Name: Generierung von Homo- und Heterografts zwischen Wassermelone und Flaschenkürbis for the Study of Kälte eine geschlechtergerechte MicroRNAs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Erstellung von Homo- und Heterografts zwischen Wassermelone und Flaschenkürbis zur Untersuchung kälteresponsiver MicroRNAs. Diese Technik liefert reproduzierbare Ergebnisse mit hoher Überlebensrate.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31772191), das Forschungsprojekt für öffentliche Interesse in der Provinz Zhejiang (2017 C 32027), die Schlüssel Science Projekt der Pflanzenzüchtung in Zhejiang (2016 C 02051) und das nationale Programm für unterstützt. die Unterstützung von erstklassigen Young Professionals (zu P.X).

1. Samen Sie Sterilisation und Keimung
<ol><li>Einweichen Sie Oberfläche Sterilisation der Flaschenkürbis Samen in einen 500-mL-Becherglas gefüllt mit Wasser bei 58 ° C mit gelegentlichen rühren, bis die Wassertemperatur auf 40 ° C sinkt.</li>
	<li>Unterdessen setzen 3 kg der Torfboden in einer Nylontasche und sterilisieren, Autoklaven es bei 120 ° C/0.5 MPa für 20 Minuten.</li>
	<li>Halten Sie Einweichen der Flaschenkürbis Samen für 4-5 Std. mehr mit nicht gerührt.<ol>
<li>Sobald das Wasser Zimmertemperatur erreicht, spülen Sie die Samen 2 x - 3 X mit destilliertem Wasser ab.</li>
		<li>Das überschüssige Wasser abgießen und die Samen sprießen in Gazebeutel bei 28 ° C in einer Kammer Wachstum im Dunkeln zu ermöglichen.</li>
		<li>Nach der Keimung die Saat in Kunststoff-Töpfe (6 cm Durchmesser) gefüllt mit sterilisierten Torfboden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn die Sämlinge Flaschenkürbis zwei abgeflachten Keimblätter entwickelt haben, wiederholen Sie Schritte 1.1-1.3 mit Wassermelone Samen. Hinweis: Diese Zeit-Management sorgt dafür, dass die Größen der Spross und Unterlage für erfolgreiche Transplantation übereinstimmen.</li>
</ol>(2) Wachstum des Keimlings und Veredelung
<ol><li>Wachsen Sie die Keimlinge in einer Wachstums-Kammer mit einem dunklen Zyklus von 16 h Licht /8-h halten die Temperatur bei 28 ° C tagsüber (Licht) und bei 22 ° C in der Nacht (dunkel). Spülen Sie die Sämlinge durch Zugabe von Wasser 1 x pro Tag am späten Nachmittag.</li>
	<li>Verwenden Sie die Schnitt-Pfropfen Methode22 , Heterografts zu machen, wenn die Sämlinge der Flaschenkürbis (Wurzelstock) auf einen True-Blatt-Stadium und die Keimblätter der Wassermelone (Spross) (noch nicht abgewickelten) entstanden.<ol>
<li>Schneiden Sie die Hypocotyle der Wassermelone Sämlinge an 2-3 cm unterhalb der Keimblätter und der Spitze der Flaschenkürbis Sämlinge am Standort unmittelbar über den wahren lässt.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Zahnstocher, um ein Loch in der Spitze der getrimmte Flaschenkürbis Sämlinge bilden. Legen Sie die gestutzten Wassermelone Sämlinge in die Löcher der Flaschenkürbis Sämlinge, Heterografts zu machen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie eine ähnliche Methode wie in Schritt 2.2 vorgestellt, um Homografts zu machen. Hinweis: Homo- und Heterografting-Kombinationen sollte immer erfolgen gleichzeitig (Abbildung 1), die, in diesem Fall ergibt sich im folgenden: Wassermelone/Flaschenkürbis (WB, Heterograft), Watermelon/Wassermelone (WW, Homograft) und Flaschenkürbis /bottle Kürbis (BB, Homograft).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig1.jpg"> Abbildung 1: Abbildung der Transplantat-Kombinationen und die veredelten Pflanzenstrukturen. WB = Wassermelone/Flasche Kürbis Heterografting; WW = Watermelon/Wassermelone Homografting; BB = Flaschenkürbis/Flasche Kürbis Homo-Pfropfen; WB-S = Spross Blätter von der Wassermelone/Flasche Kürbis-Heterografts, die abgetastet wurden; WB-R = Wurzelstock Blätter von der Wassermelone/Flasche Kürbis-Heterografts, die abgetastet wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
3. Management, Kältebehandlung, postgrafting und Probenahme
<ol><li>Versetzen die verpflanzte Sämlinge mit transparenten Polyethylen-Beutel zu halten eine relativ hohe Luftfeuchtigkeit und pflegen sie für 7D unter Umweltbedingungen von 16 h Licht/8-h dunkel Zyklen, wobei die Temperatur bei 28 ° C tagsüber (Licht) und bei 22 ° C während der Nacht (dunkel).</li>
	<li>Entdecken Sie die transparente Polyethylen-Beutel am 7. Tag. Lassen Sie die Pflanze für eine zusätzliche 7-10 Tage unter den gleichen Bedingungen.</li>
	<li>Teilen Sie die gesunde einheitliche Sämlinge in zwei Gruppen, eine für Kältebehandlung (betont) und eine für die Steuerung (betont). Verlassen Sie für die Kontrollgruppe die Sämlinge in derselben Kammer Wachstum (bei 28 ° C) für weitere 48 h, während für die Kälte-betonte Gruppe zu, übertragen Sie die Sämlinge zu einer Wachstums-Kammer mit einer konstanten Temperatur bei 6 ° C, hell/dunkel-Bedingungen zu, wie in Schritt beschrieben 2.1.</li>
	<li>Probieren Sie die Blätter der Scion und die Unterlage aus der Grafts (Abbildung 1). Die Proben sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-70 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.</li>
</ol>(4) Bibliothek Vorbereitung und Hochdurchsatz-Sequenzierung
<ol><li>Die gefrorenen Proben zu einem 2-mL Microcentrifuge Schlauch in flüssigem Stickstoff zu übertragen.</li>
	<li>Jedes Rohr mit den Geweben fügen Sie eine Perle aus rostfreiem Stahl (5 mm Durchmesser hinzu).</li>
	<li>Homogenisieren der Gewebe zu einem feinen Pulver mit einer Perle Mühle Homogenisator für 30 s.</li>
	<li>Nehmen Sie für jede Pfropfen Kombination gleiche Mengen (0,1 g) Boden-Probe von zehn Sämlinge und mischen sie in einer 10 mL Zentrifugenröhrchen. Hinzufügen einer entsprechenden Menge an Guanidium Hydrochlorid Reagenz (Table of Materials) auf der Grundlage des Herstellers Vorschläge, das Gewebe Gewicht entspricht.<ol>
<li>Entfernen von genomischer DNA-Kontaminationen durch Zugabe von RNA-freie DNase I bis 150 U/mL bei 37 ° C für 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entscheidung über die insgesamt RNA-Menge auf ein Microcapillary Elektrophorese System für die RNA-Integrität gewährleisten Nummer &gt; 7.0. Hinweis: RIN &gt; 7.0 sorgt für eine hohe Integrität der RNA-Proben.</li>
	<li>Bereiten Sie kleine RNA-Bibliotheken mithilfe eines kommerziellen Kits (Table of Materials) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 1 µg Gesamt-RNS pro Probe um zu initiieren.<ol>
<li>Tauwetter Bibliothek Normalisierung Reagenzien und Adapter nach den Richtlinien des Herstellers. Kleinen RNAs mit 5 ' und 3 '-Adapter verbinden und eluieren und sie zu reinigen. Dann umgekehrt die 5′ transkribieren und 3' ligiert kleinen RNAs, die nach den Richtlinien des Herstellers.</li>
		<li>Durchführen Sie PCR-Amplifikation gemäß Protokoll des Herstellers. Beurteilen Sie die Qualität und Quantität der cDNA-Bibliotheken, die mit einem Microcapillary-Elektrophorese-System.</li>
		<li>Laden 1 µL einer RNA-Bibliothek auf einem Microcapillary Elektrophorese System um sicherzustellen die RIN &gt; 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die kleine RNA-Bibliotheken auf einem Instrument von Hochdurchsatz-Sequenzierung an anderer Stelle beschriebenen23-Sequenz.</li>
</ol>5. MiRNA und Target Gen Vorhersage
<ol><li>Verwenden Sie für jede Pfropfen Kombination die open-Source UEA sRNA Werkbank 2,4-Anlage Version24 , minderwertige Sequenzen zu entfernen und um Adapter Sequenzen aus der rohen liest zu trimmen. Sequenzen, die kleiner als 18 Jahre sind zu verwerfen nt oder größer als 32 nt.</li>
	<li>Die qualitativ hochwertigen "sauberen" Sequenzen auf die open-Source Rfam 11.0-Datenbank zu erkennen und zu entfernen, liest der rRNA, tRNA, SnoRNA und anderen SnRNAs zu vergleichen.</li>
	<li>Richten Sie die verbleibenden Lesezugriffe auf die Referenz-Genome mit einem kurzen lesende Sequenz Ausrichtung Tool25. In diesem Schritt darf keine stimmen nicht überein. Hinweis: Die Wassermelone "97103" Genom Versammlung V126 für die Angleichung an die liest aus dem Spross verwendet wurde, und der Flaschenkürbis "HZ" Genom Versammlung V127 wurde für liest aus dem Wurzelstock verwendet.</li>
	<li>Vergleichen Sie die restlichen liest gegen bekannte Reifen MiRNAs in der open-Source MiRBase 22,028. Lesevorgänge, die homolog zu bekannten MiRNAs sind werden als konservierte MiRNAs klassifiziert.</li>
	<li>Vergleichen Sie die Sequenzen, die nicht die bekannten MiRNA-Vorläufer mit der Genomsequenz überein. Verwenden Sie die MIREAP29 Algorithmus, um potenzielle neuartige MiRNAs bei Standardeinstellungen zu erkennen.</li>
</ol>(6) differentielle Expression und Gene Ontology-Analyse
<ol><li>Vergleichen Sie die Ausdruck-Ebenen der MiRNAs basierend auf ihre lesen Sie zählt. MiRNAs mit einem P-Wert (Fishers exakter Test) &lt; 0,05 und eine absolute Log2 Wert &gt; 2 gelten differenziell ausgedrückt werden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine antisense-Oligonukleotid Ziel Website Auswahl Werkzeug (TargetFinder)30 mögliche ergänzende mRNAs (MiRNA Zielgene), die differentiell exprimierten MiRNAs unter Standardparameter vorherzusagen.</li>
	<li>Verwenden Sie die gen-Ontologie (gehen) Bereicherung analytisches Werkzeug31 , MiRNA Ziel Gene Ontology (gehen Sie) offenbaren Muster unter einer P- Schwellenwert von 0,05 für statistische Signifikanz.</li>
</ol>

<ol><li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004243">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://journals.tubitak.gov.tr/havuz/bot-1404-115.pdf">Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses.</a> Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).</li>
<li>Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468014116000030">Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings.</a> Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).</li>
<li>Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/43/3/730.full">Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation.</a> HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).</li>
<li>Savvas, D., et al. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/44/7/1978.full">Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato.</a> HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).</li>
<li>Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004115">Hormonal signaling in rootstock-scion interactions.</a> Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).</li>
<li>Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11099-012-0002-1">Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks.</a> Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).</li>
<li>Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004462">Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds.</a> Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).</li>
<li>Asins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+rootstock-mediated+nitrogen+%28N%29+uptake+and+root-to-shoot+signalling+at+contrasting+N+availabilities+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato.</a> Plant Science. 263, 94-106 (2017).</li>
<li>Yin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.actahort.org/books/1086/1086_26.htm">Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes.</a> Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).</li>
<li>Gaion, L. A., Carvalho, R. F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00344-017-9759-6">Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?</a> Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).</li>
<li>Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurnbull%2C+CG+%22Plant+Developmental+Biology%22">Plant Developmental Biology</a>. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafting-responsive+miRNAs+in+cucumber+and+pumpkin+seedlings+identified+by+high-throughput+sequencing+at+whole+genome+level%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level.</a> Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).</li>
<li>Lakhotia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+miRNAome+in+root%2C+stem%2C+leaf+and+tuber+developmental+stages+of+potato+%28Solanum+tuberosum+L.%29+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 6(2014).</li>
<li>Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+their+regulatory+roles+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and their regulatory roles in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).</li>
<li>Puzey, J. R., Kramer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+conserved+Aquilegia+coerulea+microRNAs+and+their+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic%22%5BJournal%5D)">Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets.</a> Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).</li>
<li>Matthewman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR395+is+a+general+component+of+the+sulfate+assimilation+regulatory+network+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis.</a> FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).</li>
<li>Ali, E. M., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13562-015-0334-6">Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions.</a> Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).</li>
<li>Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11738-016-2070-5">MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).</li>
<li>Pagliarani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accumulation+of+miRNAs+differentially+modulated+by+drought+stress+is+affected+by+grafting+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).</li>
<li>Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+and+comparative+analysis+of+conserved+and+novel+microRNAs+in+grafted+watermelon+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 8 (2), e57359(2013).</li>
<li>Song, G. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/294376070_Development_of_2JC-350_automatic_grafting_machine_with_cut_grafting_method_for_vegetable_seedling">Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling.</a> Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).</li>
<li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+leaf+rust+responsive+miRNAs+in+wheat+%28triticum+aestivum+l.%29+using+high-throughput+sequencing+and+prediction+of+their+targets+through+degradome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis.</a> Planta. 245 (1), 1-22 (2016).</li>
<li>Kohli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+wilt+and+salt+stress-responsive+microRNAs+in+chickpea+through+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 9 (10), e108851(2014).</li>
<li>Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://sacan.biomed.drexel.edu/cmteditor/program/download?confname=ssdbm2013&pid=k2&file=paper">Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management.</a> ACM. 2, (2013).</li>
<li>Guo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+draft+genome+of+watermelon+%28Citrullus+lanatus%29+and+resequencing+of+20+diverse+accessions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.</a> Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gourdbase%3A+a+genome-centered+multi-omics+database+for+the+bottle+gourd+%28lagenaria+siceraria%29%2C+an+economically+important+cucurbit+crop%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop.</a> Scientific Reports. 8 (1), 306(2018).</li>
<li>Wang, X. F., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Curation+of+miRBase+Annotation+Using+Integrated+Small+RNA+High-Throughput+Sequencing+Data+for+C.+elegans+and+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila.</a> Frontiers in Genetics. 2, 25(2011).</li>
<li>Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://sourceforge.net/projects/mireap/">http://sourceforge.net/projects/mireap/</a> (2008).</li>
<li>Bo, X. C., Wang, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TargetFinder%3A+a+software+for+antisense+oligonucleotide+target+site+selection+based+on+MAST+and+secondary+structures+of+target+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA.</a> Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).</li>
<li>Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.5281/zenodo.31628">https://doi.org/10.5281/zenodo.31628</a> (2015).</li>
<li>Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423815303794">Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd.</a> Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben. Die kleine RNA Sequenzierungsdaten lagert sich in der GenBank unter Zbl-Nummer SRP136842.

In diesem Protokoll beschrieben wir eine hoch effiziente und reproduzierbare Methode um Homo- und Heterografts zwischen Wassermelone und Flaschenkürbis ausführlich. Diese Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung ist sehr einfach zu bedienen und hat in der Regel eine sehr hohe Überlebensrate der Pfropfung. Die Methode kann auch verwendet werden, zu Transplantationen für andere Kürbisgewächse, wie z. B. zwischen Wassermelone, Gurke und Kürbis.
Es ist erwähnenswert, dass die relative Größe (A...

Pfropfung wurde lange als eine landwirtschaftliche Technik eingesetzt, um pflanzliche Erzeugung und Toleranz gegenüber biotischen und abiotischen Stress1,2,3zu verbessern. In Heterografting Systemen können Elite Wurzelstöcke Wasser und Nährstoffe Aufnahme von Pflanzen erhöhen, verstärken Resistenz gegen pathogene Boden und Begrenzung die negativen Auswirkungen der Metall-Toxizität4,5, die die Transplantate eine erweiterte verleihen kann Wachstum, Vitalität und erhöhte Toleranz gegenüber Umweltbelastungen. In vielen Fällen kann Heterografting auch Obst Qualitäten im Gartenbau Pflanzen führt zu verbesserten Fruchtgeschmack und erhöhten Gehalt von gesundheitsbezogenen Verbindungen6,7auswirken. Es wurde festgestellt, dass der Fernverkehr Transfer von Phytohormonen, RNAs, Peptide und Proteine zwischen der Unterlage und dem Spross ein grundlegender Mechanismus modulieren das Wachstum und die Entwicklung Umprogrammierung der Spross Pflanzen8,9 ,10. Pfropfen hat in Studien der Fernverkehr Signal- und Transport in Bezug auf umweltgerechte Anpassung11verbreitet wurde. Pfropfen Experimente sind besonders leistungsfähig für eindeutige Erkennung der übertragenen Moleküle bei der Aufnahme von Gewebe oder vaskulären Sap und Aktivierung oder Unterdrückung von molekularen Zielstrukturen durch Signal Übertragung12.
Eine Rolle bei der Erleichterung der Anpassung der Anlage an abiotischem Stress13wurden nicht-kodierende RNAs, eine große Klasse von RNA, die wichtige regulatorische Funktionen in Zellen ausüben gemeldet. MiRNAs sind endogen kleine nicht-kodierende RNAs von ca. 20-24 nt. Untersuchungen ergaben die regulierende Rolle von MiRNAs in verschiedene Aspekte der Pflanze Aktivitäten, so wie Wachstum, schießen seitlich Wurzel Bildung14,15,16, Nährstoffaufnahme, Sulfat-Stoffwechsel und Homöostase17, und Antworten zu biotischen und abiotischen stress18. Vor kurzem, der Ausdruck von MiRNAs und ihre Zielgene betrafen Stresstoleranz heterografted Gurke Sämlinge19Salz. In der intervariety Transplantationen von Trauben die Reaktionen der MiRNA Ausdruck auf Trockenstress erwiesen sich Genotyp-abhängige20.
Die rasante Entwicklung und sinkenden Kosten der Hochdurchsatz-Sequenzierung Technik haben eine große Chance für das Studium der MiRNA Vorschriften in agronomische Anlagen zur Verfügung gestellt. Wassermelone (Citrullus Lanatus [Thunb.] Mansf.), eine wichtige Cucurbit Ernte angebaut wird überall auf der Welt ist anfällig für niedrige Temperaturen. Flaschenkürbis (Lagenaria Siceraria [Molina] (Standl.) ist ein widerstandsfähiger Klima Cucurbit üblicherweise von Landwirten mit Wassermelone zu verpflanzen. Das primäre Ziel der aktuellen Studie soll einen Standard, effiziente und bequeme Methode zur Herstellung von Heterografts zwischen Wassermelone (Citrullus Lanatus [Thunb.] Mansf.) und Flaschenkürbis (Lagenaria Siceraria [Molina] Standl). Dieses Protokoll bietet auch eine detaillierte Regelung experimentelle und analytische Verfahren für die Untersuchung der Regulierung von MiRNA Ausdrücke nach Transplantation, die eignet sich für die Entdeckung der Mechanismen, die Heterografting Vorteile.
In dieser Studie verwendeten Anlage gehören die Wassermelone Sorte und der Flaschenkürbis Landrasse. Wassermelone Sorte ist eine kommerzielle Sorte mit hohem Ertrag aber anfällig für niedrige Temperaturen. Flaschenkürbis Landrasse ist eine beliebte Unterlage für Pfropfen mit Wassermelone, Gurke und Flaschenkürbis, durch seine sehr gute Verträglichkeit von niedrigen Temperaturen21.

<table><tbody><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>RNA-frei DNase I</td><td>Takara</td><td>D2270A</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Kit zur Vorbereitung kleiner RNA-Proben</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bionalyser</td><td>Agilent</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>UEA sRNA-Werkbank 2,4-Pflanzen-Version&nbsp; (Software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td></tr> <tr><td>Rfam 11.0 Datenbank&nbsp;( website)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://rfam.janelia.org</td></tr><tr><td>miRBase 22.0&nbsp;( website)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://www.mirbase.org/</td></tr> <tr><td>MIREAP(software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://sourceforge.net/projects/mireap/</td></tr> <tr><td>TargetFinder&nbsp;( software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://targetfinder.org/</td></tr></tbody></table>

generierung von homo- und heterografts zwischen wassermelone und flaschenkürbis for the study of kälte eine geschlechtergerechte micrornas

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

Micro-RNAs (MiRNAs) sind endogen kleine nicht-kodierende RNAs von ca. 20-24 nt, eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Anpassung spielen bekannt. Gibt es eine Anhäufung Beweise dafür, dass die Ausdrücke für bestimmte MiRNAs geändert werden, wenn aufpfropfen, eine landwirtschaftliche Praxis häufig von den Landwirten verwendet, um Ernte Toleranz gegenüber biotischen und abiotischen Stress zu verbessern. Flaschenkürbis ist ein von Natur aus klimaresistenten Ernte im Vergleich zu vielen anderen großen Kürbisgewächse, einschließlich der Wassermelone, wodurch es eines der am weitesten verbreitete Wurzelstöcke für Letzteres. Die jüngste Weiterentwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologien hat große Chancen, kalte reagierende MiRNAs und ihre Beiträge zum Heterograft Vorteile zu untersuchen; geeignete experimentelle Verfahren sind jedoch Voraussetzung für diesen Zweck. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur effizient Erzeugung von Homo- und Heterografts zwischen der Kälte-anfälligen Wassermelone und die Kälte-toleranten Flaschenkürbis, neben Gewebe Probenahmeverfahren, Datengenerierung und Datenanalyse. Die vorgestellten Methoden eignen sich auch für andere Pflanze-Pfropfen Systeme, MiRNA Vorschriften unter verschiedenen Umwelteinflüsse wie Hitze, Trockenheit und Salzgehalt zu befragen.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> Abbildung 2: Phänotypen von verschiedenen Transplantate bei Raumtemperatur und kalten betonte Bedingungen. (ein) zeigt dieses Panel Homo- und heterografted Sämlinge bei Raumtemperatur als Kontrolle. (b) zeigt dieses Panel Homo- und heterografted Sämlinge nach 48 h der Kältebehandlung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig2large.jpg"...

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für Homo- und Heterografts zwischen Wassermelone und Flaschenkürbis, zusätzlich zu den Methoden der Gewebe Probenahme, Datengenerierung und Datenanalyse, zur Untersuchung von Kälte auf eine geschlechtergerechte MicroRNAs effizient machen.

Generierung von Homo- und Heterografts zwischen Wassermelone und Flaschenkürbis for the Study of Kälte eine geschlechtergerechte MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in miRNA Antwort auf die Fähigkeit zu stressen in Pflanzentransplantate wie wie miRNA unter Kältestress in WassermelonenFlaschen-Gourd-Transplantate reguliert werden zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es hocheffiziente und reproduzierbare Methode ist, Homo und Heterotransplantate herzustellen. Es erfordert keine spezifische Ausrüstung, es ist sehr einfach durchzuführen, und führt in der Regel zu einer sehr hohen Überlebensrate der Transplantation.Durch diese Methode, kann Einblick in miRNA Reaktion auf Kältestress in der Wassermelone Flasche Gourd Transplantatsystem geben. Es kann auch auf andere moderne Organismen angewendet werden, um die Mechanismen des lokalen und Fern-miRNA-Transports zu enthüllen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Pfropfschritte schwer zu erlernen sind.Dieser Schritt erforderte fortgeschrittene Fähigkeiten und ist der Schlüssel zum Überleben der transplantierten Pflanzen. Zunächst können Sie in einem 500-Milliliter-Becher mit 58 Grad Celsius Wasser die Flaschenkräutersamen einweichen. Rühren Sie die Samen gelegentlich, bis die Wassertemperatur auf 40 Grad Celsius sinkt.Während das Wasser abkühlt, drei Kilogramm Torfboden in eine Nylontasche geben und autoklavieren. Sobald das Wasser Raumtemperatur erreicht hat, spülen Sie die Samen zwei- bis dreimal in destilliertem Wasser ab und entleeren Sie das überschüssige Wasser. Lassen Sie die Samen in einem Gazebeutel bei 28 Grad Celsius in der dunklen Wachstumskammer sprießen.Nach der Keimung die Samen in Plastiktöpfe säen, die mit dem sterilisierten Torfboden gefüllt sind. Wenn die Flaschenkräutersämlinge zwei abgeflachte Cotyledons entwickeln, wiederholen Sie diesen Prozess mit Wassermelonensamen. Die Flaschenbekörnung und die Wassermelonensämlinge in einer Wachstumskammer anbauen.Fügen Sie den Sämlingen einmal täglich am Nachmittag Wasser hinzu. Als nächstes schneiden Sie die Hypocotyle der Wassermelonensämlinge zwei bis drei Zentimeter unter die Kotyledonen. Schneiden Sie die Oberseite der Flasche Besteck Sämlinge an der Seite, direkt über den Cotyledons.Dann verwenden Sie einen Zahnstocher, um ein Loch in der Oberseite der getrimmten Flasche Besatz Sämlinge zu machen. Legen Sie die getrimmten Wassermelonensämlinge in das Loch, um Heterotransplantate zu machen. Danach bereiten Sie Homograften mit der zuvor beschriebenen Methode vor.Wickeln Sie zunächst die veredelten Sämlinge in transparente Polyethylenbeutel, um eine relativ hohe Luftfeuchtigkeit zu erhalten. Dann die gewickelten Sämlinge sieben Tage in einer Wachstumskammer aufbewahren. Nach dem siebten Tag die Säcke entfernen und die Pflanzen sieben bis zehn Tage unter den gleichen Bedingungen wachsen lassen.Teilen Sie die Sämlinge in zwei Gruppen auf, eine für Kältebehandlungen und eine für die Kontrolle. Bringen Sie die Kontrollsämlinge unter die gleichen Umgebungsbedingungen zurück. Legen Sie die kalt behandelten Sämlinge in eine Auf sechs Grad Celsius eingestellte Wachstumskammer mit den gleichen hellen dunklen Bedingungen wie die Kontrollgruppe.Nach 48 Stunden die Proben des Scions und der Wurzelstöcke aus den Transplantaten lassen. Die Proben sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei minus 70 Grad Celsius lagern. Übertragen Sie die gefrorene Probe in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr in flüssigem Stickstoff.Fügen Sie jedem Probenröhrchen eine Edelstahlperle hinzu und homogenisieren Sie das Gewebe zu einem feinen Pulver. Nehmen Sie für jede Pfropfkombination die gleichen Mengen an Gemahlenentlingen von 10 Sämlingen und mischen Sie sie in einem 10 Milliliter Zentrifugenrohr. Fügen Sie eine angemessene Menge an Guanidiumhydrochlorid-Reagenz hinzu.Als nächstes fügen Sie RNA-freie DNase ein bis 150 Einheiten pro Milliliter bei 37 Grad Celsius für eine Stunde hinzu. Bestimmen Sie dann die gesamte RNA-Menge auf einem mikrokapillaren Elektrophoresesystem. Danach die Bibliotheksnormalisierungreagenzien und Adapter auftauen.Dann ligate kleine RNase mit den fünf Prime und drei Prime Adapter, und elute und reinigen sie. Reverse transkribieren Sie die fünf Prime und drei Prime ligated kleine RNase nach den Richtlinien des Herstellers. Führen Sie als Nächstes die PCR-Verstärkung nach dem Herstellerprotokoll durch.Verwenden Sie dann das mikrokailläre Elektrophoresesystem, um sicherzustellen, dass die RNA-Integritätsnummer größer als sieben ist. Laden Sie einen Mikroliter einer RNA-Bibliothek auf das mikrokapillare Elektrophoresesystem, um sicherzustellen, dass die RNA-Integritätszahl größer als sieben ist. Sequenzieren Sie schließlich die kleinen RNA-Bibliotheken auf einem Sequenzierungsinstrument mit hohem Durchsatz.Mit diesem Protokoll wurde eine Überlebensrate von 98 % für die Transplantation und die Phänotypen für Raumtemperatur und Kaltstress-Bedingungen ermittelt. sRNAs von 24 Nukleotiden stellten die größte Klasse von sRNAs in allen Pfropfkombinationen, unabhängig von der Temperaturbehandlung. Nach 48 Stunden Kaltbehandlung waren 30 bzw. 268 microRNAs nach oben bzw. unten reguliert.In den Blättern des Scions in Heterotransplantaten hingegen waren in den Blättern des Wurzelstocks 31 bzw. 12 MicroRNAs nach oben bzw. unten reguliert. In den Wassermelonen-Wassermelonen-Homograften waren 64 bzw. 83 MicroRNAs nach oben bzw. unten reguliert. Dies zeigte, dass Heterotransplantation eine tiefgreifende Neuprogrammierung der microRNA-Ausdrücke verursachte.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich an die relative Größe und das Alter des Tochterstiels zu erinnern und der Scion ist entscheidend für eine erfolgreiche Transplantation. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die lncRNA-Sequenzierung, die proteomische Profilierung durchgeführt werden, um die Regulation von lncRNA und Protein und das Codierungssystem im Pfropfsystem zu untersuchen. Nach seiner Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forschung auf dem Gebiet der pflanzlichen abiotischen Toleranz, um den Mechanismus der Pflanzenveredelung Vorteil in Cucurbitaceae und darüber hinaus zu erkunden.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Guanidinhydrochlorid extrem gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens sollte immer eine angemessene Vorsichtsmaßnahme getroffen werden.

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Research

Forschung

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Environment

Umwelt

Dieses Video beschreibt die Mikroinjektion, eine gängige Methode zur Herstellung transgener C. elegans-Stämme. Im Beispiel sehen wir, wie die Mikroinjektion verwendet wird, um einen Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex für die Genbearbeitung auf CRISPR-Basen einzuführen.

Gonaden-Mikroinjektion: Eine Methode zur direkten Verabreichung von Verbindungen in die Keimbahn von C. elegans

Verwendung von DNA-Baugruppe können mehrere CRISPR Vektoren parallel in einem einzigen Reaktions Klonierung konstruiert werden, wodurch die Konstruktion einer großen Anzahl von CRISPR Vektoren eine einfache Aufgabe. Tomato Haarwurzeln sind ein ausgezeichnetes Modellsystem CRISPR Vektoren zu validieren und mutierten Materialien erzeugen.

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Die Mikroinjektion von Maus-Oozyten wird üblicherweise sowohl für die klassische Transgenese ( dh die zufällige Integration von Transgenen) als auch für das CRISPR-vermittelte Gen-Targeting verwendet. Dieses Protokoll überprüft die neuesten Entwicklungen in der Mikroinjektion, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle und Genotypisierung Strategien.

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zum Klonieren von mehreren einzelnen Leitungs-RNAs in einen Leitfaden-RNA-Concatemer-Vektor, der von besonderem Nutzen bei der Herstellung von Multi-Gen-Knockouts unter Verwendung der CRISPR / Cas9-Technologie ist. Die Erzeugung von Doppelknockouts in Darmorganoiden wird als mögliche Anwendung dieser Methode gezeigt.

Ein Protokoll für mehrfache Gen-Knockout in Maus-Dünndarm-Organoiden mit einem CRISPR-Concatemer

Hier präsentieren wir Protokolle für sammeln und microinjecting precellular westlichen Mais Maiswurzelbohrer Embryonen zum Zwecke der Ausführung der funktionellen Genomik Assays wie Keimbahn Transformation und CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung.

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

Dieses Ziel dieses Protokolls ist es, chimäre Axolotle mit haploiden Vorderbeinen aus Cas9-mutagenisiertem Spendergewebe unter Verwendung embryonaler Gewebetransplantationstechniken zu produzieren.

Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für das auf Kartoffelvirus X (PVX) basierende microRNA-Silencing-System (VbMS) zur funktionellen Charakterisierung endogener microRNAs (miRNAs) in Kartoffeln. Target Mimic (TM) Moleküle von miRNA von Interesse werden in den PVX-Vektor integriert und vorübergehend in Kartoffeln exprimiert, um die Ziel-miRNA oder miRNA-Familie zum Schweigen zu bringen.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln.

Hier wird ein Protokoll der Helicoverpa armigera (Hübner) Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutantenidentifizierung vorgestellt, das durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing erstellt wurde. Mutierte Insekten ermöglichen die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in vivo.

Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Ein Agrobacterium-basiertes Injektionsprotokoll (Agroinjektion) wird für die Impfung von Fuchsschwanzmosaikvirus und Zuckerrohrmosaikvirusclone in Maissämlinge vorgestellt. Die Impfung auf diese Weise führt zu einer Virusinfektion, einem virusinduzierten Gen-Silencing von Markergenen und einer viralen Überexpression von GFP.

Direkte Agroinokulation von Maissämlingen durch Injektion mit rekombinanten Foxtail Mosaic Virus und Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Dieses Protokoll beschreibt die Mikroinjektion und In-vivo-Elektroporation für die regional eingeschränkte CRISPR-vermittelte Genom-Editierung im Eileiter der Maus.

Somatic Genom-Engineered Mausmodelle mit In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation

Diese Studie entwickelte einen Arbeitsablauf zur Erstellung und Pflege stabiler Mutantenlinien für die Süßwasser-Apfelschnecke Pomacea canaliculata. Die Protokolle umfassen die Sammlung von Zygoten, deren Mikroinjektion mit den Komponenten des CRISPR/Cas9-Systems zur Induzierung der Genom-Editierung, Ex-Ovo-Kultur von Embryonen und Genotypisierung nach kontrollierten Kreuzungen.

Die Goldapfelschnecke Pomacea canaliculata: Von Zygoten zu stabilen mutierten Linien

Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Erstellung von Homo- und Heterografts zwischen Wassermelone und Flaschenkürbis zur Untersuchung kälteresponsiver MicroRNAs. Diese Technik liefert reproduzierbare Ergebnisse mit hoher Überlebensrate.

Generierung von Homo- und Heterografts zwischen Wassermelone und Flaschenkürbis for the Study of Kälte eine geschlechtergerechte MicroRNAs (Video) | JoVE Journal

Generierung von Homo- und Heterografts zwischen Wassermelone und Flaschenkürbis for the Study of Kälte eine geschlechtergerechte MicroRNAs

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