Immunhistochemische Nachweis von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine bei der Entwicklung und der postmitotischen Maus Retina

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der DNA-Methylierung zu beantworten, wie z. B. Veränderungen des Chromatins während der Netzhautentwicklung in der postmitotischen Netzhaut. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie robust auf alle Schnitte aus allen Netzhautgeweben der Maus angewendet werden kann, die eine 5-Methylcytosin- und 5-Hydroxymethylcytosin-Verteilung tragen, die in einem ähnlichen Ansatz verarbeitet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Gewebevorbereitung und -färbung schwer zu erlernen sind, da bei der Verwendung von gefrorenen histologischen Präparaten wertvolles organisatorisches und ursprüngliches Gewebe verloren gehen kann.

Den Rest des Verfahrens wird Pablo Diaz, wissenschaftlicher Mitarbeiter aus unserem Labor, vorführen. Um diesen Vorgang zu starten, verwenden Sie eine 29 Gauge 1/2 Inch Nadel, um die Augen einer geköpften, eingeschläferten Maus auf der dorsalen Seite der Augen zu punktieren. Um Augenmuscheln zu erhalten, entkernen Sie sofort die Augen, indem Sie mit einer feinen Augenschere um die Sklera herum schneiden, um die Hornhaut und die Linse zu entfernen.

Fixieren Sie die Augenmuscheln und E16 ganze Augen in 4%Paraformaldehyd oder PFA in 1xPBS pH 8,0 für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie sie zweimal in einem Milliliter 1xPBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Um die Augenmuscheln und ganzen Augen zu kryoschützen, inkubieren Sie sie in 1xPBS pH 8,0 mit 10% Saccharose bei Raumtemperatur für eine Stunde.

Dann in 20%Saccharose in 1xPBS für eine Stunde. Und schließlich in 30%Saccharose in 1xPBS bei 4 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag betten Sie die Augenmuscheln und Augen in Kryoformen in eine Mischung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) ein.

Dann frieren Sie sie in einem Trockeneis-Ethanol-Bad ein und bewahren sie bei 80 Grad Celsius auf. Entfernen Sie vor Beginn der Kryosektion die Formen mit eingebetteten Augenmuscheln und Augen aus 80 Grad Celsius. Legen Sie sie in einen Kryostatenhalter und lassen Sie sie eine Stunde lang auf 20 Grad Celsius äquilibrieren.

Schneiden Sie mit einem Kryostaten bei 20 Grad Celsius 12 Mikrometer dicke Netzhautquerschnitte parallel zur Schläfenachse durch den Sehnervenkopf. Montieren Sie die Schnitte auf Objektträger und lagern Sie sie bei 80 Grad Celsius. Um mit der Immunfärbung zu beginnen, verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um die Netzhautschnitte zu umgeben, die auf Objektträgern montiert sind.

Waschen Sie die Abschnitte einmal mit 200 Mikrolitern 1xPBS für 10 Minuten. Permeabilisieren Sie die Schnitte mit 200 Mikrolitern PBST für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Denaturieren Sie sie dann mit 200 Mikrolitern frisch hergestellter, sorgfältig titrierter 2 normaler Salzsäure in 1xPBS für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius, um das 5mC-Signal zu optimieren.

Nach der Denaturierung 100 Mikroliter 0,1 Tris-HCl pH 8,3 auf die Netzhautschnitte geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um sie zu neutralisieren. Fügen Sie dann 500 Mikroliter Blockierungslösung hinzu. Und inkubieren Sie die Schnitte in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur für eine Stunde.

Geben Sie die entsprechenden Antikörper, verdünnt um eins bis 500 in Blockierungslösung, zu den Schnitten und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am Folgetag die Abschnitte dreimal für je 10 bis 15 Minuten mit 0,1 % PBST waschen. Fügen Sie geeignete Sekundärantikörper hinzu, verdünnt von eins bis 1000 in einer Blockierungslösung, die DAPI-Lösung enthält, bei Raumtemperatur für eine Stunde.

Waschen Sie die Objektträger anschließend dreimal mit einem Milliliter 0,1%PBST für jeweils 10 Minuten. Nach der letzten Wäsche wässriges Eindeckmittel hinzufügen. Abdeckung mit Deckglas.

Und dann fahren Sie mit der konfokalen Mikroskopie fort. Nach retinaler Immunfärbung an E16 war das 5mC-Signal in den Chromozentren der Zellkerne stark und in den gesamten Zellkernen auf einem viel niedrigeren Niveau vorhanden. Die 5hmC-Färbung wurde ausschließlich in den Zellkernen gefunden und fehlte in den Chromozentren.

In der P0-Netzhaut waren sowohl 5mC- als auch 5hmC-Signale in der äußeren Neuroblastenschicht und in der inneren Neuroblastenschicht vorhanden. Das 5mC-Signal war in den Chromozentren und der Kernperipherie der Zellkerne stark und zwischen den Chromozentren der Zellkerne schwächer. Die 5hmC-Färbung war auf den Zellkern beschränkt.

In der P15-Netzhaut, in der äußeren Kernschicht, wurde das 5mC-Signal in den Chromozentren der Zellkerne und der Kernperipherie nachgewiesen. Während das 5hmC-Signal in den gesamten Zellkernen mit Ausnahme der Chromozentren vorlag. In der inneren Kern- und Ganglienzellschicht war das 5mC-Signal in den Chromozentren der Zellkerne stark und in den ganzen Zellkernen schwach.

Während das 5hmC-Signal in den gesamten Zellkernen mit Ausnahme der Chromozentren gefunden wurde. In adulten Stäbchen-Photorezeptoren war das 5mC-Signal auf das Chromozentrum und die nukleäre Peripherie beschränkt, während das 5hmC-Signal auf die nukleare Peripherie beschränkt war. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, histologische Schnitte mit der optimalen Exposition von HCl zu behandeln, die 30 Minuten beträgt.

Wenn die Belichtung geringer oder höher ist, können optimale Ergebnisse nicht reproduzierbar sein. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die Hochdruckflüssigkeitschromatographie und die Massenspektrometrie, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Quantifizierung von Veränderungen bei der Messung von 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der neuronalen Entwicklung, um epigenetische Veränderungen des Chromatins zu erforschen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit HCl und PFA äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. die ordnungsgemäße Entsorgung, getroffen werden sollten.