Name: Ein High-Throughput Luciferase Assay Proteolyse von Single-Umsatz Protease PCSK9 bewerten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Lernen Sie einen High-Throughput-Luciferase-Assay zur Bewertung der Proteolyseaktivität von PCSK9 in HEK293 T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Analyse niedrigfrequenter biochemischer Ereignisse und liefert wertvolle Erkenntnisse für die Lipidstoffwechselforschung.

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Die Autoren danken die großzügige finanzielle Unterstützung vom NHLBI/NIH (K08 HL124068 und LRP HMOT1243), NCATS/NIH durch die UCSF klinische und Translationale Wissenschaft Institut Catalyst-Programm (UL1 TR000004), des akademischen Senats von UCSF Hellman-Stiftung, eine Gilead Sciences Research Scholar Award, dem ASPIRE Pfizer Herz-Kreislauf-Award (alle John S. Chorba) und dem Howard Hughes Medical Institute (zum Adri M. Galvan und Kevan M. Shokat).

1. Site-verwiesene Mutagenese der Protease-Vektor
<ol><li>Entwerfen und bestellen Brauch synthetisiert Oligonukleotide, eine Mutation von Interesse, die eine Modifikation der standard Site-verwiesene Mutagenese Protokolle12zu installieren. Standard entsalzten Primer (ohne zusätzliche Reinigung) sind durchaus akzeptabel. Hinweis: Eine allgemeine Ausrichtung zu Grundierung Designs beinhaltet die Schaffung teilweise überlappender Grundierungen wie in Tabelle 1, unter Verwendung eines schmelzenden Temperatur (Tm) Rechners speziell für die Polymerase von Interesse.</li>
	<li>Richten Sie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für die Site-verwiesene Mutagenese auf Eis, wie in Tabelle 2angegeben.</li>
	<li>Die PCRs-Zyklus wie in Tabelle 3angegeben.</li>
	<li>Führen Sie 2 bis 5 µL jeder PCR auf einem 1 % Agarosegel und visualisieren Sie die Produkte, um eine erfolgreiche Verstärkung zu bestätigen. Hinweis: Eine erfolgreiche PCR zeigen eine einzelne, prominente DNA-Band auf die ungefähre Größe Marker der Vorlage (~7.8 kB).</li>
	<li>Fügen Sie DpnI 0,5 µL (pro 25 µL Reaktion) und inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 1 h.</li>
	<li>2 µL der Reaktion in chemisch kompetente Escherichia colizu verwandeln. Hinweis: Ein schnell wachsenden E. Coli -Stamm verringert die Inkubationszeiten, aber Klonen Dehnung akzeptabel sein wird.</li>
	<li>Die Transformationen auf Luria-Bertani (LB) Agar mit 50-100 µg/mL Carbenicillin Platte. Die Platten über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Wählen Sie 2-4 Kolonien wachsen in einer kleinen Kultur (2-5 mL LB-Medium mit 50-100 µg/mL Carbenicillin). Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C bei 220 u/min, bis es trübe ist.</li>
	<li>Isolieren Sie das Plasmid DNA von den Zellen mit einem Plasmid DNA Reinigung (d.h. "Miniprep") Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Konzentration der eluierten DNA mit einem Spektralphotometer Microvolume zu quantifizieren.</li>
	<li>Sequenz das Plasmid DNA ausgiebig mit einem Sanger-Sequenzierung-Service (z. B. ein Kern oder kaufmännischen Facility). Bereiten Sie die DNA-Proben entsprechend dem Leistungsverzeichnis. Primer erfolgreich in vorherige Sequenzierung Reaktionen eingesetzt werden in Tabelle 4aufgeführt. Hinweis: Durch die PCR Verstärkung des gesamten Plasmids empfiehlt sich die Sequenzierung des gesamten PCSK9 kodierenden Region für jede Mutante.</li>
</ol>2. High-Throughput Luciferase-basierte Proteolyse Assay
<ol><li>
Zelle-Beschichtung (Tag 0)
	<ol>
<li>Niedrig-Passage HEK293T Zellen für Experimente und eine Kultur in Dulbecco den Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) geändert. Führen Sie alle Zelle arbeiten unter sterilen Bedingungen in einer Gewebekultur Haube erst unmittelbar vor die Luciferase-Aktivität zu bestimmen. Schätzen Sie die Anzahl von Brunnen und Platten benötigt für das Experiment, davon aus, dass Transfektionen soll, in dreifacher Ausfertigung für jede Bedingung getestet ausgeführt werden.</li>
		<li>Distanzieren Sie HEK293T Zellen aus einem übergeordneten Kolben, indem man sie mit einem minimalen Volumen von 0,05 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), um die Zellen zu decken. Inaktivieren die Trypsin-EDTA mit 2 Bände von DMEM mit 10 % FBS und Übertragung ergänzt die Zellen in ein steriles Röhrchen. Zählen der Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler (und Färbung mit Trypan blau). Zentrifugieren Sie das Rohr auf 500 X g für 5 min, um Zellen zu erholen.</li>
		<li>Aspirieren Sie Trypsin-haltigen Medium und rekonstruieren Sie die Zellen in das Kulturmedium zu einer Konzentration von 2 x 105 Zellen/mL. Mit einer Mehrkanal-Pipette übertragen Sie 100 µL der Zellen in jede Vertiefung ein weiß (opak-unten) 96-Well-Platte, verleiht eine Aussaat Endkonzentration von 2 x 104 Zellen/gut. Hinweis: Für erste Experimente kann es sinnvoll, zusätzlich Saatgut eine Schwester, Clear-unten 96-Well-Platte, um Zellwachstum und Einhaltung während des Protokolls und der Führer zukünftige Fehlerbehebung zu überwachen sein.</li>
		<li>Inkubation der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h.</li>
		<li>Bereiten Sie eine master Platte der Plasmide in eine 96-Well-Format. Verdünnen Sie jedes Plasmid im Elution Buffer (Tris-HCl, pH 8,5), 50 ng/µL in einem einzelnen Brunnen einer 96-Well-Platte.<ol>
<li>Vorbereiten der Positivkontrolle (WT) Plasmid8, negativ-Kontrolle (S386A) Plasmid8und Plasmid-freie Puffer (für mock Transfektionen) 4 Brunnen. Wenn Drogen oder andere Mobilfunk-basierten Behandlungen sind geplant, dann bereiten Sie die master Platte mit der Positivkontrolle (WT) Plasmid in jede Vertiefung, zusammen mit 4 Brunnen des Negativs kontrollieren Sie (S386A) Plasmid und Plasmid-freie Puffer.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfektion (Tag 1)
	<ol>
<li>Bereiten Sie die Transfektion Mischung in einem 96-Well-Plattenformat mit Tiefbohrungen 96-Well Platten. Führen Sie die Transfektionen in dreifacher Ausfertigung, dass auf jeden Fall genug Reagenzien zu pipettieren und Übertragung Verluste entfallen vorzubereiten. Hinweis: Die folgenden Berechnungen bereiten Sie genügend Reagenz eine 96-Well-Platte in dreifacher Ausfertigung (konservativ geschätzt für 420 Brunnen) ausgeführt.<ol>
<li>Machen Sie einen master-Mix einem verdünnten Lipid Transfection Reagens, 2050 µL Medium reduziert Serum 50.4 µL Reagenz hinzugefügt. Machen Sie einen master-Mix ein DNA Precomplexation Reagenz, Hinzufügen von 33,6 µL Reagenz in 1730 µL Medium reduziert-Serum.</li>
			<li>Mit Hilfe einer Mehrkanal-Pipette, aliquoten 16,8 µL der verdünnten DNA Precomplexation Reagenz Mischung in jede Vertiefung des Deep-Well-Platte.</li>
			<li>Mit einer Mehrkanal-Pipette, aliquoten 3,2 µL (160 ng) der einzelnen Plasmid von der master Platte in jede Vertiefung des Deep-Well-Platte.</li>
			<li>Mit einer Mehrkanal-Pipette, aliquoten 20 µL der verdünnten Lipid Transfection Reagens Mischung zu jedem gut der Platte und den Inhalt des jeweils gut mit der Mehrkanal-Pipette mischen. Deckplatten Sie die ab und lassen Sie sie bei Raumtemperatur (RT) sitzen für 10-15 min zum Form-Lipid: DNA-komplexe. Hinweis: Bei der Transfektion, die letzten Komponenten pro Bohrloch werden wie folgt: 40 ng von DNA, 0,12 µL Transfection Reagens und 0,08 µL DNA Pre-Komplexierung Reagenz und des Inhalts der einzelnen gut werden 10 µL Gesamtvolumen (reduzierte Serum-Mittel).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tauschen Sie sanft das Medium auf die 293T Zellen in der 96-Well-Platten mit einer Mehrkanal-Pipette, kümmert sich nicht um die Zellen zu stören. Ersetzen Sie die angesaugte Medium mit 95 µL DMEM mit 10 % ergänzt FBS. Hinweis: Dies wäre der richtige Zeitpunkt für die Zellen bei jedem Medikament von Interesse zu behandeln.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL der Transfektion Mischung zu jedem entsprechenden gut über einer Mehrkanal-Pipette. Vorsichtig schwenken die Platte, um den Inhalt in den Vertiefungen mischen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 24 h. Hinweis: Der letzte Band der Brunnen kommt zu 105 µL, um Verdunstung über 24 h zu berücksichtigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Assay (Tag 2)
	<ol>
<li>Coelenterazine Reagenzien eine Stammlösung vorbereiten: 3 M Natrium Ascorbat [aufgelöst in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), frisch zubereitet] 5 M NaCl, 10 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA, aufgelöst in PBS, frisch zubereitet) und 2 mM Coelenterazine (aufgelöst gesäuerte Methanol mit 200 µL 3 N HCl pro 10 mL). Hinweis: Die 2 mM Coelenterazine kann für 2 Wochen gespeichert werden, wenn es bei-80 ° C und in der Abwesenheit von Licht gehalten wird.</li>
		<li>Das Luciferase auslesen, mit einem separaten Reagenz für die Zellen und Medium, 2 X coelenterazine Reagenzien gemäß Tabelle 5vorbereiten. Mischen Sie zuerst alle Reagenzien speichern die Coelenterazine, Filtern Sie das Gemisch durch einen 0,22-µm-Spritze-Filter und fügen Sie dann die Coelenterazine. Schützen Sie die Reagenzien vor Licht, bis sie bereit sind, die Platten hinzugefügt werden soll. Hinweis: Durch den Verlust der Lösung von Filtration stellen Sie genügend Reagenz, für den Verlust von Filtration sowie Transfers zu berücksichtigen. Tabelle 5 zeigt die Endkonzentration von 2 X Reagenzien (sowie die Menge der Stammlösung hinzufügen, um eine 96-Well-Platte mit einem Reagenz auslesen).</li>
		<li>Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator 24 h nach der Transfektion. Mit einer Mehrkanal-Pipette, 50 µL des konditionierten Mediums aus jedem Brunnen auf einen frischen, weißen Boden (undurchsichtig) 96-Well-Platte übertragen.<ol>
<li>Beschriften Sie die Platten, ob sie Mittel "oder" Zellen enthalten. Wenn mehr als eine 96-Well-Platte transfiziert war, beschriften Sie die Platten um sicherzustellen, dass jedes Medium-haltigen Platte mit seiner übergeordneten Platte von Zellen verbunden ist.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fügen Sie mithilfe einer Mehrkanal-Pipette 50 µL 2 x nicht-lytische Coelenterazine Reagenz auf die Platte, die nur bedingt Medium enthält. Sanft Schaukeln Sie oder schütteln Sie die Platte in die Abwesenheit von Licht für 5-10 min bei RT</li>
		<li>Fügen Sie mithilfe einer Mehrkanal-Pipette 50 µL 2 X lytische Coelenterazine Reagenz auf die Platte, die die Zellen enthalten. Sanft Schaukeln Sie oder schütteln Sie die Platte in die Abwesenheit von Licht für 5-10 min bei RT</li>
		<li>Nach der Inkubation der Lumineszenz der Medium nur Platte in einem Teller Reader ausgelesen. Dann lesen Sie die Lumineszenz der Zelle-haltigen Platte in der gleichen Platte Leser.</li>
		<li>Entsorgen Sie die Platten und speichern Sie die Dateien für die Datenanalyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Datenanalyse
<ol><li>Eine erste Datenanalyse mit Tabellenkalkulations-Software. Erstellen Sie eine Tabelle mit den Ergebnissen aus der Zelle und die mittlere Platten.</li>
	<li>Manuell überprüfen Sie die Daten aus den Zellplatten, schlecht transfizierte Brunnen zu identifizieren. Wells, die zeigen, &lt; 5 % - 10 % für das Auslesen des Plasmids Negativkontrolle (S386A) betrachtet werden als schlecht transfiziert, wodurch die Interpretation dieser Daten verdächtigen.</li>
	<li>Berechnen Sie die durchschnittliche Hintergrund Lumineszenz von jeder Platte aus den Mock-transfizierten Brunnen. Subtrahieren Sie den Hintergrund jeder Platte von den Werten dieser Platte. Hinweis: Dieser Wert kann je nach der Platte-Leser verwendet vernachlässigbar.</li>
	<li>Die Daten durch die Berechnung des Anteils der Luciferase-Aktivität in das Medium im Vergleich zu der Luciferase Gesamtaktivität für jedes gut verarbeiten. Da der Zellplatte sowohl konditionierten Medium neben Zellen enthält und die Medium nur Platte die gleiche Menge an konditionierten Medium als Zellplatte enthält, empfiehlt es sich, verwenden Sie die folgende Gleichung: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq1.jpg"> Hier, RLU = relative Lumineszenz Einheiten, das Hintergrund subtrahiert Auslesen aus dem Teller-Leser.</li>
	<li>Berechnen Sie die mittlere sekretierten Luciferase der Positivkontrolle (WT) und die negativ-Kontrolle (S386A) Brunnen.</li>
	<li>Bewerten Sie die Gesamtqualität des Experiments durch die Berechnung einer Z-Faktor13: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq2.jpg"> Hinweis: Die aktiven Werte stammen aus der Positivkontrolle (WT) und die inaktive Werte stammen aus der negativ-Kontrolle (S386A) Brunnen. Werte näher zu 1 zeigen eine höhere Qualität der experimentellen. Betrachten Sie das Experiment zu wiederholen oder den Workflow zu optimieren, wenn der Wert kleiner als 0 ist.</li>
	<li>Übertragen Sie die Daten aus der Tabellenkalkulation in wissenschaftliche Datenanalyse-Software.</li>
	<li>Normalisieren Sie die sekretierten Luciferase Aktivität auf die Mittelwerte der Positivkontrolle (WT) und der negativen Kontrolle (S386A), die positive Kontrolle als 1 und der negativen Kontrolle als 0 festlegen.</li>
	<li>Bereinigen Sie die Daten für Ausreißer mit der Regression und Ausreißer entfernen (Flucht)-Methode, wenn die maximale false Discovery Rate auf 1 %.</li>
	<li>Bewertung für statistisch signifikante Unterschiede durch Vergleich der Daten für jeden mutierten Zustand (oder Mutant) zum Mittelwert der WT-Aktivität (normiert auf den Wert 1). Führen Sie mehrere ungepaarte t-Tests, Korrektur für multiple Vergleiche mit dem Holm-Sidak Methode und α = 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+low+density+lipoprotein+receptor+protein+by+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9a+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).</li>
<li>Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variations+in+PCSK9%2C+low+LDL%2C+and+protection+against+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease.</a> New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).</li>
<li>Ridker, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+Efficacy+and+Safety+of+Bococizumab+in+High-Risk+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients.</a> New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).</li>
<li>Sabatine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolocumab+and+Clinical+Outcomes+in+Patients+with+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease.</a> New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).</li>
<li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effectiveness+of+PCSK9+Inhibitor+Therapy+in+Patients+With+Heterozygous+Familial+Hypercholesterolemia+or+Atherosclerotic+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).</li>
<li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+Cost-effectiveness+Analysis+of+PCSK9+Inhibitors+Based+on+the+Results+of+the+FOURIER+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial.</a> Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).</li>
<li>Pettersen, D., Fjellström, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulators+of+PCSK9+-+A+literature+and+patent+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).</li>
<li>Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+processing+analyses+of+the+single-turnover+PCSK9+protease+reveal+its+substrate+sequence+specificity+and+link+clinical+genotype+to+lipid+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).</li>
<li>Maxwell, K. N., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+expression+of+Pcsk9+in+mice+results+in+a+low-density+lipoprotein+receptor+knockout+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).</li>
<li>Benjannet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NARC-1%2FPCSK9+and+its+natural+mutants%3A+zymogen+cleavage+and+effects+on+the+low+density+lipoprotein+%28LDL%29+receptor+and+LDL+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).</li>
<li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biophysical+studies+of+PCSK9+and+its+mutants+linked+to+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8, 91(2008).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+activity+is+not+required+for+secreted+PCSK9+to+reduce+low+density+lipoprotein+receptors+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).</li>
<li>Chorba, J. S., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9+%28PCSK9%29+active+site+and+cleavage+sequence+differentially+regulate+protein+secretion+from+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).</li>
<li>Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+%28PC%29+PCSK9+is+inactivated+by+furin+and%2For+PC5%2F6A%3A+functional+consequences+of+natural+mutations+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+loss-of-function+mutations+in+PCSK9+and+identification+of+a+compound+heterozygote%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote.</a> American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die oben beschriebenen Versuchsverfahren präsentieren eine Methode zum überwinden der intrinsisch niedrigen Aktivität der einzelnen Umsatz Protease PCSK9 und seine proteolytische Funktion in einer robusten Weise zu bewerten. Der Schlüsselbegriff des Assays stützt sich auf ein Single-Umsatz-Ereignis in einer enzymatisch verstärkte Auslesen umzuwandeln. Die Stärken des Assays gehören die relativ kurzen Zeitrahmen und Benutzerfreundlichkeit der Luciferase Reporter, als auch die Skalierbarkeit für Hochdurchsatz-Ansätze. Darü...

PCSK9 richtet den LDL-Rezeptor (LDL-R) für den Abbau, Erhöhung von LDL-Cholesterin (LDL-C) und fahren atherosklerotische Herzkrankheit1,2. Therapeutika targeting PCSK9 robust niedrigere LDL-C und Verbesserung der Herz-Kreislauf-Ergebnisse für Patienten, auch wenn eine aggressive lipidsenkenden Therapie mit Statinen3,4hinzugefügt. Derzeit zugelassene Therapien beschränken sich auf Antikörper-basierte Ansätze, und leiden unter mangelnder Wirtschaftlichkeit5,6. Um dieses Problem zu lösen, sind weniger kostspielig therapeutischen Alternativen, ein Mittel zur Identifizierung von Patienten wahrscheinlich größere Vorteile zu erlangen oder beides erforderlich.
Klein-Molekül Ansätze könnten gezielt intrazellulären PCSK9, bieten eine verbesserte Art der Verabreichung und Kosten reduzieren, so dass sie den "Heiligen Gral" in diesem Bereich7. Allerdings ist durch kleine Moleküle PCSK9 schwierig, Drogen nachgewiesen. Als eine Protease ist Ausrichtung PCSK9s proteolytischen Funktion eine attraktive Strategie, wie selbst-Proteolyse der Rate-Begrenzung von PCSK9 Reifung8 ist und für seine maximale Wirkung auf LDL-R9erforderlich ist. Bislang jedoch diese Strategie hat nicht erfolgreich gewesen, wahrscheinlich aufgrund PCSK9s einzigartige Biochemie: PCSK9 spaltet nur selbst10, Durchführung einer Einzel-Umsatz-Reaktion und nach selbst-Spaltung, die PCSK9 prodomain bleibt im aktiven Zentrum als eine Auto-Inhibitor11, verhindert das Auslesen der jede weitere Protease-Aktivität.
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Evaluierung PCSK9 proteolytischen Funktion im Hochdurchsatz-Mode8. Durch Site-verwiesene Mutagenese können Ermittler dieser Assay untersuchen die Auswirkungen der Codierung SNPs gefunden in der Klinik, um sie für Auswirkungen auf Proteolyse, die Bandbreitenbegrenzung Schritt des PCSK9 Reifung zu bewerten. Darüber hinaus werden diese Methode nützlich bei der Gestaltung von Hochdurchsatz-Bildschirmen Modulatoren des PCSK9 Proteolyse zu identifizieren, die voraussichtlich letzten Endes stören die Präsentation des PCSK9 auf die LDL-R (und modulieren PCSK9s normalem Effekt) . Zu guter Letzt kann dieses Protokoll andere Proteasen mit intrinsisch geringer Aktivität angepasst werden, vorausgesetzt, dass (i) ein paar spezifische Substrat-Protease gefunden werden kann, und (Ii) ein geeigneter intrazellulärer Anker für das Substrat hergestellt werden kann.

<table><tbody><tr><td>PCR-Röhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>für PCR</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start</td><td>New England Biolabs</td><td>M0493L</td><td>High-Fidelity DNA-Polymerase</td></tr><tr><td>Desoxynukleotid Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>dNTPs (für PCR)</td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT</td><td>Autoren</td><td>n/a</td><td>Verfügbar von Autoren</td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A</td><td>Autoren</td><td>n/a</td><td>Verfügbar von den Autoren</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-201-100</td><td>Für DNA-Gele</td></tr><tr><td>E-Gel Imager System mit Blaulichtbasis</td><td>ThermoFisher Scientific</td> 4466612 <td>Für die Bildgebung von DNA-Gelen</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td>Für DNA-Gele</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Für DNA-Gel-Laufpuffer</td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>Für DNA-Gel-Laufpuffer</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäurelösung</td><td>Millipore Sigma</td><td>3690</td><td>EDTA, für DNA-Gel-Laufpuffer</td></tr><tr><td>1 kb DNA-Leiter</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>D010</td><td>DNA-Leiter</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>LB Agar Platten mit 100 & Mikro; g/mL Carbenicillin</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td>LB-Carb Platten</td></tr><tr><td>One Shot Mach1 T Phagenresistent Chemisch kompetent E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C862003</td><td>Chemisch kompetente Zellen</td></tr><tr><td>LB Brühe, Miller</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>LB</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>C-103-5</td><td>Selektives Antibiotikum</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td><td>Omega BioTek</td><td>D6942-02</td><td>DNA-Aufreinigung Miniprep Kit</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektralphotomer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spektralphotometer</td></tr><tr><td>293T Zellen</td><td>American Tissue Culture Collection (ATCC)</td><td>CRL-3216</td><td>HEK 293T Zellen</td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11995065</td><td>DMEM, Säugetierzelle Medien</td></tr><tr><td>Fötale Rinderseren</td><td>Axenia Biologix</td><td>F001</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300062</td><td>Trypsin, für die Zelldissoziation</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific 10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Countess automatisierter Zellzähler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td>Automatisierte Zellzählung</td></tr><tr><td>Countess Kammer Objektträger für die Zellzählung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td>Objektträger für die Zellzählung</td></tr><tr><td>CELLSTAR Gewebekulturplatten, weiß, mit weißem Boden, mit Deckel</td><td>Grenier Bio-One 655083</td><td></td><td>Weiß, 96-Well-Platte mit weißem Boden</td></tr><tr><td>TempPlate 96-Well-PCR-Platte ohne Rand, natur</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9596</td><td>96-Well-Platte für Master-Plasmidplatte</td></tr><tr><td>Nunc 2,0 mL DeepWell Platten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>278743</td><td>96-Well-Deep-Well-Platte</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td><td>Reagenz für die Lipidtransfektion, Lf3K</td></tr><tr><td>P3000 Reagenz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td><td>Reagenz für die DNA-Präkomplexierung, bereitgestellt mit Lf3K</td></tr><tr><td>OptiMEM I Reduced Serum</td><td>Medium ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Reduced Serum Medium zur Transfektion</td></tr><tr><td>(+)-Natrium-L-Ascorbat</td><td>Millipore Sigma</td><td>A4034</td><td>Natriumascorbat</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Albumin, Rinderserum, Fraktion V, Niedrige Schwermetalle</td><td>Millipore Sigma</td><td>12659</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Methanol (HPLC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4524</td><td>MeOH</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>VWR</td><td>JT9535-2</td><td>Konzentrierter</td>HCl-Coelenterazin-Gold-Biotechnologie-Spritzenfilter</tr><tr><td></td><td></td><td>CZ2.5</td><td>Luciferase-Substrat</td></tr><tr><td>, steril</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-720-3</td><td>Sterilfilter, PVDF, 0,22 & Mikro; m pore</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013810</td><td>Mehrkanalpipette</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013808</td><td>Mehrkanalpipette</td></tr><tr><td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013807</td><td>Mehrkanalpipette</td></tr><tr><td>Reagenzreservoir</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>Rinne für Reagenzien</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen, 15 mL</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific 05-539-12</td><td>15 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen, 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>Spark Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td>N/a</td><td>Plate Reader</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>2016 für Mac</td><td>Tabellenkalkulationssoftware</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>v7</td><td>Scientific Datenanalysesoftware</td></tr></tbody></table>

ein high-throughput luciferase assay proteolyse von single-umsatz protease pcsk9 bewerten

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein Konvertase Subtilisin/Kexin Typ 9 (PCSK9) ist ein Single-Umsatz-Protease die Serumspiegel Low density Lipoprotein (LDL) regelt und damit Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Obwohl PCSK9 Proteolyse für seine volle normalem Wirkung erforderlich ist, die Bewertung ihrer proteolytischen Funktion ist anspruchsvoll: PCSK9 ist nur bekannt, sich Spalten, erfährt nur einen einzigen Umsatz und nach Proteolyse, behält seine Substrat in seiner aktiven Seite als ein Auto-Inhibitor. Die hier vorgestellten Methoden beschreiben eine Probe, die diese Herausforderungen überwindet. Der Test konzentriert sich auf intermolekularen Proteolyse in einem Zell-basierte Kontext und Links erfolgreiche Spaltung die sekretierten Luciferase-Aktivität, die leicht im konditionierten Medium gelesen werden können. Über aufeinander folgenden Schritten Mutagenese, Transiente Transfektion und eine Luciferase auslesen, kann der Test PCSK9 Proteolyse unter Bedingungen von genetischen oder Molekulare Störung in gewissem Sinne Hochdurchsatz-Sonde. Dieses System eignet sich gut für beide die biochemische Auswertung der klinisch entdeckte Missense Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), als auch für das Screening von kleinen Molekül-Inhibitoren des PCSK9 Proteolyse.

Hochdurchsatz-Proteolyse Assay stützt sich auf drei große Herausforderungen zu überwinden. Erstens ist zur Überwindung der intrinsisch geringen Leistung eines Single-Umsatz PCSK9 Protease, ein PCSK9 Protease fehlt die hemmenden prodomain mit der Spaltung Sequenz am Ende der prodomain verwendet, verbunden mit einer Luciferase, die sekretierten14sein können. Zweitens coexpressed zu der Notwendigkeit der Protease zu Falten Komplex mit seinen hemmenden prodomain, zwei ...

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Evaluierung der proteolytischen Aktivität eine intrinsisch Niedrige Aktivität, einzelne Umsatz Protease in einem zellulären Kontext. Insbesondere wird diese Methode angewendet, um die proteolytische Aktivität des PCSK9, ein wesentlicher Bestandteil des Fettstoffwechsels zu bewerten, deren proteolytische Aktivität für ihre ultimative normalem Funktion erforderlich ist.

Ein High-Throughput Luciferase Assay Proteolyse von Single-Umsatz Protease PCSK9 bewerten

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der PCSK9-Biochemie zu beantworten, z. B. welche Medikamente oder genetischen Veränderungen die proteolytische Funktion von PCSK9 beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein schnelles und amplifizierbares Auslesen eines intrinsisch niederfrequenten biochemischen Ereignisses ermöglicht. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die atherosklerotische Herzkrankheit, da die proteolytische Funktion von PCSK9 für ihre endgültige Wirkung auf den Serumcholesterinspiegel erforderlich ist.Obwohl diese Methode Einblicke in PCSK9 selbst geben kann, kann sie auch auf andere biochemische Systeme wie andere Proteasen mit intrinsisch geringer proteolytischer Aktivität angewendet werden. Zu Beginn aspirieren Sie Medium aus jeder HEK293 T-Zelle. Mit PBS waschen und mit einem minimalen Volumen von 0,5 % Trypsin-EDTA behandeln.Und inkubieren Sie zwei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen vom Mutterkolben zu trennen. Fügen Sie zwei Volumen DMEM hinzu, die mit 10 % FBS ergänzt sind, um das Trypsin-EDTA zu inaktivieren. Dann pipettieren Sie die Flüssigkeit im Kolben mehrmals auf und ab, löse

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Das Video zeigt den Luciferase-Assay, der zur Quantifizierung von Luciferase-markierten Proteinen verwendet wird. Der Assay verwendet ein künstlich hergestelltes Luciferase-Enzym, das aus einem großen Fragment besteht, das an das kleine Fragment bindet, das mit einem Protein von Interesse konjugiert ist. Die gebundenen Untereinheiten bilden ein aktives Enzym, das in Gegenwart des Substrats ein Lumineszenzsignal freisetzt. Dieses Signal wird dann mit einem Luminometer quantifiziert.

Der Luciferase-Assay: Ein Hochdurchsatz-Assay zur Messung von Lumineszenzsignalen mit Hilfe von Bioreportern auf Basis von Nanoluziferase-Systemen

Dieses Video zeigt einen Assay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen mit fluorogenen Peptiden. Die Protease erkennt ihre Spaltstelle auf dem Peptid, spaltet es und trennt den Quencher vom Fluorophor, wodurch seine Fluoreszenzemission ermöglicht wird. Das Fluoreszenzsignal wird detektiert und analysiert, um die Spaltungseffizienz verschiedener Peptidvarianten zu überprüfen.

Ein fluorogener Peptidspaltungsassay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Messung der γ-Sekretase-Aktivität in genetisch veränderten menschlichen Zellen mit Hilfe eines Tetracyclin-induzierbaren Systems. Der Prozess umfasst die Induktion der APP-Genexpression mit Tetracyclin, die Erzeugung von Amyloid-β-Peptiden und die Aktivierung der Luciferase-Produktion. Anschließend wird die aus der Luciferase-Substrat-Reaktion resultierende Biolumineszenz gemessen, die die Aktivität der γ-Sekretase widerspiegelt.

Luciferase-Assay zur Messung der γ-Sekretase-Aktivität in menschlichen Zellen

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

Das Erreichen einer Systemebene Verständnis zellulärer Prozesse ist ein Ziel der modernen Zellbiologie. Wir beschreiben hier Strategien zum Multiplexen Luciferase Reporter von verschiedenen zellulären Funktion Endpunkte zur Genfunktion mit genomweiten RNAi-Bibliotheken zu verhören.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Dieser Bericht beschreibt Protokolle zur Messung der Abbauraten von fehlgefalteten Proteinen entweder durch Western Blot oder fluoreszenzbasierte Assays. Die Methoden können für die Analyse anderer fehlgefalteter Proteine und für das Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden.

Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​in Zellen

Wir haben erfolgreich zwei Substrat-spezifische γ-Sekretase Assays generiert. Beiden zellbasierte Assays, die hier vorgestellten sollen γ-Sekretase enzymatischen Aktivitäten über den Ausgang des Firefly Luciferase Reporter zu quantifizieren.

Quantitative Messung der γ-Sekretase-vermittelten Amyloid-Precursor-Protein und Notch Spaltung in zellbasierten Luciferase Reporter Assay Plattformen

Hier präsentieren wir Ihnen eine Luciferase-basierten Biosensor zur Quantifizierung der Kinase-Aktivität von großen Tumorsuppressor (LATS)-einer zentralen Kinase in den Signalweg Hippo. Diese Biosensor hat vielfältige Anwendungen in Grundlagen- und Translationale Forschung zur Hippo Weg Regulierungsbehörden in Vitro und in Vivozu untersuchen.

Überwachung von Hippo Signalisierung Pathway-Aktivität unter Verwendung eines Biosensors Luciferase-basierte großen Tumorsuppressor (LATS)

Hier präsentieren wir Ihnen die Einzelheiten des Verfahrens einer neu entwickelten Protease Assays Plattform nutzen N-terminalen Hexahistidine/Maltose-bindendes Protein und fluoreszierende Protein fusioniert rekombinante Substrate an der Oberfläche der Nickel-Nitrilotriacetic befestigt saure magnetische Agarose Korne. Eine anschließende Gelanalyse der Assay-Proben durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt wird ebenfalls dargestellt.

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Wir haben einen Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay etabliert, um die Kontakte zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen zu überwachen. Mit diesem Assay beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Messung des Ausmaßes dieser Interorganellenkopplungen in HEK293T Zellen unter den Bedingungen einer chemischen Behandlung.

Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay zur Messung von Kontakten zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen

Lernen Sie einen High-Throughput-Luciferase-Assay zur Bewertung der Proteolyseaktivität von PCSK9 in HEK293 T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Analyse niedrigfrequenter biochemischer Ereignisse und liefert wertvolle Erkenntnisse für die Lipidstoffwechselforschung.

Ein High-Throughput Luciferase Assay Proteolyse von Single-Umsatz Protease PCSK9 bewerten

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