Humanisierten NOD/SCID/IL2rγ^null (Hu-NSG) Maus-Modell für HIV-Replikation und Latenz-Studien

Diese Fragen können helfen, schlüsselhafte Fragen der HIV/AIDS-Forschung zu beantworten, wie den molekularen Mechanismus und die Prognose einer HIV-Infektion und wie und wo das Latenzreservoir eingerichtet ist. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie nicht-invasiv ist und eine Hu-NSG-Mäuse etabliert hat, die eine Multi-Lineage-Entwicklung gegenüber transplantierten menschlichen Stammzellen behandeln müssen, die anfällig für HIV-Infektionen sind und für cART empfänglich sind. Beginnen Sie mit der Filterung einer verdauten, menschlichen, fetalen, Lebergewebe, Gülleprobe durch eine sterile, 70 Mikrometer, Nylon, Mesh-Sieb, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und bereichern für CD34 + HSCs durch magnetisch aktivierte Zellsortierung nach den Anweisungen des Herstellers.

Nach dem Zählen, setzen Sie den HSC bei einer zweimal-zehn-zu-der-siebten lebensfähigen Zelle pro Milliliter-Konzentration in frischen DPBS auf Eis. Als nächstes einen ganzen neonatalen menschlichen NOD/SCID/Gamma- oder NSG-Maus-Wurf in einen sterilen, tortenförmigen Bestrahlungskäfig legen und die Tiere mit 200 bis 250 Grad Gammastrahlen aus einer Cäsium-137-Strahlungsquelle behandeln. Dann laden Sie die Zellen in eine maßgeschneiderte, Hamilton 80508 50-Mikroliter-Spritze mit einer 30-Spur-Nadel ausgestattet, und injizieren jedes neugeborene Tier direkt in die Leber mit fünf-mal-zehn-zu-fünf-lebensfähigen menschlichen CD34 + HSCs und 25 Mikroliter DPBS.

Zehn bis zwölf Wochen nach der Infektion, Drehen retro-orbital, peripher, Blutproben von jeder Maus durch Zentrifugation, und übertragen Sie die Plasma-Supernate auf Mikrozentrifugen-Röhren für negative 80 Grad Celsius Lagerung als experimentell angemessen. Zur HSC-Transplantationsvalidierung die Pellets mit 200 Mikrolitern roter Blutzelllysepuffer wieder aufhängen und die Zellsuspensionen in einem 1,5 Millimeter Mikrozentrifugenrohr für eine zehnminütige Inkubation bei Raumtemperatur ziehen. Dann sammeln Sie die verbleibenden weißen Blutkörperchen durch Zentrifugation für zwei Wäschen in 0,5 Milliliter frisches, 0,01 Prozent Rinderserumalbumin, oder BSA, in DPBS pro Waschgang.

Nach der zweiten Wäsche, blockieren Sie die Zellen mit 100 Mikroliter blockieren den Cocktail für zwanzig Minuten bei 4 Grad Celsius, gefolgt von der Etikettierung mit dem entsprechenden Anti-Körper-Cocktail von Interesse bei einem 2 Mikroliter Anti-Körper pro einmal-eins-zu-die-sechste Zellen-Konzentration. Nach 30 Minuten bei 4 Grad Celsius die Zellen zweimal in frischem DPBS plus BSA waschen und die peripheren Blutproben durch Durchflusszytometrie nach Standardprotokollen auswerten, um den Prozentsatz der menschlichen CD45+CD3+CD14+oder CD19+Zellen pro Probe zu quantifizieren. Berechnen Sie dann das Verhältnis von CD4+zu-CD8+T-Zellen und bewerten Sie die Viruslast in den Plasmaproben nach Standard-, quantitativen, Reverse-Transkriptase-, PCR-Protokollen.

Um die Auswirkungen einer HIV-Infektion zu bewerten, liefern Sie HIV-Ballenvirus an anästhesierte, menschliche, NSG-Mäuse mit einer Human-CD45+-Zell-Population in ihrem peripheren Blut, mit einer P24-Nanogramm-Konzentration pro Maus über intraperitoneale Verabreichung, sammeln Blutproben durch retro-orbitale Blutungen alle zwei Wochen und analysieren sowohl das CD4-zu-CD8-Verhältnis als auch die Plasmaviruslast , wie gezeigt. Zur Viralsuppressionsvalidierung versorgen die infizierten, humanen NSG-Tiere die infizierten, kombinatorischen, antiretroviralen Therapien oder cART jede Woche für 4 Wochen in gesüßtem Wasser, sammeln alle zwei Wochen Blutproben durch retroorbitale Blutungen und analysieren sowohl das CD4-zu-CD8-Verhältnis als auch die Plasmaviruslast, wie gezeigt. Um den viralen Rebound zu bewerten, wenn die Plasmaviruslasten unter der Nachweisgrenze liegen und das CD4-zu-CD8-Verhältnis zwischen 1,5 und 2,5 wiederhergestellt wird, sammeln sie alle 2 Wochen nach cART-Entzug periphere Blutproben durch retroorbitale Blutungen und bewerten die Proben wie gezeigt.

Während der anfänglichen Transplantationsvalidierung sollte die menschliche CD45+Zell-Anzahl zwischen 20 und 80 Prozent liegen, und die Teilmengen menschlicher Leukozyten sollten durch zytometrische Flussanalyse als diskrete Populationen angezeigt werden. Das Verhältnis von CD4+zu-CD8+Zellen bleibt zwischen 1,5 und 2,5 bei gesunden Personen, während eine signifikante CD4+T-Zellerschöpfung typischerweise bei einer Virusinfektion beobachtet wird. Insbesondere wird das gesunde Verhältnis als Reaktion auf die cART-Behandlung wiederhergestellt.

Der Nachweis von Plasmaviruslasten durch quantitative RT PCR während des gesamten Verlaufs der Infektion und des cART-Regimes kann aufgezeichnet und verwendet werden, um die Effizienz der Viruszufuhr bzw. der antiviralen Behandlung zu bewerten. Obwohl diese Methode Einblicke in HIV/AIDS-Virologiestudien und therapeutische Entwicklung bieten kann, kann sie auch auf andere Studien im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Autoimmunerkrankungen angewendet werden. Die Entwicklung des hu-NSG-Mausmodells ebnete den Forschern in Immunologie und Onkologie den Weg, um eine neue Dysfunktion und Pathologie beim Menschen zu erforschen, insbesondere mechanistische und therapeutische Studien, die auf chronische HIV-Infektionen und das Latenzreservoir abzielen.