Name: Immunhistochemische Nachweis von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine bei der Entwicklung und der postmitotischen Maus Retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Lernen Sie die immunhistochemische Detektion von 5mC und 5hmC in der Maus-Retina während der Entwicklung und im postmitotischen Zustand. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung epigenetischer Veränderungen in neuronalen Geweben.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen SBIR Zuschuss (1R44EY027654-01A1).

Alle Eingriffe mit Mäusen waren gemäß Protokollen durch die Kinder Hospital Oakland Research Institute Tier Pflege und Verwendung Committee genehmigt und der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklärung für die Nutzung eingehalten von Tieren in der Augenheilkunde und vision Forschung.
(1) Gewebe Vorbereitung Immunostaining
<ol><li>Einschläfern C57 BL/6J Mäuse an embryonalen Tag (E) 16, postnatale (P) 0, P15 und P90 durch Kohlendioxid (CO2) gefolgt von Enthauptung (E16 und P0 Mäuse).</li>
	<li>Augen sofort Einatmung Maus punktiert mit 29 1/2 Nadel an der dorsalen Seite des Auges. 5 Minuten (min) in 1 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (1 X PBS) pH 8.0 bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Um Augenmuscheln aus P0, P15 und P90, sezieren, Hornhaut und Linse mit feinen ophthalmologischen Schere während Augen in den 4 % PFA. Hinweis: Überspringen diesen Schritt für E16 Augen wie die Augen sind zu klein.</li>
	<li>Befestigen Sie die Augenmuschel (P0, P15 und P90) und die ganze Augen (E16) in 4 % PFA für 20 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Augenmuscheln und ganze Augen zweimal in 1 mL 1 X PBS für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Cryoprotect das Auge Tassen und Augen ganz in 1xPBS pH 8.0 enthält 10 % Saccharose für 1 Stunde. Halten Sie in 20 % Saccharose mit 1 X PBS-Puffer für 1 Stunde und dann sättigen Sie, in 30 % Saccharose in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Am nächsten Tag die Augenmuschel und die ganze Augen in optimale Temperatur Verbindung (OCT), (500 µL) in Cryomolds einzubetten, Snap-Freeze in einem Trockeneis/Ethanol-Bad und bei-80 ° c Lagern</li>
	<li>Entfernen Sie die Formen mit eingebetteten Augenmuscheln und ganze Augen von-80 ° C und-20 ° c für 1 Stunde vor Kryoschneiden equilibrate lassen.</li>
	<li>Schneiden von retinalen Querschnitte (12 µm dick) Parallel zur Temporonasal Achse durch den Sehnerv Kopf mit einem Kryostaten bei-20 ° C.</li>
	<li>Montieren Sie retinalen Abschnitte auf Mikroskop Folien53 und Store bei-80 ° C.</li>
</ol>(2) Immunostaining mit 5-mC und 5-HmC Antikörper
<ol><li>Umschließen Sie die Netzhaut Abschnitte auf Folien mit einem Stift hydrophobe Barriere montiert. Die hydrophobe Barriere Stift reduziert die Lautstärke des Antikörpers erforderlich, um das Gewebe zu färben.</li>
	<li>Waschen Sie die Netzhaut Abschnitte einmal mit 200 µL 1 X PBS 10 min. lang.</li>
	<li>Permeabilize der Netzhaut Abschnitte mit 200 µL 0.1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer (PBS-T) für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Denaturieren Sie retinalen Abschnitte für 30 min mit 200 µL frisch gemacht 2 N Salzsäure (HCl) und mit 1 X PBS-Puffer in einem Inkubator 37 ° C. Hinweis: Sorgfältige Titration von HCl Behandlung ist notwendig, um das 5mC Signal zu optimieren.</li>
	<li>Immer auch biologische Wiederholungen (3-4) bei gleichzeitiger Optimierung 5mC Signal54. Hinweis: Wir haben Antigen-Retrieval zu 4 Zeitpunkten (15 min, 30 min, 1 h und 2 h) und gefunden 30 min Inkubation ist optimal für 5mC Signal. Längere Inkubation mit HCl verschlechtert sich die Struktur der Atomkerne führt zur Unfähigkeit, 5mC Signal in den Zellkern zu lokalisieren.</li>
	<li>Nach Denaturierung, neutralisieren retinalen Abschnitte durch Zugabe von 100 µL der 0,1 M Tris-HCl (pH 8,3) auf Netzhaut Abschnitte 10 min. lang.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Abschnitte in 500 µL Lösung zu blockieren (5 % preimmune normalem ziegenserum in 0,1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer) für 1 h bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer.</li>
	<li>Fügen Sie nach der Blockierung, Anti-5mC; Anti-5hmC Antikörper verdünnt 1: 500 in blocking-Lösung für die Netzhaut Abschnitte.</li>
	<li>Inkubieren Sie der Netzhaut, die Abschnitte über bei 4 ° C in feuchten Kammer Nacht.</li>
	<li>Der nächste Tag waschen, retinale Abschnitte 3 mal (10-15 min jedes Mal) mit 0,1 % PBS-T und dann in blocking-Lösung mit den entsprechenden Sekundärantikörper inkubieren (Goat Anti-Kaninchen und Goat Anti-Maus IgG, verdünnt; 1: 1000), mit DAPI (4', 6 - Diamidino-2-Phenylindole) Lösung (1 µg/mL) bei Raumtemperatur für 1 h in blocking-Lösung. Hinweis: Vermeiden Sie Trocknen von Abschnitten in allen Phasen des Immunodetection.</li>
	<li>Waschen Sie die Folien drei Mal mit 1 mL 0,1 % PBS-T.</li>
	<li>Nach dem letzten waschen die Abschnitte mit wässrigen Eindeckmedium unter einem deckgläschen montieren und mit farblosen Nagellack versiegeln.</li>
</ol>(3) konfokale Immunohistochemistry
<ol><li>Richten Sie die Abschnitte die retinalen Pigment Epithel Seite des Optik-Cup immer mit Blick auf einen Weg (z. B. oben), für Konsistenz zu haben.</li>
	<li>Führen Sie Bilderfassung von Immunostained Netzhaut Abschnitte bei 63 X (Vergrößerung von einem Objektiv) mit 2 X oder 3 X zoom.</li>
	<li>Generieren Sie mehrere optische Abschnitte auf jedes ausgewählte Bild (Z-Stapel) in allen 3 Kanälen (rot, grün und blau, RGB) mit 0,35 µm Schritt. Hinweis: Die letzte Vergrößerung einer Probe bei 10-20 X visualisiert (Vergrößerung von einem Objektiv) werden 63 X, jeweils in Kombination mit einem (in der Regel verwendeten) 10-fach Okular. Visualisieren Sie komprimierte optische Stack um das 5mC und 5hmC Signal zu finden</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

DNA-Methylierung und Hydroxymethylation sind dynamisch und reversible DNA-Modifikationen, welche Modulatethe vielfältigen biologischen Mechanismen in einem Entwicklungsland ebenso wie in postmitotischen Zellen. Hier beschreiben wir eine reproduzierbare Technik zur Erfassung von 5mC und 5hmC DNA-Modifikationen in Situ durch immunhistochemische Technik (mit Anti-5mC und Anti-5hmC Antikörper) in Paraformaldehyd fixiert Gefrierschnitte Maus Netzhaut, und bieten Richtlinien für die Verbesserung und Standardisierung der Ergebnisse, vor allem, wenn mehrere verschiedene Proben zu vergleichen. Wir früher verwendet diese Methode, 5mC Veränderungen der Netzhaut Maus mit Netzhaut-spezifische Ausrichtung der Dnmt1, Dnmt3a und Dnmt3b DNA Methyltransferase Gene abzugrenzen, und berichtet von der (voraussichtlichen) Erschöpfung der 5mC Marken in ihre Netzhaut7 .
Der entscheidende Schritt in 5mC immunhistochemischen Nachweis ist die Optimierung der Behandlung von histologischen Schnitten mit HCl: weniger als 15 min Vorbehandlung voraussichtlich nicht reproduzierbaren Ergebnissen, während übermäßige Behandlung mit HCl die nukleare zerstört Architektur. Wir fanden beste Ergebnis nach 30 min Inkubation mit HCl. Wir empfehlen, immer frisch verdünnte HCl und frisch zubereiteten 4 % PFA Lösung für DNA Denaturierung und retinalen Gewebes Fixierung verwenden.
Um die Ergebnisse zu beheben, wird empfohlen, drei bis vier biologischen Wiederholungen bei gleichzeitiger Optimierung 5mC Signal aufzunehmen. Während jeder einzelne von Satz kann immunhistochemische Färbung leicht unterschiedliche Ergebnisse (mehr oder weniger hellen heterochromatischen Regionen), erzeugen die immunhistochemische Methode und der 5mC 5hmC nuklearen Verteilung innerhalb der einzelnen erwartet der Abschnitte werden voraussichtlich für sehr reproduzierbar sein, solange das Protokoll gefolgt ist.
Diese Technik hat auch Einschränkung, da wir konsequent Variabilität in 5mC Verteilung in der Photorezeptor Zellkerne innerhalb des gleichen Abschnitts zu beobachten. Wir fanden einige Kerne zeigte starke 5mC Signal während angrenzenden Zellkerne kein 5mC Signal zeigte. Dies ist aufgrund der Einschränkung in Demaskierung 5mC Antigen durch HCl Behandlung in Gefrierschnitte.
Die Bedeutung dieser Technik ermöglicht 5mC Lokalisierung ohne DNase und Proteinase K-Behandlung führt zu besseren Schutz der Chromocenters. Diese Technik ist robust auf alle Abschnitte von allen Wirbeltieren tierischen Geweben, tragenden 5mC, 5hmC Marken arbeiten und mit einen ähnlichen Ansatz, nicht nur Maus Netzhaut für verarbeitet, solange das Protokoll gefolgt ist.

Epigenetischen Regulation von Entwicklung und postmitotischen Homöostase der Maus Netzhaut ist ein spannender Bereich der Forschung, welche verspricht eine neuartige Verständnis der biologischen Mechanismen, die Steuerung von Retinogenesis und Zelle Schicksal Bestimmung, bringen Zelle typspezifischen Stoffwechselfunktionen sowie Zelle Pathologien, Zelltod und Regeneration1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Chromatin erfährt dynamische Veränderungen in der Entwicklung sowie als Reaktion auf Variable externe Signale, sei es stress, metabolischen oder Zelle Tod Reize6,14,15, 16 , 17 , 18. in Maus Kerne Chromatin gliedert sich in aktive Euchromatin und inaktive Heterochromatin6,19,20. In Interphase Nucleus wohnt Euchromatin im inneren Bereich des Kernes während Heterochromatin der nuklearen Peripherie und Nukleolus Linien. Dieses Muster wird als konventionelle und ist hoch konserviert in den Eukaryotes. Im Gegensatz dazu haben Stab Kerne in nachtaktive Tiere wie Maus und Ratte Muster invertiert, wo der Kern von Heterochromatin in der Mitte umgeben von Euchromatin bildet die äußerste Schale6,18besetzt ist, 20. Bei der Geburt haben die Rute Kerne konventionellen nuklearen Architektur. Umkehrung der Rute Kerne erfolgt während der Entwicklung durch Umbau von konventionellen und nuklearen Architektur. Während dieses Prozesses periphere Heterochromatin trennt von der nuklearen Peripherie und Chromocenters verschmelzen zu einer einzigen Chromocenter in der Mitte der Kern6,18.
Genomische DNA-Methylierung beteiligt sich bei der Kontrolle der lokalen Chromatin Konformation21. DNA-Methylierung tritt an der 5' Position von Cytosin Rückständen von CpG dinucleotid, die angereichert sind in der Promotorregion vieler Gene in der Maus Genome22,23,24,25,26 sowie in intergenetischer und Intron-Regionen, die regulatorische Elemente27tragen. Methylierung von CpG Inseln im proximalen Promotoren21,24 und CpG-Sequenzen in gen Enhancer27,28 ist wichtig bei der Regulation der dynamische Zustand des bivalenten Chromatin, mit vielen Developmental Gene/Transkription Faktoren spielen wichtige Rolle bei der Entwicklung, Krebs und Altern29,30,31,32,33,34 . DNA-Methylierung bei Maus Entwicklung35beteiligen sich drei DNA-Methyltransferasen (DNMTs). Alle drei DNMTs sind während Maus retinalen Entwicklung36 und Netzhaut-spezifische Änderungen in Dnmt Gene Auswirkungen retinalen Entwicklung2,7zum Ausdruck gebracht. Hydroxymethylcytosine (5hmC) resultiert oxidative Demethylierung 5-Methylcytosine (5mC). Die drei zehn-elf Translokation (TET) Enzyme beteiligt 5mC Demethylierung37,38,39. Hydroxymethyl-C Modifikation wird in Promotoren, gen Körpern und intergenetischer Genomsequenzen innerhalb gen reichen und aktiv transkribierten Regionen27,40bereichert.
Es gibt eine Vielzahl der beschriebenen Ansätze zur Bestimmung der veränderten Methylierungsmuster der DNA in Zellen41,42,43,44,45,46, einige davon ermöglichen Quantifizierung der globale Veränderungen der DNA-Methylierung, während andere mit Schwerpunkt auf präzise Änderungen in CpG-reiche Regionen Promotoren und Geschmacksverstärker. Methoden für die Erkennung und Quantifizierung von 5hmC wurden auch berichteten47, einschließlich von Immunohistochemistry13. Immunhistochemischen Techniken, die robuste Überwachung der 5mC und 5hmC Veränderungen in Kernen der Entwicklung ermöglichen und postmitotischen Zellen sind sehr informativ für die Abgrenzung Chromatin Dynamik in Situ in Reaktion auf externe oder interne Änderungen Auswirkungen auf die Zellen4,13,48,49. Dieser Ansatz ist jedoch anfällig für DNA-Methylierung und Hydroxymethylation Änderungen aufgrund technischer Probleme, verbunden mit Erkennung von Cytosin Änderungen in histologische Präparate zu unterschätzen. Deshalb, weil die unpolaren DNA-Datenbanken, einschließlich 5mC und 5hmC geändert Cytosin, in der Mitte der doppelsträngigen DNA-Helix50versteckt sind und erfordern entlarven. Dies ist eine besondere Herausforderung im gefrorenen histologische Präparate, die schnell informativ Organisation des ursprünglichen Gewebes verlieren können, wenn harte Behandlung angewendet wird.
Die Maus Netzhaut ist ein ausgezeichnetes Modell, den Beitrag der DNA-Methylierung neurale Entwicklung und postmitotischen Homöostase zu zergliedern. Es gibt nur 6 Arten von Neuronen (Stab und Zapfen-Photorezeptoren, amakrinen, Bipolarzellen, Horizontal "und" Ganglion), einem glialen Zelltyp (Muller Glia) und ein neuroepithelialer Zell-Typ (retinale Pigmentepithel)51. Netzhaut Zelltypen wurden berichtet, unterschiedliche Muster der DNA-Methylierung18,19, haben die vor kurzem bei Single-Base Auflösung1,5,9,12untersucht worden. Wir berichteten vor kurzem Immunohistochemistry Anwendung zur Abgrenzung 5mC Muster der Verteilung innerhalb der Kerne der netzhautzellen und Veränderungen in den Kernen der Erwachsenen Maus Netzhaut, wo alle drei DNA-Methyltransferasen durch bedingte gezielte entfernt wurden 7. im Vergleich zu einer Reihe von Berichten, wo das Vorhandensein von DNA-Methylierung in netzhautzellen konnte nur als positiv betrachtet werden oder negatives Signal in Hypermethylated Zellen in Apoptose, aktiviert unsere Vorgehensweise erkennen spezifische Chromatin Anordnung innerhalb der Netzhaut Zellkerne, die wir mehrere Gruppen berichtet und erläuterten5,6,7,18,19,36 , 52. hier beschreiben wir die immunhistochemische (IHC) Technik 5mC und 5hmC ebenso wie die Daten zeigen, die wir Ihnen aus unserer ursprünglichen Bericht7 reproduzieren konnten in gefrorenen Paraformaldehyd fixiert histologischen Abschnitten im Detail erkennen .

<table><tbody><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G1/2 ULTRA-FINE</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic Scissor</td><td>Fine Science tools, Inc.&nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Microslide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskop Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optische Schneidpaste (OCT)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR analytisch&nbsp;</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8,3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>Active Motif</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>AB16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Ziege Ameisen-Kaninchen IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Ziege Ameisen-Maus</td><td>IgG Jackson Immunoresearch</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunhistochemische nachweis von 5 methylcytosine und 5-hydroxymethylcytosine bei der entwicklung und der postmitotischen maus retina

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Die Epigenetik der retinalen Entwicklung ist eine gut untersuchte Forschungsfeld, das verspricht, bringen eine neue Ebene des Verständnisses über die Mechanismen der unterschiedlichsten menschlichen degenerativen Netzhauterkrankungen und neue Behandlungsansätze zu lokalisieren. Die nukleare Architektur der Maus Netzhaut gliedert sich in zwei verschiedenen Mustern: konventionelle und umgekehrt. Konventionellen Muster ist universell, wo Heterochromatin lokalisiert an der Peripherie des Zellkerns, während aktive Euchromatin im nuklearen inneren wohnt. Im Gegensatz dazu ist invertiert nuklearen Muster nur für die Erwachsenen Stab Photorezeptor Zellkerne Heterochromatin, das nukleare Zentrum lokalisiert, wobei Euchromatin befindet sich in der nuklearen Peripherie. DNA-Methylierung wird überwiegend im Chromocenters beobachtet. DNA-Methylierung ist eine dynamische kovalente Modifikation auf die Cytosin-Rückstände (5 Methylcytosine, 5mC) von CpG dinucleotid, die in den Regionen Förderer vieler Gene angereichert sind. Drei DNA-Methyltransferasen (DNMT1, DNMT3A und DNMT3B) in der Methylierung der DNA während der Entwicklung zu beteiligen. Erkennung von 5mC mit immunhistochemischen Techniken ist eine große Herausforderung, einen Beitrag zur Variabilität der Ergebnisse, da alle DNA-Basen, einschließlich 5mC geändert Basen innerhalb der doppelsträngigen DNA-Helix verborgen sind. Detaillierte Darstellung der 5mC Verteilung während der Entwicklung ist jedoch sehr informativ. Hier beschreiben wir eine reproduzierbare Technik für robuste immunhistochemischen Nachweis von 5mC und eine weitere epigenetische DNA-Marker 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC), die mit der "offenen", transcriptionally aktiv Chromatin bei der Entwicklung von colocalizes und postmitotischen Maus Netzhaut.

Um die Verteilung von 5-Methylcytosine (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) während der retinalen Entwicklung und in postmitotischen Netzhaut bestimmen wir Immunostained C57BL/6J Maus retinalen Abschnitt von E16, P0, P15 und P90 mit spezifischen Antikörpern nach 5mC und 5hmC.
E16 war die 5mC Färbung stark in Chromocenters von den Zellkernen während schwache Färbung in der gesamten Zellkerne (Abbildung 1a) beobachtet wurde. Die 5hmC Färbung beschränkte sich auf die Zellkerne und abwesend war von der Chromocenters (Abb. 1 b).
In P0 Netzhaut wurde das 5mC-Signal an den Chromocenters der Zellkerne und nukleare Peripherie (Abb. 2a, Pfeil und Pfeilspitze) lokalisiert. Wir beobachteten auch schwache Färbung des 5mC zwischen den Chromocenters der Zellkerne. Das 5hmC-Signal war stark in den Zellkernen mit Ausnahme der Chromocenters (Abb. 2 b). Wir fanden, dass mehr Kerne mit 5mC und 5hmC im Inneren Neuroblast Schicht (INBL) (Abbildung 2 c, gepunktete Linie) gefärbt sind
P15 Netzhaut fanden wir starke Färbung des 5mC und 5hmC in nuklearen Außenschicht (ONL), nukleare Innenschicht (INL) und Ganglion Zellschicht (GCL) (Abbildung 3). Im ONL (Stab Photorezeptoren) war das 5mC Signal in den Chromocenters der Zellkerne und nukleare Peripherie (Abbildungen 3a-3 c, 3 g). Das 5hmC-Signal wurde in der gesamten Zellkerne mit Ausnahme der Chromocenters (Figuren 3d-3f) gefunden. Die Transmissions-Elektronenmikroskopie getan auf P15 Netzhaut zeigt die Verteilung der heterochromatischen Domänen im Stab Zellkerne ähnlich wie mit 5mC Antikörper Signal (Abbildungen 3 h und 3i).
Die 5mC Färbung im INL und GCL war stark in der Chromocenters der Zellkerne und schwache Färbung wurde auch im ganzen Zellkerne (Zahlen 3j-3 l und 3r-3 t) beobachtet. Im Gegensatz zu 5mC wurde das 5hmC Signal an die ganze Zellkerne mit Ausnahme der Chromocenters in INL und GCL (Zahlen 3 m-3o und 3u-3w) lokalisiert. Wir beobachteten starken 5hmC Signal an der Peripherie der GCL Zellkerne.
In Erwachsenen Stab Photorezeptoren war das 5mC Signal auf die Chromocenter und nukleare Peripherie der Zellkerne (Abbildungen 4a-4 c) beschränkt, während 5hmc Signal an die nuklearen Peripherie (Abbildungen 4 d-4f) beschränkt war.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg"> Abbildung 1. Lokalisierung von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine in Maus Netzhaut an embryonalen Tag 16. Immunostaining C57BL/6J Netzhaut mit Antikörpern gegen 5mC (rot (a) und 5hmC (grün, b). E16 ist 5mC Signal sehr stark in Chromocenters von den Zellkernen und auch in der gesamten Zellkerne auf deutlich niedrigerem Niveau vorhanden. 5hmC Färbung beschränkte sich ausschließlich auf die Zellkerne. Panel-c steht für zusammengeführte 5mC und 5hmC Bild. Kerne sind mit DAPI (blau, c) counterstained. Einsätze sind Vergrößerung des Bereichs mit Sternchen in den Bildern gezeigt. Maßstab: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg"> Abbildung 2. Immunhistochemische Färbung des 5-Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine in Maus Netzhaut auf postnatale Tag 0. Immunolabeling der C57BL/6J Netzhaut mit Antikörpern gegen 5mC (rot (a) und 5hmC (grün, b). In P0 Netzhaut sind 5mC und 5hmC in äußeren Neuroblast Schicht (ONBL) und innere Neuroblast Schicht (INBL). (a) 5mC Signal ist stark in die Chromocenters (Pfeil) und nukleare Peripherie der Zellkerne (Pfeilspitze). Schwache Färbung des 5mC wird auch zwischen den Chromocenters von Zellkernen beobachtet. (b) 5hmC Färbung beschränkt sich auf den Zellkern und starkes Signal in INBL (gestrichelte Linie im Panel c) eingehalten wird. Panel-c steht für zusammengeführte 5mC und 5hmC Bild. Kerne sind mit DAPI (blau, c) counterstained. Einsätze sind Vergrößerung des Bereichs mit Sternchen in den Bildern gezeigt. Maßstab: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg"> Abbildung 3. 5-Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine Verteilung in Maus Netzhaut postnatale Tag 15. Immunostaining C57BL/6J Netzhaut mit Anti-5mC und 5hmC Antikörper (a-g, j-y). In nuklearen Außenschicht (ONL) (Stab Photorezeptoren), 5mC Signal (rot, (a) in der Regel deckt sich mit den Chromocenters der Zellkerne (Pfeilspitze, b) und auch an die nuklearen Peripherie (Pfeil, b) lokalisiert. Gruppe b (rot) und c (grau) repräsentieren Vergrößerung des Bereichs mit Sternchen in der Abbildung gezeigt ein. Das 5hmC-Signal (grün, d) beschränkt sich auf die gesamte Zellkerne mit Ausnahme der Chromocenters. Gruppe e (grün) und f (grau) repräsentieren Vergrößerung des Bereichs gezeigt in Bild d. Panel mit Sternchen, g zusammengeführten 5mC und 5hmC Bild darstellt. Kerne sind mit DAPI counterstained. H und ich sind Übertragung elektronenmikroskopische Aufnahme der Photorezeptor Kerne postnatale 15.Tag zeigt Verteilung von heterochromatischen Domains. Schwarze Pfeilspitze im Panel h verweist auf einzelne Rute Photorezeptor Kern im Panel i. erweitert roten Pfeilspitzen im Bedienfeld ", die ich auf heterochromatischen Domänen innerhalb Stab Photorezeptor Kern verweisen, während rote Pfeile auf Heterochromatin in der nuklearen Peripherie. In INL (j-Q) und GCL Zellkerne (R-y) das 5mC-Signal (rot) ist auf der Chromocenters in der Peripherie vorhanden lokalisiert und schwache Färbung wird auch in den Rest der Zellkerne erkannt. Gruppe k (rot) und ich (grau) vertreten Vergrößerung des Bereichs in der Bild-j mit Sternchen angezeigt. Die 5hmC Färbung (grün) im INL und GCL Zellkerne beschränkt sich auf den gesamten Zellkern. Beachten Sie die starke 5hmC Färbung in der nuklearen Peripherie der GCL Zellen. Panel p und x stellen zusammengeführte 5mC und 5hmC Bild, während Panel Q und y Vergrößerung der Fläche mit Sternchen im Bild p und x bzw. darstellen. Kerne sind mit DAPI counterstained. Maßstab: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg"> Abbildung 4. 5-Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine Distribution in Stab Photorezeptor Kernen C57BL/6J Maus Netzhaut bei postnatalen Tag 90. Die 5mC Färbung (rot, ein) ist in der Chromocenter der Zellkerne und auch schwach Gegenwart in der nuklearen Peripherie stark vertreten. Gruppe b (rot) und c (grau) repräsentieren Vergrößerung des Bereichs mit Sternchen in der Abbildung gezeigt ein. Die 5hmC Färbung (grün, d) beschränkt sich ausschließlich auf die nukleare Peripherie Panel e (grün) und f (grau) repräsentieren Vergrößerung des Bereichs gezeigt in Bild d. Panel mit Sternchen, g zusammengeführten 5mC und 5hmC Bild beim Panel h darstellt ist die Vergrößerung der Fläche mit Sternchen Sie in das Bild, das g. Kerne mit DAPI (blau) counterstained sind. Maßstab: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Das Ziel dieses Berichts ist es, das Protokoll für robuste immunhistochemischen Nachweis von epigenetischen Markierungen beschreiben, 5-Methylcytosine (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) bei der Entwicklung und postmitotischen Maus Netzhaut.

Immunhistochemische Nachweis von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine bei der Entwicklung und der postmitotischen Maus Retina

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der DNA-Methylierung zu beantworten, wie z. B. Veränderungen des Chromatins während der Netzhautentwicklung in der postmitotischen Netzhaut. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie robust auf alle Schnitte aus allen Netzhautgeweben der Maus angewendet werden kann, die eine 5-Methylcytosin- und 5-Hydroxymethylcytosin-Verteilung tragen, die in einem ähnlichen Ansatz verarbeitet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Gewebevorbereitung und -färbung schwer zu erlernen sind, da bei der Verwendung von gefrorenen histologischen Präparaten wertvolles organisatorisches und ursprüngliches Gewebe verloren gehen kann.Den Rest des Verfahrens wird Pablo Diaz, wissenschaftlicher Mitarbeiter aus unserem Labor, vorführen. Um diesen Vorgang zu starten, verwenden Sie eine 29 Gauge 1/2 Inch Nadel, um die Augen einer geköpften, eingeschläferten Maus auf der dorsalen Seite der Augen zu punktieren. Um Augenmuscheln zu erhalten, entkernen Sie sofort die Augen, indem Sie mit einer feinen Augenschere um die Sklera herum schneiden, um die Hornhaut und die Linse zu entfernen.Fixieren Sie die Augenmuscheln und E16 ganze Augen in 4%Paraformaldehyd oder PFA in 1xPBS pH 8,0 für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie sie zweimal in einem Milliliter 1xPBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Um die Augenmuscheln und ganzen Augen zu kryoschützen, inkubieren Sie sie in 1xPBS pH 8,0 mit 10% Saccharose bei Raumtemperatur für eine Stunde.Dann in 20%Saccharose in 1xPBS für eine Stunde. Und schließlich in 30%Saccharose in 1xPBS bei 4 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag betten Sie die Augenmuscheln und Augen in Kryoformen in eine Mischung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) ein.Dann frieren Sie sie in einem Trockeneis-Ethanol-Bad ein und bewahren sie bei 80 Grad Celsius auf. Entfernen Sie vor Beginn der Kryosektion die Formen mit eingebetteten Augenmuscheln und Augen aus 80 Grad Celsius. Legen Sie sie in einen Kryostatenhalter und lassen Sie sie eine Stunde lang auf 20 Grad Celsius äquilibrieren.Schneiden Sie mit einem Kryostaten bei 20 Grad Celsius 12 Mikrometer dicke Netzhautquerschnitte parallel zur Schläfenachse durch den Sehnervenkopf. Montieren Sie die Schnitte auf Objektträger und lagern Sie sie bei 80 Grad Celsius. Um mit der Immunfärbung zu beginnen, verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um die Netzhautschnitte zu umgeben, die auf Objektträgern montiert sind.Waschen Sie die Abschnitte einmal mit 200 Mikrolitern 1xPBS für 10 Minuten. Permeabilisieren Sie die Schnitte mit 200 Mikrolitern PBST für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Denaturieren Sie sie dann mit 200 Mikrolitern frisch hergestellter, sorgfältig titrierter 2 normaler Salzsäure in 1xPBS für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius, um das 5mC-Signal zu optimieren.Nach der Denaturierung 100 Mikroliter 0,1 Tris-HCl pH 8,3 auf die Netzhautschnitte geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um sie zu neutralisieren. Fügen Sie dann 500 Mikroliter Blockierungslösung hinzu. Und inkubieren Sie die Schnitte in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für eine Stunde.Geben Sie die entsprechenden Antikörper, verdünnt um eins bis 500 in Blockierungslösung, zu den Schnitten und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am Folgetag die Abschnitte dreimal für je 10 bis 15 Minuten mit 0,1 % PBST waschen. Fügen Sie geeignete Sekundärantikörper hinzu, verdünnt von eins bis 1000 in einer Blockierungslösung, die DAPI-Lösung enthält, bei Raumtemperatur für eine Stunde.Waschen Sie die Objektträger anschließend dreimal mit einem Milliliter 0,1%PBST für jeweils 10 Minuten. Nach der letzten Wäsche wässriges Eindeckmittel hinzufügen. Abdeckung mit Deckglas.Und dann fahren Sie mit der konfokalen Mikroskopie fort. Nach retinaler Immunfärbung an E16 war das 5mC-Signal in den Chromozentren der Zellkerne stark und in den gesamten Zellkernen auf einem viel niedrigeren Niveau vorhanden. Die 5hmC-Färbung wurde ausschließlich in den Zellkernen gefunden und fehlte in den Chromozentren.In der P0-Netzhaut waren sowohl 5mC- als auch 5hmC-Signale in der äußeren Neuroblastenschicht und in der inneren Neuroblastenschicht vorhanden. Das 5mC-Signal war in den Chromozentren und der Kernperipherie der Zellkerne stark und zwischen den Chromozentren der Zellkerne schwächer. Die 5hmC-Färbung war auf den Zellkern beschränkt.In der P15-Netzhaut, in der äußeren Kernschicht, wurde das 5mC-Signal in den Chromozentren der Zellkerne und der Kernperipherie nachgewiesen. Während das 5hmC-Signal in den gesamten Zellkernen mit Ausnahme der Chromozentren vorlag. In der inneren Kern- und Ganglienzellschicht war das 5mC-Signal in den Chromozentren der Zellkerne stark und in den ganzen Zellkernen schwach.Während das 5hmC-Signal in den gesamten Zellkernen mit Ausnahme der Chromozentren gefunden wurde. In adulten Stäbchen-Photorezeptoren war das 5mC-Signal auf das Chromozentrum und die nukleäre Peripherie beschränkt, während das 5hmC-Signal auf die nukleare Peripherie beschränkt war. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, histologische Schnitte mit der optimalen Exposition von HCl zu behandeln, die 30 Minuten beträgt.Wenn die Belichtung geringer oder höher ist, können optimale Ergebnisse nicht reproduzierbar sein. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die Hochdruckflüssigkeitschromatographie und die Massenspektrometrie, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Quantifizierung von Veränderungen bei der Messung von 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der neuronalen Entwicklung, um epigenetische Veränderungen des Chromatins zu erforschen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit HCl und PFA äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. die ordnungsgemäße Entsorgung, getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die EpiMark 5-HMC und 5-mC Analysis Kit kann verwendet werden, um zu analysieren und zu quantifizieren 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin innerhalb einer spe cific locus werden. Das Kit unterscheidet 5-mC von 5-HMC von der Zugabe von Glucose an die Hydroxylgruppe von 5-HMC über eine enzymatische Reaktion unter Verwendung von β-glucosyltransferase (T4-BGT). Als 5-HMC im Rahmen der CCGG auftritt, wandelt diese Modifikation eines spaltbaren MspI Ort zu einer nicht-spaltbare Website.

Hohe Empfindlichkeit 5-Hydroxymethylcytosin Erkennung in Balb / C Gehirngewebe

Beschrieben wird ein zweistufiges Verfahren unter Verwendung Kennzeichnung β-Glucosyltransferase (β-GT), um ein Azid-Glukose zu 5-HMC übertragen, gefolgt von Klickchemie einen Linker Biotin für die einfache und dichteunabhängigen Anreicherung zu übertragen. Dieses effiziente und spezifische Kennzeichnung Methode ermöglicht die Anreicherung von 5-HMC mit extrem niedrigen Hintergrund und hohem Durchsatz epigenomischen Mapping über Next-Generation-Sequenzierung.

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Immunhistochemische Nachweis von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine bei der Entwicklung und der postmitotischen Maus Retina (Video) | JoVE Journal

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