zu führen (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie ein 4 X Luft-Ziel für alle Bildgebung. Verwenden Sie für die Fluoreszenz-Bildgebung eine 130 W Quecksilber Dampf kurz Bogenlampe Fluoreszenz Lichtquelle zur Beleuchtung und einen GFP-Filter gesetzt (Erregung 482/35 nm und Emission 514/LP nm) sowie ein mCherry-Filter setzen (Erregung 562/40 nm und Emission 641/75 nm) für die Bildgebung GFP-NLS und securin mCherry Signale.</li>
		<li>Time-Lapse Videos aufnehmen in das Hellfeld und mehrere Fluoreszenz Kanäle alle 6 bis 9 Minuten, bis die Tropfen ihre Aktivität verlieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Bild-Verarbeitung und Datenanalyse
<ol><li>
Segmentierung und Verfolgung von Tröpfchen
	<ol>
<li>Aufgezeichnete Daten in das Format "TIF" oder ".oif" in Bildanalyse-Software importieren (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Segmentieren Sie einzelne Tröpfchen mit dem Hellfeld-Kanal. Das Hellfeld-Bild zeigen Tröpfchen als helle Kreise mit dunklen Grenzen. Schnittstellenüberwachung auf das Bild anwenden. Jeder Tropfen fügen Sie eine Tracking-Oberfläche durch tuning die Schwelle zwischen dunklen und hellen Pixel, so dass jede Fläche den gesamten Bereich der entsprechenden Tropfen deckt hinzu.</li>
		<li>Verfolgen Sie die Segmente automatisch zwischen angrenzenden Frames mit dem autoregressiven Bewegung Algorithmus. Optimieren der akzeptabel Reisen Maximalabstand eines Tropfens zwischen zwei benachbarten Frames kleiner als der Radius der meisten Tröpfchen, kleine Tröpfchen genau zu verfolgen.</li>
		<li>Eine Sichtkontrolle alle Titel über das gesamte Video, falsche Segmentierungen erkennen dieses Segment der leere Raum zwischen Tröpfchen anstatt tatsächliche Tröpfchen. Löschen Sie falsche Titel manuell.</li>
		<li>Segment und Track Hintergrundbereich ohne irgendwelche Tröpfchen, die Hintergrund-Fluoreszenz-Intensität zu erhalten. Verbesserung des Signal-Rausch, subtrahieren Sie hintergrundintensität aus der Fluoreszenzintensität von Tröpfchen bei jedem Zeitrahmen.</li>
		<li>Gemessenen Parameter für jede Spur im Laufe der Zeit, einschließlich der Mittelwert und die Standardabweichung der Fluoreszenzintensität und Tröpfchen in ".csv" Dateien zu exportieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Datenanalyse der Tröpfchen Größe und Schwingung
	<ol>
<li>Laden Sie die ".csv" Dateien in R Grundstücke der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit für jede Droplet erstellen. Rekord Droplet-ID in eine Datei "CSV".</li>
		<li>Importieren Sie aus der Analyse-Software und die ".csv" Datei mit einer Liste von Tröpfchen ID in Matlab exportiert ".csv"-Dateien und speichern Sie als ".mat" Dateien für weitere Datenanalyse.</li>
		<li>Berechnen Sie das Volumen eines komprimierten Tropfens basierend auf den exportierten Tröpfchen Bereichsinformationen nach Segmentierung und die Höhe des Glases19Kammer. Verwenden Sie das Volumen, um den Radius der Tröpfchen als Kugel berechnen.</li>
		<li>Extrahieren Sie die Zeitpunkte der Höhen und tiefen mit Spitze/Trog Erkennungsalgorithmus. Durchführen Sie manuelle Korrekturen, auf die Position der Maxima und Minima um sicherzustellen, dass sie genau ermittelt werden.</li>
		<li>Um den Zellzyklus Zeitraum zu berechnen, berechnen Sie die Intervallzeit zwischen zwei benachbarten Gipfeln. Nehmen Sie den Durchschnitt aller Intervalle für jedes Tröpfchen als der Zellzyklus Zeit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Wir haben nichts zu veröffentlichen.

Wir haben einer neuartigen Methode zur Entwicklung eines künstlichen Zelle Hochdurchsatz-Systems, ermöglicht in Vitro Rekonstitution und langfristige Verfolgung von selbsttragenden Zellzyklus Schwingungen auf der Ebene der einzelligen vorgelegt. Es gibt mehrere wichtige Schritte, mit denen diese Methode erfolgreich. Erste, frisch gepresste Xenopus Eiern mit einer guten Qualität verglichen mit gelegten Eier, tendenziell Extrakte mit länger anhaltende Schwingung Aktivität zu produzieren. Zweitens ist die ...

Zytoplasmatischen Extrakte aus Xenopus Laevis Eier zubereitet repräsentieren eines der vorherrschenden Modelle für die biochemische Untersuchung der Zelle Zyklen, angesichts der großen Anzahl der Eizellen, die schnelle Zellzyklus Progression und die Fähigkeit der Neuaufbau mitotische Veranstaltungen in-vitro-1,2. Dieses System ermöglichte die erste Entdeckung und mechanistischen Charakterisierung der wesentlichen Zellzyklus Regulierungsbehörden wie Förderung der Reifung Faktor (MPF) sowie nachgelagerte mitotische Prozesse einschließlich Montage und Chromosom Segregation1 Spindel ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus -Ei-Extrakte haben auch verwendet worden, für detaillierte Dissektion der regulationsnetzwerke des Zellzyklus Uhr8,12,13,14 und Studien von DNA-Schäden /Replication Checkpoint15 und der mitotischen Spindel Baugruppe Checkpoint16,17,18.
Diese Studien der Zelle Zyklen mit Xenopus -Ei-Extrakte haben hauptsächlich basiert auf Masse Messungen. Jedoch können konventionelle Masse Reaktion Assays nicht echte Zelle Verhalten, gegeben eine große Diskrepanz in ihren Dimensionen und subzelluläre räumliche Abschottung der Reaktion Moleküle imitieren. Darüber hinaus sind lose Messungen der mitotischen Aktivitäten anfällig für eine begrenzte Anzahl von Zyklen vor der Dämpfung schnell8geben. Diese Nachteile der Masse Reaktionen verhindert haben das Extrakt System um weitere Verständnis der komplexen Uhr dynamische Eigenschaften und Funktionen bereitzustellen. Jüngste Studien haben gekapselt zellfreie Zytostatika Faktor verhaftet (CSF) Xenopus extrahiert19,20 in Größe definiert zellähnliche Fächer, die dazu beigetragen haben, aufzuklären, wie Spindel Größe durch moduliert wird die zytoplasmatischen Volumen. Jedoch dieses in-vitro- System ist durch die Wirkung der Zytostatika Faktor1in Metaphase der Meiose II verhaftet, und ein System in der Lage, langfristige nachhaltige Schwingungen auf der Ebene der einzelnen Zelle zur weiteren Untersuchung des Zellzyklus erforderlich Oszillator.
Zellzyklus Schwingungen mit einzelligen Auflösung studieren, entwickelten wir eine Zelle-Skala, Hochdurchsatz-System zur Rekonstitution und gleichzeitige Messung mehrerer selbsttragenden mitotischen oszillierende Prozesse in einzelnen Mikroemulsion Tröpfchen. In diesem ausführlichen video Protokoll zeigen wir die Schaffung eines künstlichen mitotischen Schwingung durch Kapselung von Radsport Xenopus Laevis Ei Zytoplasma in Mikroemulsionen Größen von 10 bis 300 µm. In diesem System wurden mitotische Schwingungen einschließlich Chromosom Kondensation und de-Kondensation, Kernhülle Aufschlüsselung und Reformation, und der Abbau und Synthese von Anaphase Substrate (z. B. securin-mCherry in diesem Protokoll) erfolgreich wieder hergestellt.

<table><tbody><tr><td>Xenopus laevis Frösche</td><td>Xenopus-I Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Aufreinigungskit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkriptionskit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3)-T-1 kompetente Zelle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2935</td><td></td></tr><tr><td>Calcium-Ionophor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A23187</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Toxisches</td></tr><tr><td>Trichlor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Giftiges</td></tr> <tr><td>(1H,1H,2H,2H-Perfluoroctyl)-Silan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFPE-PEG Tensid</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluorTensid-2wtH-50G</td><td></td></tr><tr><td>GE Gesundheitswesen Glutathion-Sepharose 4B-Kügelchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Säule</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>VitroCom Miniatur-Hohlglasröhre</td><td>VitroCom</td><td>5012</td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZ61 Stereomikroskop</td><td>Olympus Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IX83 Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1200 Konfokalmikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spektralphotometer</td><td>Thermofisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mL Mikroröhrchen mit Schnappverschluss</td><td>E& K Scientific</td><td>485050-B</td><td></td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>ThermoFisher (Ambion)</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Analoger Vortex-Mischer</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>Version 7.3</td><td>Bildanalysesoftware</td></tr></tbody></table>

rekonstitution des zellzyklus schwingungen in mikroemulsionen zellfreie xenopus ei extrakte

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Echtzeit-Messung von Schwingungen auf die einzelne Zelle Ebene ist wichtig, die Mechanismen der biologischen Uhren entdecken. Obwohl Bulk Extrakte aus Xenopus Laevis Eier zubereitet mächtig in biochemischen Netzwerken zugrunde liegt die Zellzyklus Progression seziert wurden, führt deren Ensemble durchschnittliche Messung typischerweise zu einer gedämpften Schwingung, trotz jeder einzelnen Oszillator wird aufrechterhalten. Dies ist aufgrund der Schwierigkeiten der perfekte Synchronisation zwischen einzelnen Oszillatoren in laut biologischer Systeme. Die einzelligen Dynamik des Oszillators abzurufen, entwickelten wir ein Droplet-basierten künstlichen Zellsystem, die mitotische Zyklen in zellähnliche Fächer Verkapselung Radsport zytoplasmatischen Extrakte von Xenopus Laevis Eier rekonstruieren kann. Diese einfachen nur cytoplasmatische Zellen weisen nachhaltige Schwingungen für über 30 Zyklen. Um kompliziertere Zellen mit Kernen zu bauen, haben wir Demembranated Spermien Chromatin Kerne Selbstmontage im System ausgelöst. Wir beobachteten eine periodische Abfolge von Chromosom Kondensation/enttauung und Kerne umhüllen Aufschlüsselung/Reformation wie in realen Zellen. Dies bedeutet, dass der mitotische Oszillator treu dient dazu um mehrere nachgeschaltete mitotischen Ereignisse zu fahren. Wir haben gleichzeitig die Dynamik der mitotischen Oszillator und nachgelagerte Prozesse in einzelnen Tröpfchen mit Multi-Channel-time-lapse-Fluoreszenz-Mikroskopie. Das künstliche Zellzyklus-System bietet einen Hochdurchsatz-Rahmen für quantitative Manipulation und Analyse der mitotischen Schwingungen mit einzelligen Entschließung, die wahrscheinlich wichtige Erkenntnisse über die regulatorischen Maschinen und Funktionen des liefert die Uhr.

In Abbildung 2zeigen wir, dass dieses Protokoll mitotische Schwingungen in einfache, atomwaffenfreien Zellen sowie komplizierte Zellen mit Kernen produziert, wo der Oszillator den zyklischen Wechsel von Kernen Bildung und Verformung treibt. Die Kerne frei Tröpfchen erzeugen mitotische Schwingungen bis zu 30 ungedämpften Zyklen über die Zeitspanne von 92 Stunden, wie durch den periodischen Synthese und Abbau von einem Fluoreszenz-Reporter securin-mCherry (<str...

Wir präsentieren eine Methode zur Erzeugung von in-vitro- autarken mitotischen Schwingungen auf der Ebene der einzelnen Zelle durch Verkapselung Ei Extrakte von Xenopus Laevis in Wasser-in-Öl-Mikroemulsionen.

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Systembiologie zu beantworten, wie z. B. den Regelungsmechanismus hinter dem mitotischen Netzwerk und die dynamischen Eigenschaften und Funktionen der Zellzyklusuhr. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine große Menge von Tröpfchen mit jeweils mehreren Zellzyklen erzeugt und uns ein Hochdurchsatz-Framework für quantitative Manipulation und Analyse bietet. Um zu beginnen, entsorgen Sie Chargen von Eiern, die unklare Grenzen zwischen tierischen und vegetalischen Polen oder unregelmäßigen weißen Flecken auf tierischen Polen haben.Als nächstes wählen Sie eine entsprechende Charge Eier von einem weiblichen Frosch, und übertragen Sie die Eier auf ein 600-Milliliter-Becher. Gießen Sie einen Überschuss von 0,2x MMR-Puffer, und fügen Sie Cystein in 1x ExtraktPuffer zu den Eiern. Danach den Becher kräftig von Hand schütteln, um die Geleemäntel der Eier zu entfernen.Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal mit insgesamt 800 Milliliter Cysteinpuffer oder bis die Eier sich aggregieren und am Boden des Bechers absetzen. Nachdem das Gelee-Mantel entfernt wurde, waschen Sie die Eier viermal in einem Liter 0,2x MMR-Lösung. Verwenden Sie eine Glaspipette, um die Eier, die weiß werden, aufzunehmen und zu entsorgen.Gießen Sie den MMR-Puffer aus dem Becher, und fügen Sie 200 Milliliter Calciumionophorlösung in die Eier. Verwenden Sie eine Glaspipette, um die Eier sanft zu rühren, bis sie aktiviert werden, und entfernen Sie die Calcium-Ionophor-Lösung. Wenn die Eier zu lange in Calciumionophorlösung gelassen werden, wird dies eine Apoptose initiieren.Wir rühren die Eier 1,5 Minuten lang und überprüfen die Aktivierungseffizienz. Wenn sie nicht aktiviert sind, fahren Sie mit dem Rühren fort, und überprüfen Sie häufiger, bis eine 90%ige Aktivierung erreicht ist. Nachdem sich die Eier am Unteren Rand des Bechers absetzen, überprüfen Sie die Aktivierungseffizienz.Gut aktivierte Eier haben etwa 25% des Tierpols und 75% des Gemüsepols. Als nächstes waschen Sie die Eier zweimal mit einem Gesamtvolumen von 50 Milliliter Nextraliter Naderpuffer, ergänzt mit Protease-Inhibitoren. Dann die Eier vorsichtig auf ein 0,4-Milliliter-Snap-Cap-Mikrotube übertragen.Zentrifugieren Sie das Mikrorohr 60 Sekunden lang bei 200 g und dann 30 Sekunden lang bei 600 g, um die Eier einzupacken. Verwenden Sie dann eine glasende Pasteurpipette, um den überschüssigen Puffer auf den Eiern nach jedem Schritt zu entfernen. Danach die Eier bei 15.000 g 10 Minuten bei vier Grad Celsius zerdrücken.Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Rohre zu schneiden, um die drei Schichten von zerkleinerten Eiern zu trennen und das rohe Zytoplasma in der mittleren Schicht zu halten. Dann übertragen Sie das rohe Zytoplasma, um Ultrazentrifugenrohre zu reinigen. Ergänzen Sie das Zytoplasma mit Protease-Inhibitoren und Cytochalasin B bei jeweils 10 Mikrogramm pro Milliliter.Zentrifugieren Sie das rohe Zytoplasma bei 15 000 g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Verwenden Sie dann eine Rasierklinge, um das Rohr zu schneiden und das Zytoplasma in der mittleren Schicht zu halten. Die frisch zubereiteten Extrakte auf Eis legen.Fügen Sie zunächst securin-mCherry mRNA zu den vorbereiteten Extrakten hinzu. Als nächstes fügen Sie dem Extrakt mRNA-Gemisch 200 Mikroliter 2%PFPE-PEG-Fluorosursidans hinzu. Verwenden Sie einen Wirbelmischer, um Tröpfchen zu erzeugen und die Wirbelgeschwindigkeit und -dauer nach Bedarf anzupassen.Überprüfen Sie dann die Tröpfchen visuell, um sicherzustellen, dass sie einheitlich sind. Mit einer 200-Mikroliter-Pipette die auf der Oberseite schwebenden Tröpfchen und ein gleiches Tensidvolumen auf ein PCR-Rohr übertragen. Tauchen Sie ein Glasrohr in die Tröpfchenschicht, und warten Sie, bis die Tröpfchen etwa 75% des Rohres füllen.Dann schieben Sie das Rohr in die Tensidschicht, und füllen Sie das Rohr vollständig. Als nächstes füllen Sie eine Schale mit Glasboden mit Mineralöl. Dann verwenden Sie eine feine Pinzette, um das mit Tröpfchen gefüllte Rohr in das Öl einzutauchen.Verwenden Sie eine Glaspipette, um sichtbare Trümmer oder ausgelaufene Tröpfchen zu entfernen. Um Bewegung und Leckage von Tröpfchen zu vermeiden, sollte das mit Tröpfchen gefüllte Glasrohr sorgfältig unter Mineralöl getaucht werden. Wir können entweder die Röhre an beiden Enden mit Dembalese schieben oder zuerst ein paar Tropfen Mineralöl an die Enden des Rohres geben.Verwenden Sie anschließend ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer motorisierten xy-Stufe ausgestattet ist, um die Tröpfchen abzubilden. Nehmen Sie Zeitraffervideos im hellen Feld und mehrere Fluoreszenzkanäle alle sechs bis neun Minuten auf, bis die Tröpfchen ihre Aktivität verlieren. Mit diesem Protokoll wurden mitotische Oszillationen sowohl in einfachen, kernfreien Zellen als auch in komplizierten Zellen mit Kernen hergestellt.Die kernfreien Tröpfchen erzeugten mitotische Schwingungen bis zu 30 undamped Zyklen über 92 Stunden. Die Fähigkeit des mitotischen Oszillators, nachgeschaltete mitotische Ereignisse anzutreiben, wurde ebenfalls untersucht. Der selbsttragende mitotische Oszillator trieb die Veränderungen der kerntechnischen Morphologie voran, die durch die autonome Veränderung verschiedener Zellzyklusphasen beobachtet wurden.Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, die Zeit bei der Herstellung des Extraktes zu beachten, da es zeitempfindlich ist, und halten Sie immer die Eier und Extrakt auf Eis. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Systembiologie, um grundlegende Prinzipien komplexer Uhreigenschaften wie Tunabilität und Stochasticity in Xenopus laevis zu erforschen.

reconstitution-cell-cycle-oscillations-microemulsions-cell-free

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Crude und fraktionierte Xenopus Ei Extrakte können verwendet werden, um Zutaten für die Wiedererrichtung zelluläre Prozesse für die morphologische und biochemische Analyse zu liefern. Egg Lyse und differentielle Zentrifugation werden verwendet, um den Rohextrakt, die wiederum in zur fraktionierten Extrakte und Licht Membranpräparationen vorbereiten.

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Produktion von<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

Es wird ein Verfahren zur Analyse von Protein-Abbau unter Verwendung radioaktiv markiert und die Luciferase-Fusionsproteine ​​in Xenopus-Ei-Extrakt und deren Anpassung für Hochdurchsatz-Screening für Kleinmolekül-Modulatoren der Proteinabbaus beschrieben.

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Wir beschreiben Methoden zur Manipulation unreifer Eizellen von Xenopus laevis, zur In-vitro-Reifung von Eizellen zu Eizellen und zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion. Dieses Protokoll ermöglicht den Abbau einiger mütterlicher Proteine und die Überexpression von Genen von Interesse während der Befruchtung und ist daher wertvoll, um die Rolle spezifischer Faktoren in der frühen Embryonalentwicklung zu untersuchen.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Die molekularen Mechanismen der Dekondensation von hochverdichtetem mitotischem Chromatin sind unklar. Wir präsentieren einen zellfreien Assay, der auf mitotischen Chromatinclustern basiert, die aus HeLa-Zellen und Xenopus laevis-Eiextrakt isoliert wurden und den Dekondensationsprozess in vitro originalgetreu rekonstituieren.

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose

Wir beschreiben ein Xenopus-Eizell- und Tierkappensystem für die Expressionsklonierung von Genen, die in der Lage sind, eine Reaktion in kompetentem Ektoderm zu induzieren, und diskutieren Techniken für die anschließende Analyse solcher Gene. Dieses System ist nützlich bei der funktionellen Identifizierung einer Vielzahl von Genprodukten.

Functional Cloning Mit ein<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizellen Expression System

Mechanismen der zellulären und intrazellulären Skalierung bleiben schwer fassbar. Die Verwendung von Xenopus-Embryoextrakten wird immer häufiger, um die Mechanismen der Organellengrößenregulation aufzuklären. Diese Methode beschreibt die Herstellung von Embryonenextrakten und einen neuartigen Kernskalierungsassay, durch den Mechanismen der Kerngrößenregulation identifiziert werden können.

Ein zellfreien Assay unter Verwendung von<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extrahiert Mechanismen der Kerngröße Verordnung zum Studium

Der Aufbau und die Positionierung der mitotischen Spindel hängen von den kombinierten Kräften ab, die durch die Dynamik der Mikrotubuli, Motorproteine und Vernetzer erzeugt werden. Im Folgenden stellen wir unsere neu entwickelten Methoden vor, bei denen der geometrische Einschluss von sphärischen Emulsionströpfchen für die Bottom-up-Rekonstitution basischer mitotischer Spindeln genutzt wird.

Rekonstitution von Grund Mitosespindeln in Sphärische Emulsionströpfchen

Wir berichten über zwei Zellsynchronisationsprotokolle, die einen Kontext für das Studium von Ereignissen im Zusammenhang mit bestimmten Phasen des Zellzyklus bieten. Wir zeigen, dass dieser Ansatz für die Analyse der Regulation von spezifischen Genen in einem ungestörten Zellzyklus oder bei Exposition gegenüber Mitteln, die den Zellzyklus beeinflussen, nützlich ist.

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung und Live-Bildgebung von unverdünnten zytoplasmatischen Extrakten aus Xenopus laevis-Eiern .

Xenopus laevis Ei-Extrakt-Zubereitung und Live-Bildgebungsverfahren zur Visualisierung der dynamischen zytoplasmatischen Organisation

Ein Protokoll für die Kultur und Manipulation von embryonalem Gewebe der Maus auf einem mikrofluidischen Chip wird bereitgestellt. Durch die Anwendung von Impulsen von Signalwegmodulatoren kann dieses System verwendet werden, um Signalschwingungen für die funktionelle Untersuchung der Maussomitogenese extern zu steuern.

Ein mikrofluidischer Ansatz zur funktionellen Untersuchung von Signalschwingungen, die die Somitogenese steuern

Erfahren Sie die Rekonstitution mitotischer Oszillationen in Mikroemulsionen mit zellfreien Xenopus laevis-Eiextrakten. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatzanalysen zur Untersuchung der Zellzyklusdynamik.

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

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