Name: Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Erfahren Sie die differenzierte Herstellung von Hornhaut-Limbus-Epithel-Stammzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen ohne Feederzellen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Produktion klinisch verwendbarer Zellen für regenerative Therapien.

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Die Studie wurde unterstützt durch die Akademie von Finnland (Grant-Nummer 297886), das menschliche Ersatzteile-Programm von Tekes, Finnish Funding Agency für Technologie und Innovation, die finnische Augen- und Gewebe-Bank-Stiftung und der finnischen Kulturstiftung. Die Autoren danken die biomedizinischen Laboranten Outi Melin, Hanna Pekkanen und Emma Vikstedt Outi Heikkilä für hervorragende technische Unterstützung und Beitrag zur Zellkultur. Professor Katriina Aalto-Setälä ist anerkannt für die Bereitstellung der HiPSC Linie verwendet und BioMediTech Imaging Core Facility für die Bereitstellung von Ausrüstung für die Fluoreszenz-Bildgebung.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das erwartete Ergebnis dieses Protokolls ist die erfolgreiche und robuste Generation der LESCs aus einer einzigen Zelle Aussetzung der FF hPSC innerhalb von ca. 3,5 Wochen. Hornhaut-Epithel von der Oberfläche Ektoderm29entwickelt, soll der erste Schritt des Protokolls Lenkung hPSCs gegenüber dieser Linie. Eine kurze 24 h Induktion mit Umwandlung von Wachstumsfaktor-Beta (TGF-β)-Antagonist SB-505124 und bFGF werden verwendet, um ektodermalen Differenzierung, gefolgt von 48 h mesodermalen BMP-4 Cue,...

Die durchsichtige Hornhaut an der Augenoberfläche ermöglicht Licht in die Netzhaut und die Mehrheit der Brechkraft des Auges. Die äußerste Schicht, die geschichtete Hornhaut-Epithel wird kontinuierlich vom limbischen epithelialen Stammzellen (LESCs) regeneriert. Die LESCs befinden sich in der basalen Schicht der limbischen Nischen an der Corneoscleral Kreuzung1,2. LESCs fehlen spezifische und einzigartige Marker, so dass ihre Identifikation eine umfassendere Analyse eines Satzes von vermeintlichen Marker erfordert. Epitheliale Transkription Faktor p63 und vor allem N-Terminal verkürzten Abschrift der alpha Isoform von p63 (ΔNp63α), wurde vorgeschlagen, als eine entsprechende positive LESC Marker3,4. Asymmetrische Teilung der LESCs ermöglicht es ihnen, selbst zu erneuern, sondern auch produzieren nachkommen, die centripetally und anterior zu migrieren. Wie die Zellen die Fortschritte in Richtung der Hornhautoberfläche sie allmählich verlieren ihre Stemness und schließlich unheilbar differenzieren zu oberflächlichen Plattenepithelzellen, die kontinuierlich von der Hornhautoberfläche verloren gehen.
Schäden die Hornhautschichten kann zu schweren Sehbehinderungen führen und Hornhaut Mängel sind somit eine der häufigsten Todesursachen weltweit Verlust der Sehkraft. Im limbischen Stammzell-Mangel (LSCD) ist der Limbus zerstört, durch Krankheit oder Trauma führt zu Conjunctivalization und getrübten der Hornhautoberfläche und folgenden Verlust von Vision5,6. Handy-Ersatz-Therapie mit autologen oder allogenen limbisches Transplantate bietet eine Behandlungsstrategie für Patienten mit LSCD4,7,8,9. Jedoch Ernte autologe Transplantate birgt ein Risiko von Komplikationen für das gesunde Auge und Spendergewebe ist Mangelware. Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), spezifisch humanen embryonalen Stammzellen (HES) und menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs), kann als eine unbegrenzte Quelle von klinisch relevante Zelltypen, einschließlich der Hornhaut Epithelzellen dienen. HPSC abgeleitet LESCs (hPSC-LESCs) stellen daher eine attraktive neue Zelle Quelle für okuläre Zellersatztherapie.
Bisher haben die undifferenzierte hPSC Kulturmethoden und ihrer Differenzierung Protokolle zum LESCs über den Einsatz von undefinierten Feeder-Zellen, tierischen Seren, konditionierte Medien oder amniotic Membranen10,11, verlassen 12 , 13 , 14 , 15. vor kurzem Bemühungen in Richtung sicherer Zelle Therapie Produkte haben dazu veranlasst, die Suche nach mehr standardisierte und Xeno-freie Kultur und Differenzierung-Protokolle. Infolgedessen sind mehrere definierte und Xeno-freie Methoden für langfristige Kultur der undifferenzierten hPSCs jetzt handelsüblichen16,17,18. Als ein Kontinuum, gezielte Differenzierung, die Protokolle unter Berufung auf molekulare Signale zu hPSCs Hornhaut epithelialen Schicksal führen in letzter Zeit haben19,20,21,22eingeführt, 23. Doch verwendet viele dieser Protokolle entweder nicht definiert, Feeder-basierte hPSCs als ab Material oder komplexe, xenogene Wachstumsfaktor Cocktails zur Differenzierung.
Dieses Protokoll soll eine robuste, optimierte, Xeno bieten- und Feeder-freie hPSC Kultur-Methode und anschließende Differenzierung zu Hornhaut LESCs. Monolayer Kultur der pluripotenten hPSCs auf Laminin-521 (LN-521) Matrix in definierten, Albumin-freie hPSC Medium (speziell wichtig 8 Flex) ermöglicht schnelle Herstellung von homogenen Ausgangsmaterial für Differenzierungen. Danach führt eine einfache zweistufige Differenzierungsstrategie hPSCs in Richtung Oberfläche ektodermalen Schicksal in der Schwebe, gefolgt von anhaftenden Differenzierung zu LESCs. Eine Zellpopulation wo express > 65 % ΔNp63α wird innerhalb von 24 Tagen gewonnen. Das Xeno und Feeder-frei-Protokoll wurde mit mehreren hPSC Linien (hESC und HiPSCs), ohne jede Anforderung für Zelle Linie gezielte Optimierung getestet. Die Protokolle für Wochenende-freie Wartung, Passagierung, Cryostoring und hPSC LESC Phänotypisierung hier beschriebenen ermöglichen die Produktion von Großserien von qualitativ hochwertigen LESCs für klinische oder wissenschaftliche Zwecke.

<table><tbody><tr><td>Material/Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS mit Ca2+ und Mg2+</td><td>Gibco</td><td>#14040-091</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS ohne Ca2+ und Mg2+</td><td>Lonza</td><td>#17-512F/12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Zellkulturschale</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3296</td><td>Kulturgefäßformat für adhärentes hPSC-LESC Differenzierung</td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3336</td><td>Kulturgefäßformat für IF-Proben</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3337</td><td>Kulturgefäßformat für IF-Proben</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>#31350-010</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte, Ultra-Low attachment</td><td>Corning Costar</td><td>#3471</td><td>Kulturgefäßformat für Induktion in Suspension Kultur</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Maus Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21202</td><td>Sekundärantikörper gegen IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen</td><td>Ig ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21206</td><td>Sekundärantikörper gegen IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anti-Ziege</td><td>Ig ThermoFisher Scientific</td><td>#A-11057</td><td>Sekundärantikörper für IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anti-Maus Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-10037</td><td>Sekundärantikörper gegen IF</td></tr><tr><td>Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, human)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#AF-100-18B</td><td>tierversuchsfrei rekombinant humane FGF-basisch (154 a.a.)</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixierungs-/Permeabilisierungslösung</td><td>BD Biosciences</td><td>#554722</td><td>Fixierungs- und Permeabilisierungslösung für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>#554723</td><td>Waschpuffer für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#B0560</td><td></td></tr><tr><td>Knochenmorphogenetisches Protein 4 (BMP-4)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#120-05A</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A8022-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin 12 Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#SC-17099</td><td>Primärer Antikörper für IF</td></tr><tr><td>Cytokeratin 14 Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>#MAB3164</td><td>Primärer Antikörper für IF</td></tr><tr><td>Cytokeratin 15 Antikörper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#MS-1068-P</td><td>Primärer Antikörper für IF</td></tr><tr><td>CnT-30</td><td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td><td>#Cnt-30</td><td>Kulturmedium für adhärente hPSC-LESC Differenzierung</td></tr><tr><td>Kollagen Typ IV (human)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5533</td><td>Humanes Plazentakollagen Typ IV</td></tr><tr><td>CoolCell LX Gefrierbehälter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure Röhrchen</td><td>Sarsted</td><td>#72.380</td><td>1,6 mL Kryoröhrchen für die Kryokonservierung von hPSC-LESC</td></tr><tr><td>Definierter Trypsin-Inhibitor</td><td>Gibco</td><td>#R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex Medium Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2858501</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>#35050061</td><td></td></tr><tr><td>Laminin 521</td><td>Biolamina</td><td>#Ln521</td><td>Humanes rekombinantes Laminin 521</td></tr><tr><td>&Delta; Np63&alpha; Antikörper</td><td>BioCare Medical</td><td>#4892</td><td>Primärer Antikörper für IF</td></tr><tr><td>OCT3/4 Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>#AF1759</td><td>Primärer Antikörper für IF</td></tr><tr><td>p63&alpha; Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#ACI3066A</td><td>Primärer Antikörper für IF</td></tr><tr><td>p63-&alpha; (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE-Konjugat)</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>#56687</td><td>p63-&alpha; PE-konjugierter Antikörper für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>PAX6-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HPA030775</td><td>Primärer Antikörper für IF</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Lonza</td><td>#17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td>Zellfixiermittel für IF</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Eindeckmittel mit DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#P36931</td><td>DAPI Eindeckmittel für harte Halterung für IF</td></tr><tr><td>PSC Kryokonservierungskit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A2644601</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzym</td><td>Gibco</td><td>#12563-011</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium</td><td>Gibco</td><td>#10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut SR XenoFree CTS</td><td>Gibco</td><td>#10828028</td><td></td></tr><tr><td>MEM nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Gibco</td><td>#11140050</td><td></td></tr><tr><td>SB-505124</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S4696</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T8787</td><td>Permeabilisierungsmittel für IF</td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>#H-1200</td><td>DAPI Eindeckmittel für flüssige Einbettung für IF</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zytozentrifuge, z.B. CellSpin II</td><td>Tharmac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer, z.B. BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop, z.B. Olympus IX 51</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effiziente und skalierbare gerichtete differenzierung von klinisch kompatibel hornhaut limbischen epithelialen stammzellen aus menschlichen pluripotenten stammzellen

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen (LESCs) sind verantwortlich für das Hornhaut-Epithel kontinuierlich erneuert und damit die Aufrechterhaltung Hornhaut Homöostase und visuelle Klarheit. Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete LESCs bieten eine viel versprechende Zelle Quelle für Hornhaut Zellersatztherapie. Undefiniert, xenogene Kultur und Differenzierung Bedingungen verursachen Variation in Forschungsergebnisse und behindern die klinische Übersetzung hPSC abgeleitet Therapeutika. Dieses Protokoll bietet eine reproduzierbare und effiziente Methode für hPSC LESC Differenzierung unter Xeno und Feeder zellfreie Bedingungen. Erstens dient Monolayer Kultur der undifferenzierten hPSC auf rekombinante Laminin-521 (LN-521) und definierte hPSC Medium als Grundlage für stabile Produktion von qualitativ hochwertige Ausgangsmaterial für Differenzierungen. Zweitens ergibt eine schnelle und einfache hPSC LESC Differenzierung Methode LESC Populationen in nur 24 Tagen. Diese Methode beinhaltet eine viertägige Oberfläche ektodermalen Induktion in der Schwebe mit kleinen Molekülen, gefolgt von anhaftenden Kultur Phase auf LN-521/Kollagen IV Kombination Matrix in definierten Hornhaut epithelialen Differenzierung Medium. Cryostoring und erweiterte Differenzierung weiter reinigt die Zellpopulation und Banken der Zellen in großen Mengen für Zelle Therapie Produkte ermöglicht. Die daraus resultierende qualitativ hochwertige hPSC-LESCs bieten eine potenzielle neue Behandlungsstrategie für Hornhaut Flächenrückführung, limbisches Stammzell-Mangel (LSCD) zu behandeln.

Von hPSCs, hPSC-LESCs
Der gesamte Prozess von Induktion Differenzierung der FF hPSCs, Cryostoring hPSC-LESCs dauert ca. 3,5 Wochen. Schematische Übersicht über die Differenzierung-Methode, die Hervorhebung der wichtigsten Schritte ist in Figur 1Apräsentiert. Abbildung 1 b zeigt typische Morphologien der Zell-Populationen in verschiedenen Phasen des Protokolls. Die vorgeleg...

Dieses Protokoll stellt eine einfache zweistufige Methode zur Differenzierung von Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Xeno und Feeder zellfreie Kulturbedingungen. Die Zelle Kulturmethoden hier vorgestellten ermöglichen kosteneffiziente, groß angelegte Produktion von klinische Qualität Zellen auf Hornhaut Zelle Therapie Verwendung anwendbar.

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Dieses Protokoll führte eine definierte zellfreie Methode zur Differenzierung von kornealen limbalen Epithelstammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen ein. Limbalepitheliale Stammzellen sind verantwortlich für die Erneuerung des Hornhautepithels im gesunden Auge. Schäden an diesen Zellen führen zu einem Zustand, der als limbaler Stammzellmangel bekannt ist, und zum Verlust der Hornhautklarheit.Die hier gezeigten Zellkulturmethoden ermöglichen eine effiziente Produktion von limbalepitheliaalen Stammzellen für zukünftige Hornhautzellersatztherapien. Um die im Textprotokoll beschriebene zu beginnen, zu durchgehen und zu pflegen, wird die zubringerfreie menschliche pluripotente Stammzellkultur beibehalten. Achten Sie darauf, nur hochwertige menschliche pluripotente Stammzellen als Ausgangsmaterial für Differenzierungen zu verwenden.Wenn Sie bereit sind, die embryoide Körperbildung zu induzieren, wärmen Sie alle benötigten Materialien und Reagenzien auf Raumtemperatur in einer laminaren Strömungshaube. Lösen Sie den Feeder freie menschliche pluripotente Stammzellen auf die Suspension, indem Sie 500 Mikroliter xeno freies Trypsin EDTA zu jedem Brunnen hinzufügen. Eine Inkubat

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Aus Stammzellen gewonnene retinale Pigmentepithelzellen (RPE) können für mehrere Anwendungen verwendet werden, einschließlich zellbasierter Therapien für Netzhautdegeneration, Krankheitsmodellierung und Medikamentenstudien. Hier stellen wir ein einfaches Protokoll zur reproduzierbaren Gewinnung von RPE aus Stammzellen vor.

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

Ein Beispiel für eine adenovirale Gentherapie bei menschlichen diabetischen Organkulturen wird vorgestellt, um die verzögerte Wundheilung und die deutlich reduzierte Expression von epithelialen Stammzellmarkern in diesen Hornhäuten zu normalisieren. Es wird auch die Optimierung dieses Prozesses in stammzellangereicherten limbalen Epithelkulturen beschrieben.

Adenoviralen Gentherapie für diabetische Keratopathie: Auswirkungen auf die Wundheilung und Zellmarker Expression in Human Organ kultivierten Hornhäute und Limbale Epithelial Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die retinalen Pigment Epithelzellen (RPE) aus pluripotenten Stammzellen zu produzieren. Die Methode verwendet eine Kombination von Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle, um die Differenzierung von Stammzellen in unreifen RPE in vierzehn Tagen und Reifen, funktionale RPE nach drei Monaten zu lenken.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine monolayer, serumfreie Methode zur effizienten Erzeugung von Hepatozyten-ähnlichen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in 18 Tagen. Dies beinhaltet sechs Schritte, da hPSCs sequenziell in zwischengeschaltete Zelltypen wie den Primitivstreifen, das definitive Endoderm, das hintere Vorgut und die Leberknospenvorläufer differenzieren, bevor hepatozytenähnliche Zellen gebildet werden.

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Mit einer selbstorganisierenden Methode entwickeln wir ein Protokoll mit dem Zusatz von COCO, das die Bildung von Photorezeptoren signifikant erhöhen könnte.

Gerichtete Induktion retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen

Hier wird ein einfaches Protokoll für die gezielte Differenzierung von hämogenen Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen in ca. 1 Woche vorgestellt.

Gerichtete Differenzierung hämogener Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Hier beschreiben wir ein optimiertes retinale Organoid-Induktionssystem, das für verschiedene humane pluripotente Stammzelllinien geeignet ist, netzhautähnliche Gewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz zu erzeugen.

Retinale Organoid-Induktionssystem zur Ableitung von 3D-Netzhautgewebe aus humanen pluripotenten Stammzellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Identifizierung der menschlichen Limbus-Nischenzellen vor.

Isolierung und Identifizierung von Limbus-Nischenzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Gewinnung hochwertiger Einzelzell-Suspensionen aus ganzen Maushornhäuten durch sequentielle Verdauung mit Kollagenase A und Trypsin. Diese Methode liefert lebensfähige Einzelzellen mit hoher RNA-Integrität, wodurch sie mit nachgelagerten Anwendungen wie der Einzelzell-RNA-Sequenzierung und FlowzytometrieY kompatibel sind.

Ein Protokoll zur Entnahme von Einzelzell-Suspension aus Maushornhäuten

Erfahren Sie die differenzierte Herstellung von Hornhaut-Limbus-Epithel-Stammzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen ohne Feederzellen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Produktion klinisch verwendbarer Zellen für regenerative Therapien.

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

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