Name: Eine wirksame Strategie zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila von Genom-Bearbeitung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie CRISPR/Cas9-basierte Genomeditierung zur Erzeugung gewebespezifischer binärer Transkriptionssysteme in Drosophila verwendet wird. Diese Methode ermöglicht präzise, gen- und gewebespezifische Expression für die Entwicklungsbiologie.

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Wir danken Dr. F. Port, Dr. K. O'Connor-Giles und Dr. S. Feng für Diskussionen über CRISPR-Strategie; Dr. T.B. Kornberg und Bloomington Stock Center für Reagenzien; UMD bildgebenden zentrale Einrichtung; und die Finanzierung von NIH: R00HL114867 und R35GM124878, SR.

1. entwerfen und konstruieren gRNA Expressionsvektor
<ol><li>Um genau eine lange definierte Region ein Exon ersetzen, verwenden Sie eine doppelte gRNA Ansatz6, in denen jeder gRNA zwei Enden des ausgewählten Bereichs von Interesse gezielt kann. Um eine genaue Gen-spezifischen räumlich-zeitliche Ausdruck des Fahrers zu erhalten, wählen Sie zwei gRNA Ziel-Sites innerhalb der ersten kodierenden Exon des Gens.</li>
	<li>
Wählen Sie für Drosophila Melanogasterdie gRNA Ziel-Sites mit dem FlyCRISPR optimalen Ziel-Finder-Tool (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Andere verfügbare CRISPR-Design-Tools verwendet werden, einschließlich der optimiert CRISPR-Design-Tool (http://crispr.mit.edu), FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9), und E-CRISP (www.e-crisp.org/E-CRISP). Hinweis: Die folgenden Protokolle gRNA Design und Klonen wurde angenommen von Methoden zuvor beschriebenen6,7.<ol>
<li>Kopiere die tatsächliche Reihenfolge in das online-Tool zur Verfügung gestellt. Wählen Sie die zuletzt veröffentlichte Drosophila Melanogaster Genom Anmerkung Version, "r_6," im Dropdown-Menü "Select Genom." Geben Sie in das Feld "Select Führungslänge (nt)," "20." Wählen Sie "Alle CRISPR Ziele" zu finden und klicken Sie auf "Finden CRISPR Ziele".</li>
		<li>Bewerten Sie alle Kandidaten gRNA Ziele durch die Festlegung "Maximum" für "Strenge" und "NGG nur" für "PAM". Versuchen Sie die gRNA Websites ohne jede mögliche off-Ziele oder eine Mindestanzahl von off-Ziele möglich auszuwählen. Nutzung der Web-Tool beschrieben in Doench Et Al. 2014 8 um gRNAs mit einer potentiellen "gut" Aktivitätspunkte auszuwählen.</li>
		<li>Sicherzustellen Sie gleichzeitig, dass es kein Einzel-Nukleotid Polymorphie in gRNA Ziele im Genom der Ausgangslinie fliegen für Injektion (Z.B. Nein-Cas9 auf Chromosom X, BL # 54591) ausgewählt. Folgen Sie das Protokoll beschrieben in Gratz Et Al. 20157 , die genomische DNA aus der übergeordneten Fliegenschnur zu extrahieren. PCR zu verstärken, etwa 500 – 1.000 nt Regionen mit Grundierungen, die die Abfolge von Interesse und eine HiFi-DNA-Polymerase flankieren; Sequenz-überprüfen Sie die PCR verstärkt Produkte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Für die Erzeugung von einem Tandem gRNA Expressionsvektor, folgen einer Ligatur-unabhängige Klonen Protokoll6 um zwei Protospacer Sequenzen in einem pCFD4 RNA Expressionsvektor einzuführen. Beachten Sie, dass eine verbesserte Multi-gRNA Expressionsvektor (pCFD5) jetzt verfügbar ist, wo beide die SgRNAs von stark U6:3 Promotoren9 (https://www.crisprflydesign.org) ausgedrückt werden. Verwenden Sie eine DNA-Montage-Methode, um die gRNAs in den pCFD4-Vektor zu klonen.
	<ol>
<li>Gestalten und bestellen Sie die Forward- und reverse Primer für die Einführung von zwei Protospacer-Sequenzen in der RNA Ausdruck Vektor pCFD4 (Tabelle 1A). Wie zuvor beschrieben6enthält der forward Primer die erste Protospacer-Sequenz flankiert von Regionen entsprechend der U6-1-Promoter und gRNA Kern in pCFD4; die rückwärts-Primer enthält die umgekehrte Ergänzung Abfolge von der zweiten Protospacer, flankiert von Regionen entsprechend der gRNA Kern und U6-3 Promotor in pCDF4.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie Primer an 100 μM mit DNase und RNase-freie doppelt destilliertem Wasser (DdH2O). Machen Sie eine 10 μM arbeiten Konzentration Grundierung. PCFD4 Plasmid als Vorlage verwenden und PCR-Reaktion mit einer High Fidelity Polymerase und empfohlenen Einstellungen für PCR Reaktion6eingerichtet.</li>
		<li>Um der verstärkten Produkt in pCFD4 zu klonen, verdauen pCFD4 Plasmid mit BbsI Enzym durch die Einrichtung der folgenden Reaktion: 2 – 5 μg pCFD4 Plasmids, 5 μL 10 x Verdauung Puffer, 1 μL der BbsI Enzym und DdH2O 50 μL Endvolumen bringen. Mischen Sie Reaktion von sanft durch Tippen auf das Rohr und sammeln die verstreuten Tröpfchen von der Wand des Rohres an der Unterseite durch eine kurze Spritztour. Inkubieren Sie die Reaktion Mischung bei 37 ° C für 2 h.</li>
		<li>Führen Sie das PCR-Produkt aus Schritt 2 und das verdaute Produkt aus Schritt 3 auf einem 1 % Agarose-Gel. Führen Sie die Elektrophorese für genug Zeit, um die DNA-Bänder vollständig zu trennen. Schnitt die richtige Größe DNA-Bänder unter einer UV-Trans-Illuminator vor der erwarteten Produkte mit Gel Elution Spalte nach Anweisungen des Herstellers zu reinigen (siehe Tabelle der Materialien). Das PCR-Produkt sollte 600 bp und die linearisierte pCFD4 Plasmid sollte ~6.4 kb 6sein.</li>
		<li>Richten Sie die DNA Montage Reaktion in einem PCR-Röhrchen pro Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Zuständigen Bakterien (DH5α oder ähnliche Stämme mit ΔrecA1, ΔendA1) 2 μL des Produktes Montage verwandeln, Platte auf Ampicillin (100 μg/mL) mit LB (LB/Amp) Agarplatten und über Nacht bei 37 ° C inkubieren. Beachten Sie, dass die DNA Montage Mischung möglicherweise giftig für bestimmte Bakterienstämme, aber verdünnen den Versammlung Mix die Toxizität reduziert.</li>
		<li>Wählen Sie 3 – 4 Ampicillin-resistente Kolonien von der Platte über Nacht inkubiert, impfen Sie die Kolonie in 3 mL LB mit 100 μg/mL Ampicillin und wachsen Sie beimpfte Bakterien in einem Shaker 37 ° C über Nacht. Übernachtung-kultivierte Bakterien mit dem Plasmid Mini-Prep Kit nach Anweisung des Herstellers Plasmid entziehen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Reihenfolge der Plasmide mit T3 universal Primer zum Bildschirm für die richtige Klone mit dem Tandem gRNA einsetzen. Etablieren Sie einen Glycerin-bestand von Bakterien mit einer Sequenz verifiziert pCFD4-gRNA in 20 % Glycerin und Shop in einem-80 ° C Gefrierschrank für die zukünftige Verwendung verwandelt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. entwerfen und konstruieren des HDR-Spenders
<ol><li>
Entwerfen Sie für genomische Knock-in einer Sequenz Gal4 oder LexA einen doppelsträngige HDR Spender mit dem transaktivator Sequenz flankiert von zwei Armen der Homologie.
	<ol>
<li>Nutzung > 1,5 kb Links und rechts Homologie Arme flankieren das gRNA targeting Webseite(n). Erweiterte Homologie Arme steigern die Effizienz von HDR während der Reparatur-Prozess- 10.</li>
		<li>PCR verstärken die Homologie Arme aus genomischer DNA (gDNA) extrahiert aus der übergeordneten Fliegenschnur ausgewählt für die Injektion (Z.B. Nein-Cas9 (auf Chromosom X), BL # 54591). Ein Korrekturlesen hot Start Taq-DNA-Polymerase Enzym geeignet für PCR-Erweiterung zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien). Sequenz zu überprüfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um zu vermeiden, retargeting von gRNA, veränderter Locus, design der Ersatz-Spenders in einer Weise, dass gRNA Anerkennung Websites durch die exogene Sequenz eingeführt gestört sind. Hinweis: um zu vermeiden, die vermeintliche Cis-regulatorische Elemente zu verändern, wählen Sie immer die gRNA Anerkennung Standorte innerhalb der kodierenden Exon-Region.</li>
	<li>
Zur Erzeugung einer Ersatz-Kassette, planen die DNA Montage Strategie vier Segmente miteinander zu verbinden: die 5' und 3' Homologie Arme, die mittleren exogenen transaktivator DNA-Sequenz und die linearisierte klonen Vektor Rückgrat (z. B. pUC19 oder andere häufig verwendete Klonen Vektoren). Anschluss des Herstellers Leitlinie für DNA-Montage (siehe Tabelle der Materialien), die geeigneten Primer für PCR-Amplifikation und Montage der einzelnen Segmente zu entwerfen. Primer zu 100 μM mit DdH2O. Make 10 μM arbeiten Konzentration Grundierung aufzuwirbeln. Verwenden Sie High Fidelity Polymerase für die PCR-Reaktionen. Führen Sie das folgende Protokoll:
	<ol>
<li>PCR verstärkt eine Gal4 oder LexA Expressionskassette aus einer verfügbaren Vektor (z. B. Nls-LexA:p65; die ideale Gal4/LexA/QF2 Ausdruck Plasmide können gefunden und gemeinsame Ressourcen wie Addgene entnommen) mit der Grundierungen, die in Tabelle 1 baufgeführt.<ol>
<li>Alle ursprünglichen transkriptionellen und posttranskriptionelle Verordnungen ersetzt Exon auf die Expression von transaktivator DNA-Sequenz zu behalten, entwerfen die Kassette in einer Weise, dass das bearbeitete genomische Allel eine Chimäre mRNA ausdrücken würde von der transaktivator und dem Gen. Bewahren Sie die 5' und 3' Ende der gezielten Exon, kein Spleißen Signal zu behalten.</li>
			<li>Integrieren Sie ein T2A selbst anhaftenden Peptidsequenz zwischen den Rest 5' Codierung Exon und die transaktivator-Sequenz, die Übersetzung in ein chimäres Protein zu verhindern. Fügen Sie ein Stopcodon Übersetzung nach der exogenen transaktivator Sequenz (Abbildung 5).</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR verstärken die Homologie Arme aus genomischer DNA (gDNA) extrahiert aus der übergeordneten Fliegenschnur ausgewählt für die Injektion (Z.B. Nein-Cas9 (auf Chromosom X), BL # 54591) unter Verwendung der Zündkapseln in Tabelle 1 baufgeführt. High Fidelity Polymerase für die PCR-Reaktionen mit den Systemen wie folgt zu verwenden: 5 μL von 5 x Reaktion Puffer, 0,5 μl 10 mM dNTPs, 1,25 μl von 10 μM Forward Primer, 1,25 μl von 10 μM Reverse Primer, 0,5 μL der Schablone DNA, 0,25 μl der High-Fidelity-DNA-Polymerase , 16,25 μL der DdH2O.</li>
		<li>Verwenden Sie linearisierte klonen Vektor wie pUC19. Eine Reihe von Spender-Vektoren sind nun verfügbar. Eine umfassende Liste auf der folgenden Webseite http://flycrispr.molbio.wisc.edu zu sehen.</li>
		<li>Führen Sie die PCR-Produkte auf einem 1 % Agarose-Gel. Führen Sie die Elektrophorese für genug Zeit, um eine klare Trennung der gewünschten Band aus den unerwünschten unspezifische Banden (falls vorhanden) zu gewährleisten. Gel-die erwarteten DNA-Fragmente zu reinigen. Messen Sie die Konzentration von gereinigte DNA-Fragment mit einem Spektralphotometer.</li>
		<li>Richten Sie die DNA Montage Reaktion nach Anweisungen des Herstellers. Mischen Sie die linearisierte klonen Vektor und Ziel-Fragmente aus Schritt 3 und Schritt 4 in die folgende Reaktion: 1 μL der linearen klonen Vektor (50 ng/μl), 2 – 3 fache Übermaß an jedes Ziel Fragment, 10 μL 2 x DNA Montage master-Mix, bringen 20 μl mit DdH das endgültige Reaktionsvolumen < C21 > 2O. Incubate Reaktion Mischung für 1 Stunde bei 50 ° C.</li>
		<li>Verwandeln Sie Platte auf LB/Amp Agarplatten mit 100 μg/mL Ampicillin 2 μL des Produktes Montage in zuständigen Bakterien. Auch fügen Sie X-Gal + IPTG auf dem Teller für blau/weiß-Screening hinzu.</li>
		<li>Wählen Sie 3 – 4 weiße Kolonien von der Platte über Nacht inkubiert, impfen die Kolonie in 3 mL LB mit 100 μg/mL Ampicillin und wachsen bei 37 ° C über Nacht in einen Shaker geben. Extrakt-Plasmid aus der Übernachtung-kultivierte Bakterien mit dem Plasmid Mini-Prep Kit nach der Hersteller in der Bedienungsanleitung (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Bildschirm der positiven Kolonie durch PCR oder Einschränkung Verdauung.</li>
		<li>Sequenz Überprüfen der HDR spenderregion des endgültigen Plasmids. Speichern Sie eine bakterielle Lager mit der richtigen Klone in 20 % Glycerin bei-80 ° C für künftige Impfung transformiert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Embryo Einspritzung, Fliege Genetik und Screening für Genom-Bearbeitung
<ol><li>Bereiten Sie die hohe Reinheit gRNA Endotoxin-freies Expressionsvektors sowie die HDR-Spender-Plasmid mit einem Plasmid Maxiprep kit (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Co injizieren Sie gRNA expressionsplasmid (100 ng/μl) und der Ersatz-Spender (500 ng/μl) in die Keimbahn des Nein-Cas9 Embryonen6. Hinweis: Wir verwenden eine kommerzielle Dienstleistung zur Injektion, aber dieses Verfahren kann im Labor sowie durchgeführt werden.</li>
	<li>
Fliegen Sie, Genetik und Screening (Abbildung 2 und Abbildung 3):
	<ol>
<li>Wenn die injizierten Embryonen zu Erwachsenen entwickeln, fliegt0 Kreuz jedes einzelnen G Balancer fliegen. Wählen Sie geeignete Balancer für das Chromosom, das gezielte Allel enthalten.</li>
		<li>Die F1 Nachkommen aus jedem G0 auf einen CO2 Pad überqueren und nach dem Zufallsprinzip auswählen 10-20 Männer unter einem Stereomikroskop zu betäuben. Überqueren sie einzeln auf die Balancer-Weibchen, wie in Abbildung 3dargestellt.</li>
		<li>Wenn die F2 Larven schlüpfen, wählen Sie einzelnen F1-Vater von jedem Kreuz und gDNA mit dem einzigen fliegen genomische DNA Vorbereitung Protokoll zu extrahieren:<ol>
<li>GDNA Extraktionspuffer vorbereiten: 10 mM Tris-Cl pH 8,2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, bei Raumtemperatur lagern. 20 mg/mL Proteinase K-Stammlösung vorbereiten und im Gefrierschrank aufbewahren.</li>
			<li>Setzen Sie jede Fliege in einem 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen und beschriften Sie das Rohr. Über Nacht in die Gefriertruhe-80 ° C halten.</li>
			<li>Bereiten Sie eine frische Arbeitsvolumen von gDNA Extraktionspuffer enthält 200 µg/mL Endkonzentration von Proteinase K. Hinweis: Verwenden Sie einen alte Puffer nicht für diesen Schritt.</li>
			<li>Zerquetschen Sie jede Fliege für 10 – 15 s mit einer PIPETTENSPITZE 50 μL der Anquetschen Puffer ohne Verzicht auf die Flüssigkeit enthält. Die verbleibenden Puffer in das Rohr zu verzichten und gut mischen. Inkubation bei 37 ° C für 20-30 min.</li>
			<li>Setzen Sie Rohre in 95 ° C Hitze Block für 1 – 2 min. zu inaktivieren die Proteinase K.</li>
			<li>Spin-down für 5 min bei 10.000 X g. Speichern Sie die Vorbereitung bei 4 ° C für weitere PCR-Analysen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie dieselbe Methode zur gDNA eine Nein-Cas9 Fliege, Vorbereitung dient als Negativkontrolle. Führen Sie Dreistufen-PCR-basierte Bildschirme zur Identifizierung der richtigen "endet," HDR (Abbildung 2, Abbildung 5) mit gDNA jedes F1-Männchen als Vorlage5. 1 μl DNA prep im folgenden PCR Reaktionssystem verwenden: 10 μL 2 x PCR-Master-Mix mit Farbstoff, 1 μL jeder Grundierung (10 μM), 1 μL der DNA Schablone und 7 μL DdH2O.</li>
	<li>Wie in Abbildung 5Agezeigt, führen Sie PCR mit Primer fwd1 und rev1 zum Bildschirm für die Existenz der Einfügung oder Ersatzlieferung; Führen Sie PCR unter Verwendung fwd2 und rev2 Zündkapseln, die Einfügung oder Ersatz von 3' Region überprüfen; Führen Sie PCR mit Primer M13F und rev3, "enden in" HDR (Tabelle 1) zu überprüfen.</li>
	<li>Halten Sie die Fliegenschnüre mit der bestätigten enden-Out HDR und etablieren Sie ausgewogene Bestände aus der F2-Generation zu. Outcross, die Balancer fliegen wieder, jede unbeabsichtigten Mutationen auf anderen Chromosomen zu entfernen.</li>
	<li>
Bereiten Sie qualitativ hochwertige gDNA aus den etablierten Beständen zur langen PCR Verstärkung (> 800 – 1.000 nt) Amplikons mit hoher Wiedergabetreue Taq Polymerase und voll Reihenfolge überprüfen der Amplifikate aus veränderten genomischen Regionen gewonnen. Alternativ können Sie rohe gDNA Extrakt wie beschrieben früher kürzere verstärken (< 800 nt), überlappende PCR-Produkte um das bearbeitete Genom-Sequenz zu überprüfen. Verwenden Sie das folgende Protokoll, um gute Qualität Drosophila genomische DNA vorzubereiten:
	<ol>
<li>Habe ca. 25 Erwachsenen fliegen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, und mindestens 1 Stunde bei-20 ° C oder-80 ° C Gefrierschrank gefrieren lassen.</li>
		<li>Fügen Sie 250 μl der Lösung A (pH 9,0 Tris HCl 0,1 M EDTA 0,1 M SDS 1 %).</li>
		<li>Die fliegen mit den homogenisierenden Stößel in Mikrozentrifugenröhrchen zu homogenisieren, und das Rohr auf Eis gelegt.</li>
		<li>Bei 70 ° C für 30 min inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 35 μL der KOAc (5 M), schütteln und gut mischen, aber tun nicht Wirbel.</li>
		<li>Inkubation für 30 min auf Eis.</li>
		<li>Mit 12.000 X g für 15 min drehen.</li>
		<li>Mit einer Mikropipette 1 mL sorgfältig übertragen nur den klare überstand zu einem neuen Schlauch verlassen wieder jedem Niederschlag oder interphase.</li>
		<li>Der Überstand 150 μl Isopropanol hinzufügen. Mischen Sie vorsichtig durch Umkehrung.</li>
		<li>Mit 10.000 X g für 5 min drehen.</li>
		<li>Nehmen Sie des Überstands vorsichtig und lassen Sie das Pellet in das Rohr.</li>
		<li>Waschen Sie die Tablette mit 1 mL 70 % EtOH.</li>
		<li>Mit 12.000 X g für 5 min drehen.</li>
		<li>Den überstand zu entfernen. Das Pellet für 15 bis 20 min der Luft trocknen lassen. Trocknen Sie die Pellets nicht über.</li>
		<li>Das Pellet in 100 μL der DdH2O. Auflösen</li>
		<li>High Fidelity DNA-Polymerase geeignet für lange Amplikons verwenden (> 800 bp), die komplette bearbeitete Region zu verstärken. Idealerweise nehmen Sie zwei Zündkapseln, außerhalb der eingelegten Kassette, die genomische Region zu verstärken. Gel reinigen das PCR-Produkt, und wie oben beschrieben, Sequenz überprüfen das Produkt mit mehreren überlappenden Primern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Überprüfen Sie die korrekte raumzeitlichen Expressionsmuster von seziert Gewebe/Embryonen von veränderten Leinen negativ beeinflussen:
	<ol>
<li>Führen Sie RT-PCR aus der Gesamt-RNS, die Expression von Hybrid-mRNA-Produkt (Tabelle 1) zu überprüfen.</li>
		<li>Führen Sie eine in Situ Hybridisierung der mRNA-Produkt des Interesses an der Larven Gewebe/Embryo um den Ausdruck zu überprüfen.</li>
		<li>Für die genaue gewebespezifischen raumzeitlichen Expressionsmuster unter die Sequenz verifiziert enden-Out Zeilen cross jede bearbeiteten Linien auf den Bildschirm erhalten, für den binären Ausdruck Fahrer mit dem LexO- GFP oder LexO- RFP (für LexA Treiber) Linie (erhältlich bei den Bloomington-Lager-Zentren) und LexA oder Gal4 getrieben Reporter-gen-Expression in den Embryo, Larven und adulten Geweben unter dem Fluoreszenzmikroskop zu beobachten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Traditionell wurden Drosophila Enhancer fallen durch zwei unterschiedliche Methoden erzeugt. Eine der Möglichkeiten umfasst zufällige Einfügung eines Treibers (zB., Gal4) Sequenz des Genoms durch Umsetzung (zB., P-Element Umsetzung)1 . Alternativ können die Fahrer Sequenzen transkriptionelle einer vermeintlichen Enhancer/Promotor-Region in ein Plasmid-Konstrukt, unterstellt werden, die dann in eine ektopische Website des Genoms3,<sup cl...

Die genetische Toolbox für gezielte Genexpression wurde gut in Drosophila, so dass es eines der besten Modellsysteme, die Funktion von Genen, die in einer Vielzahl zellulärer Prozesse zu untersuchen. Binäre Expressionssysteme wie Hefe Gal4/UAS (upstream Aktivierung Sequenz), wurde zuerst angenommen, für gewebespezifischen Enhancer Trapping und gen Misexpression in Drosophila genetischen Modell1 (Abbildung 1). Dieses System erleichtert die Entwicklung einer Vielzahl von Techniken wie räumlich-zeitliche Regelung der Überexpression des Gens, Misexpression, ko in ausgewählten Gruppen von Zellen als auch in Zelle Ablation, Zelle markieren, live Verfolgung der zellulären und molekularen Prozesse im Embryo und Gewebe, Linie nachzeichnen und Mosaik Analysen während der Entwicklung. Eine Reihe von binären Transkription System, z. B. bakterielle LexA/LexAOp -System (Abbildung 1) und Neurospora Q-System, sind genetische Werkzeuge, die jetzt häufig in Drosophila, zusätzlich zu das ursprüngliche Gal4/UAS-System für gezielte Gen Ausdruck1,2,3.
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode um hochzuverlässige gewebespezifischen binäre Expressionssystems zu erzeugen, durch den Einsatz einer Genom-Bearbeitung Technik. Die jüngsten Fortschritte in der CRISPR/Cas9 Genom Bearbeitung Technologie konnten nie da gewesene Möglichkeiten gerichtete Genom Änderungen in einer Vielzahl von Organismen. Im Vergleich zu den anderen verfügbaren Genom Schnitttechniken, ist das CRISPR/Cas9-System Kostengünstig, effizient und zuverlässig. Diese Technologie nutzt Komponenten des adaptiven Immunsystems bakterielle: ein Cas9 Endonuklease Streptococcus Pyogenes , die eine Doppel-Strang-Pause (DSB) erstellt und eine Chimäre Reiseführer RNA (gRNA), der die Cas9 führt zu einer bestimmten Genom-Website für gezielte DSB4. Die Zellen enthalten die Maschinen um die DSB über verschiedene Wege zu reparieren. Nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) führt zu kleinen Einfügungen oder Löschungen Genfunktion, zu stören, während unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) einen definierten gerichtet/wünschenswert genomischen Knock-in/Knock-out führt durch eine exogene HDR-Spender als Vorlage verwenden. Die HDR-basierte Strategie kann effizient genutzt werden, um eine äußerst zuverlässige gewebespezifischen binärer Ausdruck System zu erzeugen, die die Grenzen der traditionellen Enhancer-Trap-Methoden überwinden können. Wir beschreiben eine schrittweise Anleitung zur Nutzung der CRISPR/Cas9-basierte HDR Reparatur bei der Erzeugung einer binären Transkription Treiber-Linie, die unter der Kontrolle der endogenen transkriptionellen und posttranskriptionelle Verordnung von einem Drosophila ausgedrückt wird gen. In diesem Protokoll zeigen wir die Generation einer Fahrer-Linie speziell für astlosen (Bnl) Gen Kodierung eine Familie FGF-Protein, das verzweigte Morphogenese von trachealen Atemwege Epithel5regelt. In diesem Beispiel das erste kodierende Exon des Gens Bnl wurde ersetzt durch die Folge einer bakteriellen LexA transaktivator Sequenz unbeschadet einer endogenen Cis-regulatorischen Sequenzen des Bnl -Gens. Wir zeigen, dass die Strategie eine Bnl-LexA Fahrer Linie erzeugt, die raumzeitlich den Ausdruck ein Reportergen platziert hinter der LexAoperator (LexAop oder LexO) ausschließlich in Bnl steuert- mit dem Ausdruck epitheliale/Mesenchymale/neuronalen Zellen.

<table><tbody><tr><td>X-Gal/IPTG</td><td>Gentrox (Genesee Scientific)</td><td>18-218</td><td>Klonierung</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>BD Difco</td><td>BD&nbsp; 244520</td><td>Klonierung</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td>Molekularbiologie</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1161</td><td>Molekularbiologie</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Ultrareines DNase/RNase-freies Wasser</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td>Molekularbiologie</td></tr><tr><td>10% SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71736</td><td>Molekularbiologie</td></tr><tr><td>KOAc</td><td>Fisher-Scientific</td><td>P1190</td><td>Molekularbiologie</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher-Scientific</td><td>04-355-451</td><td>Molekularbiologie</td></tr><tr><td>GeneJET Miniprep</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0503</td><td>Miniprep</td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxipep Kits</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific K210006</td><td>Maxiprep</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>NEB</td><td>R0539S</td><td>Restriktionsenzym-Primer</td></tr><tr><td></td><td>IDT-DNA</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>pCFD4</td><td>Kornberg Lab</td><td></td><td>DNA-Template und Vektor für gRNA</td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2601</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Q5-High Fidelity Taq</td><td>NEB NEB</td><td>#M0491</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>NEB #E2611</td><td>DNA-Assemblierung</td></tr><tr><td>pBPnlsLexA:p65Uw</td><td>Addgene</td><td></td><td>DNA-Template für die LexA-Amplifikation</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25530049</td><td>Molecular</td></tr><tr><td>Biology 2x PCR PreMix, mit Farbstoff (rot)</td><td>Sydlab</td><td>MB067-EQ2R</td><td>Molecular Biology</td></tr><tr><td>Gel-Elutionskit</td><td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td><td>11-300</td><td>Molecular Biology</td></tr><tr><td>TRI Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Molecular Biology</td></tr><tr><td>Direct-Zol RNA Purification Kits</td><td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td><td>11-330</td><td>Molecular Biology</td></tr><tr><td>OneTaq One-Step RT-PCR Kit</td><td>NEB</td><td>E5315S</td><td>Molecular Biology</td></tr><tr><td>lexO-CherryCAAX</td><td>Kornberg Lab</td><td></td><td>Fliegenschnur</td></tr><tr><td>UAS-CD8:GFP</td><td>Kornberg Labor</td><td></td><td>Fliegen-Schnur</td></tr><tr><td>btl-Gal4</td><td>Kornberg Labor</td><td></td><td>Fliegenschnur</td></tr><tr><td>MKRS/TB6B</td><td>Kornberg Labor</td><td></td><td>Fliegenschnur</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop SP5X</td><td>Leica</td><td></td><td>Imaging Expressionsmuster</td></tr><tr><td>CO2 Station</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td>Fliegenschieben</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ-61</td><td>Fliegenschieben</td></tr><tr><td>Stößel zur Homogenisierung von Mikroröhrchen</td><td>Fisher-Scientific</td><td>03-421-217</td><td>genomische DNA-Isolierung</td></tr><tr><td>NanoDrop Spektralphotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>DNA-Quantifizierung</td></tr></tbody></table>

eine wirksame strategie zur erzeugung von gewebespezifischen binäre transkription systeme in drosophila von genom-bearbeitung

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binäre Transkription Systeme sind genetische Werkzeuge zur Visualisierung und Manipulation Zelle Schicksal und Gen-Ausdruck in spezifischen Gruppen von Zellen oder Geweben in Modellorganismen weit verbreitet. Diese Systeme enthalten zwei Komponenten als separate transgene Linien. Eine Treiber-Linie drückt eine transcriptional Aktivator unter der Kontrolle der gewebespezifische Promotoren/Enhancer und ein Reporter/Effektor Linie Häfen ein Zielgen flussabwärts die Bindungsstelle des Aktivators Transkription platziert. Tiere beherbergen beide Komponenten induzieren gewebespezifischen werden von einem Ziel-Genexpression. Präzisen raumzeitlichen Expression des Gens in gezielte Geweben ist entscheidend für unvoreingenommene Auslegung der Zelle/Genaktivität. Daher ist es wichtig, ein Verfahren zur Erzeugung von exklusiven Zelle/Gewebe-spezifische Treiber Linien zu entwickeln. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, um Gewebe hochspezifische gezielte Expressionssystems erzeugen durch den Einsatz einer "gruppierten regelmäßig Interspaced kurze palindromische Repeat/CRISPR-assoziierte" (CRISPR/Cas)-Genom Bearbeitung Technik basiert. Bei dieser Methode die Endonuklease, die Cas9 durch zwei Chimären ausgerichtet ist guide RNAs (gRNA) auf bestimmte Websites im ersten kodierenden Exon eines Gens im Genom Drosophila Doppel-strangbrüchen (DSB) zu erstellen. Anschließend ermöglicht die Verwendung eine exogene Spender Plasmid mit dem transaktivator-Sequenz, die Zelle-autonome Reparatur-Mechanismus unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) des DSB, was präzise löschen und durch die transaktivator zu ersetzen das exon Sequenz. Klopfte in transaktivator äußert sich ausschließlich in den Zellen wo der Cis-regulatorische Elemente des Gens ersetzt sind funktionsfähig. Das detaillierte Schritt für Schritt Protokoll hier vorgestellten zur Erzeugung von binären transkriptionelle Fahrer ausgedrückt in Drosophila Fgf/astlosen-produzierenden epithelialen/neuronalen Zellen für jedes Gen oder gewebespezifische Ausdruck angenommen werden kann.

Dieses Protokoll wurde erfolgreich eingesetzt, um eine gezielte binärer Ausdruck Reporter System speziell für Bnl Ausdruck Zellen5zu generieren. Der Cis-regulatorische Elementen (CREs), die komplexe raumzeitlichen Bnl Ausdruck Steuern sind nicht gekennzeichnet. Daher wurde um raumzeitlichen Ausdruck unter der Kontrolle der endogenen Bnl regulatorische Sequenz zu erreichen, nur die ersten kodierende Exon des Bnl entwickel...

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila der erste kodierende Exon Gene durch Transkription Treiber ersetzen. CRISPR/Cas9-basierte Methode stellt eine transaktivator Sequenz der endogenen Verordnung eines Gens ersetzt und somit erleichtert Transctivator Ausdruck ausschließlich im Gen-spezifischen räumlich-zeitliche Muster.

Eine wirksame Strategie zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila von Genom-Bearbeitung

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein hochgewebespezifisches Zielexpressionssystem zu erzeugen. Bei dieser Methode demonstrierten wir die Generierung eines binären Transkriptionstreibers speziell für unseren Drosophila FGF Homolog, verzweigt. Dynamische, raumzeitliche Expression von zweiglos reguliert die Asthämogenese des Trachealatemepithels.Obwohl diese Methode Einen Einblick in die räumlich-zeitliche Expression und Migration von verzweigt produzierenden Zellen geben kann, kann sie leicht auf andere Gene und Gewebe in Drosophila oder in anderen Modellorganismen wie C.Elegans und Zebrafischen angewendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Expressionssysteme erzeugt, die sehr zuverlässig, gewebe- und genspezifisch sind und ausschließlich in Zellen aktiv sind, in denen die cis-regulatorischen Elemente des ersetzten Gens funktionsfähig sind. Binäre Transkriptionssysteme sind wesentliche Werkzeuge für gezielte Genexpression und -manipulation.Ein Transaktivator wie GAL4 oder LexA, der unter der Kontrolle von cis regulatorischen Elementen eines Gens ausgedrückt wird, treibt ein Effektor-Transgen an, das nach bestimmten Transkriptionsbindungsstell

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video beschreibt eine Screening-Methode zur Identifizierung transgener Drosophila-Fliegen, deren Genom mit CRISPR-Cas9 modifiziert wurde. CRISPR-Cas9 ist ein leistungsstarkes Genom-Editing-Tool, das die Art und Weise, wie Wissenschaftler das Genom eines Organismus manipulieren können, revolutioniert hat. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie CRISPR-generierte Mutanten identifiziert werden können, bei denen eine Insertion einer Transaktivierungssequenz das erste Exon des...

Screening auf genomische Modifikationen: Eine Methode zur Identifizierung von CRISPR-generierten Mutanten in Drosophila

Homologe Rekombination Techniken stark...

Recombineering homologen Rekombination Konstrukte in<em&gt; Drosophila</em

Designer-Nukleasen wie Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-Effektor wie Nukleasen (Talens) kann verwendet werden, um das Genom der Maus Präimplantationsembryonen durch Auslösen sowohl die nicht-homologe Ende (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR) Wege ändern. Diese Fortschritte ermöglichen die schnelle Generierung von Mäusen, die mit präzisen genetischen Veränderungen.

Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

Die experimentelle Validierung der Enhancer-Aktivität erfolgt am besten durch eine Funktionsverlustanalyse. Hier wird ein effizientes Protokoll vorgestellt, das die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion verwendet, um die allelspezifische Regulation der Gentranskription in F1-ES-Zellen zu untersuchen, die ein Hybridgenom (Mus musculus129 x Mus castaneus) enthalten.

Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Gezielte Genom-Bearbeitung im Modellsystem Danio Rerio (Zebrafisch) wurde durch das Aufkommen von CRISPR-basierte Ansätze erheblich erleichtert. Hier beschreiben wir eine schlanke, robuste Protokoll für Erzeugung und Identifizierung von CRISPR-abgeleitete Unsinn Allele, die Heteroduplex Mobility Assay integriert und Identifizierung von Mutationen mit Next Generation Sequencing.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für die Verwendung des RNA-Targeting-Enzyms Cas13D (RfxCas13D) in Fliegen.

Ubiquitäres und gewebespezifisches RNA-Targeting in Drosophila Melanogaster mittels CRISPR/CasRx

Dieser Artikel stellt die Schritt-für-Schritt-Protokolle für die CRISPR/Cas9-Mutagenese der orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis vor. Detaillierte Schritte, die von diesem standardisierten Protokoll bereitgestellt werden, werden als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen für funktionelle Genstudien in B. dorsalis dienen.

Protokolle für CRISPR/Cas9-Mutagenese der Orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Hier stellen wir ein vereinfachtes endogenes Gen-Tagging-Protokoll für Drosophila vor, das eine PCR-basierte Technik zur markerfreien Identifizierung erfolgreicher genetischer Veränderungen verwendet und die Entwicklung stabiler Knock-in-Linien erleichtert.

Einstufige CRISPR-basierte Strategie zur endogenen Genmarkierung in Drosophila melanogaster

Dieser Artikel nimmt die phiC31-Integrase-vermittelte Transgenese in Drosophila als Beispiel und stellt ein optimiertes Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen vor, ein entscheidender Schritt für die Entstehung transgener Fliegen.

Mikroinjektion von Embryonen zur Transgenese bei Drosophila

Die Abgabe von Genomeditoren als RNAs ist ein besonders wirkungsvolles Mittel zur Modifikation der Genome primärer Säugetierzellen und -zelllinien. Ziel dieses Protokolls ist es, Genom-Editoren als mRNA in primäre Säugetierzellen und -zelllinien zu liefern, gefolgt von gezielter Illumina-Sequenzierung und Analyse zur Quantifizierung der Editierergebnisse.

Genom-Editierung in primären Säugetierzellen mittels Elektroporation von Editor-RNA

Erfahren Sie, wie CRISPR/Cas9-basierte Genomeditierung zur Erzeugung gewebespezifischer binärer Transkriptionssysteme in Drosophila verwendet wird. Diese Methode ermöglicht präzise, gen- und gewebespezifische Expression für die Entwicklungsbiologie.

Eine wirksame Strategie zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila von Genom-Bearbeitung

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