Ein High-Throughput Luciferase Assay Proteolyse von Single-Umsatz Protease PCSK9 bewerten
28. August 2018
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Evaluierung der proteolytischen Aktivität eine intrinsisch Niedrige Aktivität, einzelne Umsatz Protease in einem zellulären Kontext. Insbesondere wird diese Methode angewendet, um die proteolytische Aktivität des PCSK9, ein wesentlicher Bestandteil des Fettstoffwechsels zu bewerten, deren proteolytische Aktivität für ihre ultimative normalem Funktion erforderlich ist.
Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der PCSK9-Biochemie zu beantworten, z. B. welche Medikamente oder genetischen Veränderungen die proteolytische Funktion von PCSK9 beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein schnelles und amplifizierbares Auslesen eines intrinsisch niederfrequenten biochemischen Ereignisses ermöglicht. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die atherosklerotische Herzkrankheit, da die proteolytische Funktion von PCSK9 für ihre endgültige Wirkung auf den Serumcholesterinspiegel erforderlich ist.
Obwohl diese Methode Einblicke in PCSK9 selbst geben kann, kann sie auch auf andere biochemische Systeme wie andere Proteasen mit intrinsisch geringer proteolytischer Aktivität angewendet werden. Zu Beginn aspirieren Sie Medium aus jeder HEK293 T-Zelle. Mit PBS waschen und mit einem minimalen Volumen von 0,5 % Trypsin-EDTA behandeln.
Und inkubieren Sie zwei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen vom Mutterkolben zu trennen. Fügen Sie zwei Volumen DMEM hinzu, die mit 10 % FBS ergänzt sind, um das Trypsin-EDTA zu inaktivieren. Dann pipettieren Sie die Flüssigkeit im Kolben mehrmals auf und ab, lösen die anhaftenden Zellen und überführen die Zellen in ein steriles Röhrchen.
Entfernen Sie als Nächstes ein kleines Aliquot von Zellen. Färben Sie mit dem gleichen Volumen Trypanblau und übertragen Sie die gefärbten Zellen auf einen Objektträger und verwenden Sie einen automatischen Zellzähler, um die Zellen zu zählen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 500 mal G, um die Zellen zu gewinnen.
Danach aspirieren Sie das Medium und rekonstituieren die Zellen und das Kulturmedium auf die gewünschte Konzentration. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette und einem sterilen Trog 100 Mikrometer der Zellen in jeder Vertiefung auf eine weiße 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen anschließend 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.
Bereiten Sie dann die Plasmidplatte auf die gewünschte Konzentration für die Transfektion vor, einschließlich jeweils vier Vertiefungen für das Positivkontrollplasmid, das Negativkontrollplasmid und den plasmidfreien Puffer. Bereiten Sie zunächst einen Mastermix aus verdünntem Lipidtransfektionsreagenz und einen Mastermix aus DNA-Präkomplexierungsreagenz vor. Anschließend aliquotieren Sie mit einer Mehrkanalpipette und einem sterilen Trog 16,8 Mikroliter des verdünnten DNA-Präkomplexierungsreagenzes in jede Vertiefung einer Deep-Well-Platte.
Verwenden Sie danach die Mehrkanalpipette, um 3,2 Mikroliter jedes Plasmids von der Master-Platte in jede Vertiefung der Deep-Well-Platte zu übertragen. Verwenden Sie dann die Pipette, um 20 Mikroliter der verdünnten Lipidtransfektionsreagenzmischung in jede Vertiefung der Platte zu geben und gründlich zu mischen. Decken Sie die Platten ab und lassen Sie sie 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur ruhen, um Lipid-DNA-Komplexe zu bilden.
Verwenden Sie anschließend die Mehrkanalpipette, um das Medium vorsichtig von den 293 T-Zellen in der 96-Well-Platte zu entfernen. Ersetzen Sie dann das Medium durch 95 Mikroliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS. Verwenden Sie anschließend die Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter der Transfektionsmischung in jede geeignete Vertiefung zu geben.
Als nächstes inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Bereiten Sie zunächst die Stammlösungen vor, die zur Herstellung des Coelenterazin-Assay-Reagenzes mit doppelter Stärke erforderlich sind, einschließlich drei molaren Natriumascorbats in PBS, fünf molaren Natriumchlorid in destilliertem Wasser, 10 Milligramm pro Milliliter BSA in PBS und zwei Millimolare Coelenterazin in angesäuertem Methanol. Bereiten Sie als Nächstes ausreichend Coelenterazin-Reagenzien für die Luziferase-Anzeige vor.
Mit je einem separaten Reagenz für die Zellen im Medium. Mischen Sie dann alle Reagenzien, die für das Coelenterazin erwartet werden. Filtrieren Sie die Mischung durch einen 0,22-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter.
Und dann nach der Filtration das Coelenterazin hinzufügen. Entnehmen Sie die Zellen 24 Stunden nach der Transfektion aus dem Inkubator. Verwenden Sie dann die Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter konditioniertes Medium aus jeder Vertiefung auf eine frische weiße 96-Well-Platte zu übertragen.
Verwenden Sie die Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter doppelt festes, nicht-lytisches Coelenterazin-Reagenz auf die Platte zu geben, die nur konditioniertes Medium enthält. Schütteln Sie den Teller dann vorsichtig im Dunkeln für fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie dann diesen Schritt, indem Sie das Double-Strength Lytic Coelenterazine Reagenz auf die Platte mit den Zellen geben.
Messen Sie nach den Inkubationen die Lumineszenz der Nur-Medium-Platte und der Zell-haltigen Platte in einem Platten-Reader. Entsorgen Sie abschließend die Platten und speichern Sie die Dateien für die weitere Datenanalyse. Es ist wichtig, das Luciferase-Reagenz mit der reinen Mediumplatte und der zellhaltigen Platte für die gleiche Zeit zu inkubieren, da die Daten für diese Platten direkt verglichen werden.
In diesem Protokoll wurde die Spezifität der Spaltsequenz der PCSK9-Protease an den Substratstellen P6 bis P6 Prime mit einem Luciferase-Assay bewertet. Die Veränderungen in der Spaltsequenz an den Positionen P6 und P4 bis P1 Prime werden von der Protease schlecht toleriert. Die Positionen P5 und P2 Prime bis P6 Prime sind jedoch flexibler zu ändern.
Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass die optimalen Spaltungssequenzen im Wesentlichen mit denen der Wild-Typ-Sequenz identisch sind. Die relative Spaltungsaktivität einer Bibliothek von Fehlschnitten, die in der Klinik gefunden wurden, wurde mit der Protease vom Wildtyp verglichen. Von den 84 ausgewerteten Snips zeigten mehr als die Hälfte signifikante Veränderungen der Aktivität im Vergleich zur Wildtyp-Protease, was darauf hindeutet, dass Veränderungen der Proteaseaktivität in der klinischen Population häufig beobachtet werden.
Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. Durchflusszytometrie oder Cholesterinaufnahme-Assays in Hepatozyten, durchgeführt werden, um Veränderungen der proteolytischen Fähigkeit von PCSK9 auf die Wirkung von PCSK9 auf den LDL-Rezeptor zu bewerten.
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Übersicht
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der proteolytischen Aktivität von PCSK9, einem zentralen Regulator des Lipidstoffwechsels, vor. Die Technik ermöglicht eine schnelle Erfassung seltener biochemischer Ereignisse, was entscheidend für das Verständnis der Rolle von PCSK9 bei der Hypercholesterinämie ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biochemie
- Proteolytische Enzymologie
- Lipidstoffwechsel
Hintergrund
- PCSK9 ist entscheidend für die Regulierung der Cholesterinwerte im Serum.
- Das Verständnis seiner proteolytischen Funktion kann die Arzneimittelentwicklung voranbringen.
- Die Methode kann auch auf andere Proteasen mit geringer Aktivität angewendet werden.
- Diese Forschung hat Auswirkungen auf die atherosklerotische Herzerkrankung.
Zweck der Studie
- Um die proteolytische Aktivität von PCSK9 in einem zellulären Kontext zu bewerten.
- Um die Auswirkungen von Arzneimitteln oder genetischen Veränderungen auf die Funktion von PCSK9 zu bestimmen.
- Um Erkenntnisse bereitzustellen, die auf andere biochemische Systeme übertragbar sind.
Verwendete Methoden
- Entfernen Sie das Medium von HEK293-T-Zellen.
- Waschen Sie die Zellen mit PBS.
- Behandeln Sie die Zellen mit 0,5 % Trypsin-EDTA.
- Verwenden Sie eine Methode, die amplifizierbare Signale der proteolytischen Aktivität ermöglicht.
Hauptergebnisse
- Die Methode bewertet erfolgreich proteolytische Ereignisse mit niedriger Frequenz.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können therapeutische Strategien zur Cholesterinregulierung beeinflussen.
- Mögliche Anwendungen erstrecken sich auf andere Proteasen.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik verbessert das Verständnis der Rolle von PCSK9 im Lipidstoffwechsel.
- Sie bietet einen Rahmen für die Untersuchung anderer Proteasen mit geringer Aktivität.
- Die Ergebnisse könnten zur Weiterentwicklung der Behandlung von atherosklerotischer Herzerkrankung beitragen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Bewertung der proteolytischen Funktion von Einzelumsatz-Proteasen wie PCSK9 ist entscheidend für die Zielvalidierung in der kardiovaskulären Wirkstoffforschung. Dieser Test ermöglicht die hochdurchsatzfähige Untersuchung genetischer und pharmakologischer Störungen und unterstützt die mechanistische Entschärfung von Risiken sowie ein vorhersagbares Vertrauen bei der Identifizierung von Leitstrukturen. Er verbindet den biochemischen Mechanismus mit dem phänotypischen Ergebnis, indem er die Proteaseaktivität mit einem nachweisbaren, sekretierten Luciferase-Signal verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem untersucht wird, wie genetische Varianten oder Verbindungen die proteolytische Funktion von PCSK9 beeinflussen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht eine schnelle, vervielfachbare Detektion seltener biochemischer Ereignisse in einem zellulären Kontext.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Bewertung klinischer Missense-SNPs und der Wirksamkeit von Inhibitoren zur Priorisierung von Wirkstoffkandidaten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Verknüpft intermolekulare Proteolyse mit der Aktivität sekretierter Luciferase für eine quantitative, homogene Detektion.
- Operationaler Wert: Kompatibel mit dem 96-Loch-Format, wodurch die Untersuchung von Mutantenbibliotheken oder Sammlungen kleiner Moleküle ermöglicht wird.
- Bereitschaft des Assays: Verwendet konditioniertes Medium für eine nicht-lytische Messung, wodurch die Variabilität verringert und eine kinetische Profilierung ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die proteolytische Aktivität in vitro mit nachgeschalteten Effekten auf den LDL-Rezeptor und die Cholesterinaufnahme in Hepatozyten.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Klärt Struktur-Funktions-Beziehungen und zeigt, an welchen Substratpositionen Mutationen für das Design von Inhibitoren toleriert werden.
- Vorhersagegenauigkeit: Zeigt, dass mehr als die Hälfte der klinischen SNPs die Aktivität verändert, und unterstützt so die Interpretation von Varianten bei der Patientenstratifizierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test eignet sich für die frühe Entdeckungsphase, um die Zielmodulation zu bewerten, bevor man zu zellulären oder phänotypischen Assays übergeht, und schafft so eine mechanistische Verbindung zwischen Zielinteraktion und funktioneller Konsequenz.
- Entdeckungsbiochemie: Untersucht, wie Störungen die Proteasefunktion beeinflussen, und unterstützt die hypothesengetriebene Zielvalidierung.
- Screening: Ermöglicht die Hochdurchsatzbewertung genetischer Varianten oder Verbindungen unter Verwendung der Luciferase-Sekretion als Surrogat für proteolytische Spaltung.
- Analytik: Erzeugt quantitative Lumineszenzsignale aus konditioniertem Medium und ermöglicht Vergleiche zwischen verschiedenen Bedingungen sowie die Normalisierung auf die Zellzahl.
- Translationale Forschung: Leitet Folgeassays wie die Cholesterinaufnahme in Hepatozyten ein, um die physiologische Relevanz proteolytischer Veränderungen zu bewerten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Anpassbar an andere Proteasen mit geringer Aktivität und damit als Plattform für die Validierung proteolytischer Zielstrukturen in verschiedenen therapeutischen Bereichen nutzbar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem die proteolytische Funktion in einem physiologisch relevanten Kontext direkt gemessen wird.
- Operationaler Wert: Standardisierter, reproduzierbarer Workflow mit geringem manuellem Arbeitsaufwand und skalierbarer Detektion mittels Mikroplattenreader.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem die Modulation des Zielmoleküls mit dem biochemischen Wirkmechanismus verknüpft wird, wodurch das Risiko von Fehlschlägen in späteren Entwicklungsstadien verringert wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von PCSK9-gerichteten Therapeutika basierend auf ihrer proteolytischen Wirksamkeit.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultivierung von Säugerzellen, der transienten Transfektion und Assays auf Basis von Luciferase.
- Benötigt einen Plattenreader mit Lumineszenzdetektion sowie die Optimierung der Transfektionseffizienz in HEK293-T-Zellen.
- Erfordert die Standardisierung der Handhabung von konditioniertem Medium und der Inkubationszeiten der Reagenzien, um genaue Vergleiche zwischen lytischen und nicht-lytischen Signalen zu ermöglichen.
- Die Anpassung auf andere Proteasen erfordert eine Neugestaltung des Substrats und die Validierung der Kopplung des Luciferase-Reporters an das Spaltereignis.
- Auf Proteasen beschränkt, bei denen die Spaltung mit der Sekretion von Luciferase verknüpft werden kann; ohne Modifikation nicht geeignet für intrazelluläre oder Mehrfachumsatz-Proteasen.
