Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Fettgewebsbiologie zu beantworten, z. B. wie verschiedene Bestandteile des Fettgewebes in einem gesamten Gewebe interagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die überschüssigen Lipide, die im Fettgewebe gespeichert sind, vollständig entfernt und gleichzeitig ihre dreidimensionale Architektur beibehält. Während diese Methode einen Einblick in die dreidimensionale Organisation des Fettgewebes geben kann, kann sie im Allgemeinen auch auf andere Gewebe mit hohem Lipidgehalt wie Gedächtnisdrüse und Lymphknoten angewendet werden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Entfettungs- und Reinigungsschritte ausreichende Inkubationszeiten erfordern, die schwer zu bestimmen sein können. Beginnen Sie damit, mit einer stumpfen Pinzette das Fettpolster von Interesse aus einem frisch perfundierten Tiermodell zu sezieren. Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Modepolster, ohne das Gewebe zu kneifen oder zu quetschen oder das präparierte Gewebe mit Fell zu kontaminieren.

Legen Sie das Fettpolster in etwa 10 Milliliter Fixierlösung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und fixieren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag nach dem Waschen der Probe mit PBS vorsichtig alle Rückstände von der Probe unter einem Seziermikroskop. Haare, Flusen oder andere Ablagerungen, die an der Probe haften, verursachen während der Bildgebung Schatten.

Übertragen Sie die saubere Probe in ein Polypropylenröhrchen mit eiskaltem, 20 Prozent Methanol B1N-Puffer. Stellen Sie das Röhrchen mit der Probe horizontal auf einen Orbitalschüttler, stellen Sie es auf 100 U/min ein und schütteln Sie es je nach Größe der Probe 30 Minuten bis 1 Stunde lang. Stellen Sie sicher, dass sich die Proben frei im Röhrchen bewegen können.

Fahren Sie mit der Dehydrierung der Proben durch eine abgestufte Serie von 40 Prozent, 60 Prozent und 80 Prozent Methanol in B1N-Puffer gefolgt von 100 Prozent Methanol fort. Minimieren Sie die Verschleppungslösung. Ersetzen Sie nach der Dehydratisierung die 100-prozentige Methanollösung durch 100 % Dichlormethan oder DCM, um die Probe zu entfetten.

Wiederholen Sie das Waschen zweimal nach den in Tabelle 2 angegebenen Inkubationszeiten. Die Probe sollte am Ende des zweiten und dritten DCM-Waschgangs auf den Boden des Röhrchens sinken. Wenn nicht, verlängern Sie die Inkubationszeit, um eine vollständige Entfettung zu gewährleisten.

Nach der Entfettung für die in Tabelle 2 angegebene Zeit zweimal mit 100 Prozent Methanol waschen. Die Probe wird für die in Tabelle 2 angegebenen Zeiten in einer umgekehrten Methanol-B1N-Pufferserie rehydriert. Nach der Rehydrierung waschen Sie die Probe 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit PTXWH-Puffer

Die Probe ist nun bereit für die Immunfärbung oder könnte bis zu 1 Jahr in PTXWH-Puffer bei 4 Grad Celsius gelagert werden. Verdünnen Sie zunächst den Primärantikörper in PTXWH-Puffer auf die empfohlene Konzentration. Zentrifugieren Sie dann die verdünnte Antikörperlösung 10 Minuten lang bei 20 Tausend g, um die Einführung von Antikörperpräzipitaten oder -aggregationen zu verhindern.

Es ist wichtig, die richtigen Primärantikörper zu wählen, die mit der Behandlung mit Methanol und DCM kompatibel sind. Neue Antikörper sollten mit kleinen Gewebestücken oder mit Methanol behandelten Gewebeschnitten validiert werden. Inkubieren Sie die entfettete Probe je nach Größe der Probe 3 bis 5 Tage lang mit der primären Antikörperlösung.

Nach der Primärinkubation wird die Probe mehrmals mit PTXWH-Puffer gewaschen. Am nächsten Tag verdünnen Sie den Sekundärantikörper in PTXWH-Puffer auf die empfohlene Konzentration. Zentrifugieren Sie die verdünnte Antikörperlösung wie zuvor.

Inkubieren Sie die Probe je nach Größe der Probe 3 bis 5 Tage lang mit der Sekundärantikörperlösung. Waschen Sie die Probe erneut wie zuvor in einer Reihe von Inkubationsschritten mit PTXWH-Puffer. Waschen Sie die Probe am nächsten Tag 5 Minuten, 10 Minuten und dann 30 Minuten lang mit 1XPBS.

Betten Sie Fettgewebe in Agarose ein, um die Probenaufnahme für die Lichtblattmikroskopie zu erleichtern. Bereiten Sie zunächst die Einbettlösung mit 1 Prozent Agarose in 1XPBS vor. Kühlen Sie die Einbettungslösung auf etwa 40 Grad Celsius ab, um zu vermeiden, dass die Probe übermäßiger Hitze ausgesetzt wird.

Unter Vermeidung von Flüssigkeitsverschleppungen legen Sie die gereinigte Gewebeprobe in eine Form und bringen Sie sie in die gewünschte Position. Gießen Sie dann die Einbettungslösung vorsichtig über die Probe und vermeiden Sie dabei Luftblasen. Eventuelle Luftblasen sollten an die Peripherie bewegt werden, bevor sich die Agarose verfestigt.

Sobald die Agarose vollständig erstarrt ist, schneide einen Block mit der Probe aus. Die Probe wird auf 25 % Methanol in Wasser umgefüllt, vor Licht geschützt und unter Schütteln für die in Tabelle 2 gezeigte Zeit inkubiert. Fahren Sie mit der Dehydrierung der Probe durch einen Methanolgradienten fort.

Inkubieren Sie die Probe 1 Stunde lang in 100 Prozent DCM unter Schütteln. DCM Washed Samples trocknen leicht an der Luft aus, was die Klarheit der Probe beeinträchtigen und zu verschwommenen Bildern führen würde. Es ist wichtig, die Proben schnell in eine frische Lösung zu überführen, um ein Austrocknen zu verhindern.

Die Probe sollte am Ende jeder DCM-Spülung auf den Boden des Röhrchens sinken. Inkubieren Sie die Probe über Nacht in Dibenzylether oder DBE unter leichtem Schütteln, um eine Brechungsindexanpassung zu erreichen. Die Probe wird schließlich zu transparentem, unsichtbarem Licht.

Am nächsten Tag, nachdem Sie die Probe 2 Stunden lang mit frischem DBE unter leichtem Schütteln inkubiert haben, lagern Sie die Probe bei Raumtemperatur im Dunkeln oder fahren Sie direkt mit der Bildgebung fort. Um die Probe mit einem Lichtblattmikroskop abzubilden, das mit DBE kompatibel ist, montieren Sie die in Agarose eingebettete Probe auf einen Halter, der Bewegungen während der Bildgebung verhindern kann. Um die Probe mit einem inversen Konfokal- oder Zwei-Photonen-Mikroskop abzubilden, legen Sie die in Agarose eingebettete Probe in einen Objektträger mit Glasboden.

Das Scannen eines posterioren subkutanen Fettpolsters mit einem Lichtblattmikroskop mit geringer Vergrößerung zeigt die lobuläre Organisation der Adipozyten. Detailliertere Informationen, wie z. B. die Größe der Adipozyten, können durch Heranzoomen in die interessierenden Bereiche mit höherer Vergrößerung enthüllt werden. Ein posteriores subkutantiöses Fettpolster, das mit Tyrosinhydroxylase, einem Marker für das sympathische Nervensystem, gefärbt war, wurde mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet.

Bei der TH-Färbung wurden Strukturen sichtbar, die als große Nervenbündel erscheinen, wie hier durch den Pfeil angedeutet. Die Innervation der Blutgefäße sowie die dichte terminale Arborisation im Gewebeparenchym werden ebenfalls durch die TH-Färbung aufgedeckt. Unter Verwendung des Adhäsionsmoleküls der Thrombozyten-Endothelzellen oder PCAM1, auch bekannt als CD31, als Marker zur Markierung von Blutgefäßen, wird beobachtet, dass alle Adipozyten in Kontakt mit den Kapillaren im gesamten Gewebe stehen, was den hohen Bedarf an effizientem Nährstoff- und Sauerstoffaustausch im Fettgewebe unterstützt.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Fettbiologie, um zusätzliche Fragen wie die frühe Gewebemorphogenese und die Kartierung des Schicksals von Adipozyten-Vorläuferzellen zu untersuchen. Es kann auch zur Untersuchung der Histologie des menschlichen Fettgewebes eingesetzt werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd, Methanol, Dichlormethan und Dibenzylether äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung eines Abzugs und persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.